基因克隆及常见问题分析 (1)
克隆常见问题指南
克隆常见问题汇总指南评价连接反应效率评价连接酶活性连接成功转化问题连接不成功连接酶失活连接酶有活性DNA 质量差DNA 末端不兼容克隆用内内切酶错误载体和插入片段均未磷酸化PCR 产物酶切不充分平末端化不充分酶污染载体自身环化载体酶切不完全非特异PCR产物被克隆酶污染抗生素浓度过低卫星克隆PCR 引物序列错误UV 损伤DNA 片段PCR 扩增保真性低详细叙述转化0.1ng的超螺旋载体DNA检测感受态细胞的转化效率。
通常情况下，感受态细胞转化产量至少为1x106转化子/ug超螺旋DNA，相当于0.1ng质粒DNA转化可能产生100个克隆。
1.1.2、T4DNA连接酶降低转化效率转化之前，用氯仿萃取或离心柱纯化使T4DNA连接酶失活。
1.1.3、连接酶没有热失活热失活连接酶可增加转化子产量。
1.1.4、转化时连接混合物过量每50ul感受态细胞最多可转化5ul连接混合物。
1.1.5、大肠杆菌无法忍受克隆的序列检查目标序列是否含有大肠杆菌强启动子或其他可能的毒性元件和反向重复等。
如果克隆基因表达产物对宿主有毒，需选择极低表达背景的启动子和使用低拷贝克隆载体。
1.1.6连接反应的连接酶过量根据载体和外源片段的浓度，选择说明书推荐用量的连接酶。
确保DNA无污染（如过量盐、EDTA、蛋白、酚等），否则会抑制连接效率。
连接前建议凝胶纯化载体和插入片段。
1.2.2、凝胶切割回收时，DNA被UV光损害凝胶切割回收DNA时请选用长波长的(UV360nm)切胶仪。
如果使用短波长的(254-312nm)切胶仪，需要缩短DNA在UV光下的曝光时间（几秒钟）。
UV光照射时，需将凝胶置于玻璃或塑料平板上。
此外，选择可见光染料可在普通光下观察标准琼脂糖凝胶中的DNA。
采用琼脂糖凝胶电泳检测载体的切割效率。
如果载体很难完全切割，可用胶回收试剂盒从凝胶中回收线性化的载体片段。
如果PCR反应有非特异性PCR产物或引物二聚体产生，需凝胶纯化目标PCR产物。
克隆点突变系列常见问题及解决方法
克隆点突变系列常见问题及解决方法一、克隆1)、平板上长不出克隆或克隆数目很少a)、感受态效率低：使用新制备或妥善冻存的感受态细胞，确保转化效率>107 cfu/μg。
每次可设置一组转化质粒的对照实验，以检测感受态细胞的转化效率。
b)、线性化克隆载体和插入片段扩增产物的使用量不足/过量，或者比例不佳：请务必预先检测线性化克隆载体和插入片段PCR产物的浓度。
常用的吸光度测量法极易受DNA纯度、DNA稀释液pH等因素影响，测定值和DNA实际浓度往往偏差非常大。
因此，我们强烈推荐您通过琼脂糖电泳来测定样品中的DNA浓度。
c)、载体和插入片段不纯，抑制反应：未纯化DNA加入重组反应体系内的总体积不应超过4 μl (反应体系体积1/5)。
尝试对线性化载体、PCR产物进行胶回收纯化。
d)、感受态细胞中加入了过多的反应产物：反应产物的转化体积不应超过感受态细胞体积的1/10，否则会降低转化效率。
e)、当载体和片段的均大于10K时，克隆效率下降，属正常情况。
f)、少数情况：插入基因本身含细胞毒性，即便有正确克隆也因为克隆细胞无法生长导致试验失败。
2)、多数克隆不含插入片段(假阳性)a)、克隆载体线性化不完全：即使是痕量未完全酶切的载体也会产生很高的转化背景。
提高限制性内切酶使用量、延长酶切反应时间、胶回收纯化酶切产物，都可以有效减少甚至消除环状质粒残留。
b)、反应体系中混入了相同抗性的质粒：PCR扩增模板(扩增克隆载体或者扩增插入片段)为环状质粒。
当扩增产物直接用于重组反应时，残留环状质粒模板会产生较高的转化背景。
尽量使用预线性化质粒作为扩增模板、扩增产物进行DpnI 消化、扩增产物进行胶回收纯化，都可以有效减少甚至消除环状模板质粒残留。
3)、克隆含有不正确的插入片段a)、PCR产物混有非特异扩增产物：优化PCR体系，提高特异性；胶回收PCR产物；鉴定更多的克隆。
