暗视野显微镜

一、目的要求

1．了解暗视野显微镜的基本原理及用途。

2．学习并掌握使用暗视野显微镜观察微生物样品的基本技术。

二、基本原理

暗视野显微镜的构造主要是采用一种特殊的聚光器，在聚光器的下方中央为圆形黑盘所遮，光仅由周缘进入，使光会聚于载玻片上，并斜照物体，物体经斜射照明后，发出反射光可进入物镜，这样，造成显微镜视野黑暗，而其中的物体明亮。如无暗视野显微镜时，只需将明视野显微镜上的聚光器取下，换上暗视野聚光器即可；也可在明视野显微镜聚光镜头上附一中央遮光板(黑色的X光片包装纸，用剪刀剪成直径小于聚光镜直径大约0.8-1cm，用少许镜油轻轻粘附于聚光镜头上，使光源的光线能从周围透过即可应用)。

三、器材

暗视野显微镜，载玻片，盖玻片，无菌生理盐水。

四、操作步骤

1．选厚薄在1．0—1．2mm的干净载玻片一块，按常规方法取标本制成等渗盐水涂片，加盖玻片（注意切勿有气泡存在）。

2．安装暗视野聚光器或中央遮光板，将聚光镜光圈调至1．4。

3．光源的光圈孔调至最大。

4．在聚光器上放一滴香柏油，将标本置载物台上，旋上聚光器使油与载玻片接触（不能有气泡发生）。

5．进行聚光器光轴调节与调焦。水平移动聚光器，使聚光器光轴与显微镜光轴位于一条直线上。调节聚光器的高度，首先在载玻片上出现一个中间有一黑点的光圈，最后为一光亮的光点，光点愈小愈好，由此点将聚光器上下移动时均使光点增大。

6．换上所需目镜和高倍镜，缓慢上升物镜进行调焦，至视野中心出现发光的样品。

7．按普通显微镜方法操作仔细观察玻片。

五、光学显微镜的保养

1. 严格按照有关操作规则使用显微镜，避免因使用不当造成损毁。

2. 显微镜

在储存和使用过程中，普遍存在着生霉起雾问题，霉和雾会使显微镜的视场模糊，

分辩率下降。为了使显微镜保持良好的工作状态，延长使用寿命，显微镜的工作环境应保持清洁、干燥、防尘。 3. 显微镜在每次使用完毕后应及时做好清洁工作，特别是目镜、物镜等容易污染的光学部件，如发现表现表面有灰尘、指纹、脏物等，应及时用镜头纸清洁干净。 4. 显微镜工作室最好能安装空调、抽湿及防尘装置。 5. 如发现光学部件内部有生霉等现象，最好及时联系有关厂家派人清洁、维修。

六、注意事项

1．进行暗视野观察时，聚光镜与载玻片之间滴加的香柏油要充满，否则照明光线于聚光镜上面进行全面反射，达不到被检物体，从而不能得到暗视野照明。

2．在进行暗视野观察标本前，一定要进行聚光镜的中心调节和调焦，使焦点与被检物体一致。

3．由于暗视野聚光镜的数值孔径都较大（ NA=1．2—1．4），焦点较浅，因此，过厚被检物体无法调在聚光镜焦点处，一般载玻片厚度为1．0mm左右，盖玻片厚度宜在0．16mm以下，同时载玻片、盖玻片应很清洁，无油脂及划痕，否则都会严重地扰乱最终的像。