b)、载体线性化不完全：如果线性化载体不是由空载体酶切或扩增制备，而是由已插入其他不同片段的载体酶切或扩增制备而成，不完全酶切或残留环状模板质粒将导致很高的转化背景，使部分克隆中含有不正确的插入片段。
克隆筛选技术的使用中常见问题
克隆筛选技术的使用中常见问题克隆筛选技术是分子生物学领域中常用的实验技术之一，它可以帮助研究人员选择特定DNA片段并扩增出来。
然而，在使用克隆筛选技术的过程中，常常会遇到一些问题和挑战。
本文将讨论一些克隆筛选技术的常见问题，并提供相应的解决方法。
一、低转化效率克隆筛选技术中，低转化效率是常见的问题之一。
转化是指将外源DNA引入到宿主细胞中的过程，而低转化效率会降低筛选到感兴趣的克隆的机会。
解决方法：1. 优化DNA质量：使用高质量、无降解、无重组和合成错误的DNA样品。
可以通过限制酶切、纯化和鉴定DNA来确保DNA质量。
2. 优化化学转化：调整化学转化的条件，如细胞密度、含钙离子浓度、转化时间和温度等。
同时，合理选择适用的化学转化试剂，如CaCl2 或PEG方法。
3. 使用电转化：电转化可以提高转化效率。
调整电转化的条件和参数，如电压、电容、脉冲数和电极间距等。
二、错误克隆的选择在克隆筛选的过程中，有时会选择错误的克隆。
这可能是因为使用的筛选方法不够精确或特异，或者因为实验操作中的一些技术问题导致克隆选择的错误。
解决方法：1. 优化筛选方法：选择合适的筛选方法，如DNA序列比对、限制酶切分析、PCR检测等。
结合不同的筛选方法，可以提高克隆的选择精度。
2. 设计合理的筛选引物：设计筛选引物时，应确保其特异性和灵敏度。
可以利用特异性引物来筛选特定片段，提高筛选的准确性。
3. 重复实验：进行多次重复实验，并剔除出现重复错误的情况。
通过重复实验可以排除实验误差和技术问题，提高克隆的选择准确性。
三、背景杂交背景杂交是克隆筛选过程中常见的问题，它会导致背景杂交信号过多，干扰到感兴趣的克隆的筛选。
解决方法：1. 设计合适的防背景杂交措施：在实验中采取一些预防措施，如增加DNA浓度、优化杂交温度和时间、添加DNA相互竞争物等，可以减少背景杂交的发生。
2. 使用高质量探针：合理选择和设计探针，确保其特异性和灵敏度。
分子克隆实验技术的使用中常见问题
分子克隆实验技术的使用中常见问题分子克隆技术是一种常用的实验技术，被广泛应用于分子生物学研究、基因工程以及生物医学等领域。
然而，在使用分子克隆技术进行研究或实验的过程中，常常会遇到一些问题。
本文将就分子克隆实验技术的使用中常见问题进行探讨，希望能帮助读者更好地应对这些挑战。
问题一：选择合适的克隆载体在进行分子克隆实验之前，选择合适的克隆载体是非常重要的一步。
克隆载体通常是一种容易携带外源DNA片段的可重复扩增的质粒或噬菌体。
然而，在选择合适的克隆载体时，需要考虑多个因素：1. 大小：载体的大小要适中，不宜过大或过小。
过大的载体可能导致操作不便、扩增困难，而过小的载体则可能限制载入的外源DNA片段的大小。
2. 复制起源：克隆载体应该具有一个可靠的复制起源，这样才能确保在细胞中稳定复制。
3. 选择标记：载体通常会带有一些标记基因，例如抗生素抗性基因。
在使用克隆载体进行实验时，选择合适的标记基因很重要。
问题二：限制性内切酶消化反应优化限制性内切酶消化是分子克隆实验中的重要步骤，用于切割DNA，生成所需的片段，并为之后的操作提供合适的DNA末端。
在进行限制性内切酶消化反应时，常见问题包括：1. 酶切位点不兼容：选择合适的限制性内切酶对于成功完成限制酶切非常重要。
如果酶切位点与目标DNA不兼容，将无法成功进行酶切。
2. 消化条件优化：酶切反应的条件包括酶切酶的浓度、反应温度、反应时间等。
为了获得理想的酶切效果，有时需要进行反应条件的优化。
3. 反切和星切现象：反切是指限制性内切酶在不应该切割的位点上产生切割作用，而星切是指一个酶切酶在DNA样品中的多个不同位点发生非特异性切割。
这些现象可能影响目标DNA片段的纯化和选择。
问题三：插入片段的PCR扩增在分子克隆实验中，为了获得目标DNA片段，常常需要进行PCR扩增。
然而，PCR扩增过程中可能会遇到以下问题：1. 扩增特异性：选择合适的引物是 PCR 扩增的基础。
DNA片段的克隆及常见的问题
北京天为时代科技有限公司
内
容
第一部分：DNA 片段的克隆 第二部分：常见问题及解答
DNA 克隆的目的
目的基因的序列测定及筛选 入门的载体用于基因表达
连接克隆分类（以PCR产物克隆为例）
TA克隆
是目前广泛使用的一种借用中间载体的非定向克隆方法。由于 普通Taq酶扩增得到的PCR产物带有A末端，可以用带有T末端突 出的T载体直接连接。这个方法比较简便，不需要经过双酶切， 对引物设计也没有要求。
酶切连接克隆
PCR引物设计时引入载体上的酶切位点，PCR产物经双酶切 后定向克隆到目的载体上。这种方法的优点是定向连接克 隆，筛选方便。缺点则是PCR产物的酶切和判断比较困难， 另外酶切连接过程本身也相当的费时费力。
TA克隆的流程
I.高纯度的基因资源 II.杂交筛选或PCR扩增目的基因
III.目的基因的纯化 IV.目的基因与T载体的连接、转化 V.目的基因的筛选及鉴定
1.
2.
3.
4.
5.
6.
对 策
6. 7. 8.
7.
8.
常见问题分析
问题三：实验组只有白色菌落（没有蓝色菌落）
原因
1. 2. 3.
未加IPTG/X-Gal或 其失效 抗生素失活，敏感 菌亦能生长 用于制备感受态的 菌株退化，丢失了 某些重要因子
1.
对 策
2. 3.
检查平板是否含有 IPTG/X-Gal 以及是否 新鲜,如平板有问题， 重新制备新鲜平板 复查抗生素的抗性 用于制备感受态的菌 株，传代次数不能太 多（20代以内为佳）
DNA克隆的操作
转化 连接液的体积 复苏 涂布 (IPTG 及 X-gal ) 培养的温度及时间
基因操作原重难点总结
基因操作原理重难点总结1. 基因克隆的宏观策略：答：⑴已知序列同源性的基因的克隆(PCR方法克隆目标基因)：根据已知基因序列信息设计引物，以基因组DNA为模板，扩增出目标基因；⑵定位在质粒上的基因克隆：利用识别六碱基的限制性内切酶酶解质粒DNA，电泳分离，然后用特异探针进行杂交，确定基因片段进行克隆；⑶定位在染色体组上的基因克隆：①杂交方法：ⅰ.用识别四个碱基的限制性内切酶对染色体DNA进行部分酶切，建立基因文库。
再用标记特异探针进行探测，确定目标基因片断，再进行克隆。
ⅱ.利用亚基因文库进行克隆先进行分子杂交，确定基因片断范围，再进行克隆筛选。
②免疫抗体法：利用鸟枪法和表达载体建立基因表达文库；利用目标蛋白质制备抗体，对基因表达文库进行筛选，可直接获得完整的基因。
③利用简并引物的PCR方法：对目标基因的蛋白质进行N-端氨基酸残基分析。
根据氨基酸序列反推目标基因设计简并引物，以基因组DNA 为模板进行PCR扩增，获得目标基因。
④转座子插入失活克隆法：用转座子对目标生物进行突变，筛选突变株，抽提突变株基因组DNA，利用转座子序列信息设计特异探针，进行TAIL-PCR双向扩增，从而获得完整基因。
⑤质粒拯救法：利用带有复制起始位点的转座子进行诱变获得突变株，分离总DNA，酶解、连接、转化和测序。
⑥功能克隆法(基因表达产物应有明显的表型效应)：利用目标基因表达产物的表型效应，从基因文库中筛选目标基因。
⑦通过双杂交系统克隆新基因：通过靶标蛋白利用双杂交系统克隆与该靶标蛋白作用的蛋白质基因。
⑧通过蛋白质组学技术克隆基因：通过肽片断序列获得蛋白质信息，从而在基因组中找到基因位置和序列，根据序列设计引物，扩增克隆该基因。
2. 设计从某一生物中克隆某一基因的技术路线：答：原核生物：从样品中抽提总DNA，部分酶切，构建合适载体——将目标DNA片段与载体连接——转入宿主细胞培养——可以根据该目标基因所表现出的特定表型筛选，或是利用核酸探针杂交法、抗体免疫法和差异杂交法筛选。
基因克隆 操作步骤原理及注意事项
一：提质粒1：提取ml的菌液放到EP管中，12000r/s 30s离心，去除菌液，加入100微升的TE 振荡混匀后加入200微升裂解液二，轻轻混匀，是使细胞破碎，同时使蛋白变性和保持其高碱性，再加入150裂解液三轻轻混匀是鞋包裂解开（最佳的效果是上层是蛋白，下层是透明的液体），离心10min，将液体转移到另一个EP管中，加入等体积的异丙醇，静置10min或更长（一般以析出的DNA为主蛋白次之），离心10min 12000rpm/s ，除去上清液，加入400微升的70%的乙醇洗（去除里面的有机溶剂，同时使DNA 沉淀），去除乙醇，室温下开口放置5-10min或放到烘箱中使乙醇挥发干，再加入20微升的水，跑胶看浓度溶液I：Tris-Cl控制PH；葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉，抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。
溶液II：NaOH裂解细胞的作用；SDS主要是变性蛋白，也有溶解细胞的作用。
溶液III：3 M 醋酸钾钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。
SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，同时大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了；2 M 醋酸中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和之。
25/50酚+24/50氯仿+1/50异戊醇的作用：酚抽提蛋白的作用；氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；异戊醇的添加，其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收。
乙醇---100%沉淀质粒的作用；70%洗质粒去离子的作用；RNase水：消化所提质粒中的RNA。
2：消化补到50微升体系，再加入5微升的RNase 放入37℃ 2-3个小时3：抽提加入150微升的TE补到200微升体系加入100微升的氯仿 100微升的苯酚充分混匀 12000rpm/s 10min 离心将上层液体转到新EP管中再像其中加入200微升的氯仿充分混匀，12000rpm/s 离心，取上层液体到新EP管中，加入1/4体积的5mol/L的NaCl 两倍体积的无水乙醇，放入-20℃ 3小时沉降后离心 12000rpm/s 10min ，70%的乙醇洗干，再晾干或烘干加20微升的水跑胶检测补充：酚氯仿法提取DNA的原理用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。
基因克隆及常见问题分析 (1)
DNA克隆常见问题之四
阳性克隆率低
原因
1. 2. 3. 4.
1. 2.
PCR产物不纯，非目的条带 亦被克隆 PCR部分产物发生A尾丢失 PCR所用酶不在产物3’端加 A或只是部分加A 片段与载体比例不适
对 策
3.
4.
重新纯化PCR产物 PCR扩增后，尽量少放置，直 接进行后续的回收连接，以防 A尾丢失 除Taq酶外，使用其它酶扩增 的产物在用于TA克隆时都建议 先加A, 再连接 调整片段与载体的比例，控制 在1:3-1:8之间
检查平板是否含IPTG/X-Gal 以及平板是否新鲜制备 复查抗生素的抗性 用于制备感受态的菌株，传 代次数不能太多（20代以内
未加IPTG/X-Gal或其失效 抗生素失活，敏感菌亦能
生长
3.
用于制备感受态的菌株退 化，丢失了某些重要
对 策
2. 3.
为佳）
因子
800免费电话：800-990-6057
4）转有700bp片段的感受态细胞＋抗性平板
5）转有目的片段的感受态细胞＋抗性平板
检查载体效果
800免费电话：800-990-6057
重组子的鉴定方法
准确度高， 一般作为最终鉴定手段
抗性基因
苄青霉素、卡那霉素、 lacZ基因（蓝白斑筛选）
测序
重组子 鉴定
PCR
单酶切/双酶切，鉴定目的 基因连入方向及片段长度
共10分钟
800免费电话：800-990-6057
载体与片段的最佳比例
载体与插入片段最佳摩尔比1:3-1:8
插入片段的量 ＝ （ng）
加入载体的量 （ng）
×
插入DNA片段 长度（kb）
克隆常见问题分析
克隆常见问题分析
（1）克隆效率低
影响克隆效率有许多因素，如扩增目的基因所用引物，基因的结构，插入片段和载体的比例等。
如发现克隆效率低，尝试用下列方法提高克隆效率。
∙纯化PCR 产物。
∙如插入片段的浓度太低，增加插入片段的量。
∙用新鲜的PCR产物，不要冷冻PCR 产物。
由于3’-A 热力学不稳定,产物应放置在4℃，并在1～2天内完成克隆反应。
∙使用能产生3’末端“A”的DNA聚合酶（例如 Taq DNA 聚合酶）。
∙重新设计引物，5’端包含“G”或“C”，以提高PCR 产物3’末端“A”的效率。
（2） PCR 鉴定重组子失败
当用PCR 方法鉴定重组子，没有得到目的扩增产物，又没有载体自连，说明PCR反应失败。
重新优化PCR 反应条件或提取质粒，以质粒作模板扩增或酶切鉴定包含重组子的克隆。
（3）重组克隆呈现淡蓝色或“fish eye”
这是由于插入片段没有影响lacZ 基因读码框，或插入片段太小，这种情况下菌落呈现淡蓝色。
科学家在基因克隆研究中所面临的困难与挑战
科学家在基因克隆研究中所面临的困难与挑
战
基因克隆研究在科学界一直备受关注，并引起了公众广泛的关注。
从最初的克隆羊“多利”，到现在的大规模基因编辑及克隆技术的发展，科学界在这个领域获得了很多可喜的进展。
然而，在这个科学领域中，科学家们所面临的困难与挑战是不容忽视的。
首先，基因克隆研究的复杂性导致了实验的高昂成本及较低的成功率。
尤其是在大规模基因编辑及克隆技术中，一个小小的错误都可能导致失败。
比如说，在目前的基因编辑技术中，科学家们需要精确地设计指向性核酸分子，才能实现准确的碱基替换或修复。
不仅如此，这些分子必须经过严格的筛选及检测，以确保它们在体内的作用正常。
另外，基因克隆研究涉及到许多伦理问题。
虽然现在科学家们已经可以通过基因编辑技术，删除或加入人类基因，以达到治疗遗传疾病的目的。
但是，一旦将该技术滥用，就很有可能导致社会的伦理价值观扭曲及基因歧视等问题。
比如说，如果某些人利用这个技术改变自己或自己子孙的基因，将来可能会造成社会的不平等及种族歧视等问题。
此外，基因克隆研究在实践中还面临着不可预见的风险。
一旦基因编辑出现失误，可能导致不可挽回的后果，比如说导致某些基因的突变，从而引起遗传疾病。
此外，在基因编辑过程中，也有可能造成其他人类疾病及健康问题的意外发生。
因此，科学家在基因克隆研究中所面临的困难与挑战是多方面的。
这不仅需要科技的进步，更需要人类保持一种科学、理性的态度，同时也需要科学家们对自己的责任有着更加深刻的认识。
不可否认的是，基因克隆研究的前景是值得期待的，但是，我们也应该保持一种警惕的态度，避免技术滥用及可能出现的其他问题。
如何解决组织克隆中的基因编辑问题
如何解决组织克隆中的基因编辑问题随着科学技术的迅速发展，基因编辑已成为生物领域中的热门研究课题之一。
组织克隆作为目前基因编辑技术的重要应用之一，在医学和农业领域中取得了许多突破。
然而，基因编辑过程中存在一些问题需要解决，特别是在组织克隆中。
本文将探讨这些问题，并提出解决方案。
组织克隆是通过将目标基因导入受体细胞，再通过合适的培养基和环境条件，使其分化为完整的组织或个体。
然而，基因编辑过程中可能出现的问题，如基因编辑效率低、基因编辑不准确等，一直是制约组织克隆发展的主要因素之一。
在解决这些问题之前，我们首先要理解其根本原因。
基因编辑的低效率通常是由于编辑载体的不稳定性或繁殖机制的限制。
此外，编辑载体在受体细胞中的稳定性和目标基因的引导效果也会对编辑效率产生影响。
另一个问题是基因编辑的不准确性。
尽管编辑工具如CRISPR-Cas9已大大提高了基因编辑的准确性，但仍存在因为错误的靶向、非特异性剪切等问题而导致的基因组不稳定性和突变。
解决组织克隆中的基因编辑问题的应对策略需要综合考虑编辑载体的设计、基因编辑技术和培养条件。
首先，针对基因编辑效率低的问题，我们应考虑优化编辑载体的设计和优化编辑工具的选择。
编辑载体的设计应考虑到载体的稳定性、导入基因的大小、转导效率等因素。
此外，新一代编辑工具如Prime Editing、Base Editing等的应用也能提高编辑效率和准确性。
因此，在组织克隆中采用这些先进的编辑工具，有望解决基因编辑效率低的问题。
其次，基因编辑的不准确性是另一个需要解决的关键问题。
在编辑载体的设计上，应选择能够确保特异性靶向、减少非特异性剪切的技术。
此外，在编辑工具的选择方面，我们可以考虑使用双链RNA或修饰的Cas9以提高编辑的精确性。
同时，加强对基因编辑过程中突变和基因组不稳定性的监测和筛选也是必要的。
最后，为了优化组织克隆的培养条件，我们需要对培养基的成分和环境因素进行调整。
培养基的成分应提供充足的营养物质和适当的生长因子，以促进细胞增殖和正常分化。
基因工程技术中常见问题的解答与案例分析
基因工程技术中常见问题的解答与案例分析基因工程技术是一种在生物学领域中使用基因技术来改变生物体的遗传信息的方法。
它已经在医学、农业和工业等领域取得了重要的突破和应用。
然而，随着基因工程技术的广泛应用，也出现了一些常见的问题和争议。
本文将回答一些基因工程技术中常见的问题，并通过案例分析来说明。
1. 人工合成基因是否安全？人工合成基因是通过合成DNA序列来创建新的基因，用于改变生物体的性状。
但一些人担心这可能产生不可预测的风险。
事实上，人工合成的基因需要经过严格的筛选和测试，确保其安全性和有效性。
例如，利用基因工程技术开发的新药物需要经过临床试验，以确保其安全性和有效性。
此外，相关的监管机构也会对人工合成的基因进行审查和监督。
因此，人工合成基因在科学和法律层面上都有一套严格的安全措施。
案例分析：1990年代，美国农业部批准了一种转基因玉米。
该转基因玉米中添加了一种基因，使其对一种农药具有耐受性。
在该品种上市之前，经过了大量的实验和临床试验，以确保其安全性。
多年来，这种转基因玉米已经广泛种植，并被证明对环境和人体健康没有负面影响。
2. 转基因食品对人体健康的影响如何？转基因食品是指经过基因工程技术改造过的食品。
许多人对转基因食品的安全性产生了担忧。
然而，大量的科学研究表明，转基因食品与传统食品相比，在食品安全方面没有显著差异。
案例分析：1996年，一种转基因番茄上市销售。
这种转基因番茄通过基因工程技术增加了一种天然存在的营养素，提高了其营养价值。
经过严格的评估和测试，该转基因番茄被认为与传统番茄一样安全，对人体健康没有负面影响。
3. 转基因作物对环境的影响如何？转基因作物种植对环境可能产生一些影响。
然而，大多数研究表明，转基因作物与传统作物相比，在环境方面并没有明显不同。
案例分析：一项对转基因棉花的研究发现，转基因棉花能够减少农药使用量、提高收成、对土壤中的益生菌无害，并提供了经济利益。
此外，转基因作物的耐旱性和抗病性等特性也有助于减少对化学农药和水资源的使用，从而减少了对环境的负面影响。
克隆技术存在的问题
克隆技术存在的问题
当前，克隆技术在医学、生物科技、农业等多个领域得到了广泛应用，但也带来了一些问题。
这些问题中，既有伦理上的道德问题，也有安全性的隐患。
一、伦理上的问题
1.1 生命的尊严
克隆技术将人类生命从根本上割裂了，也让人类对生命的尊重变得模糊，随意处理生命。
同时，克隆技术还会对生命体的自我意识、人格方面产生不可预知的影响。
1.2 基因修饰
克隆技术中涉及到基因修饰，这种修饰不仅会直接影响生物个体的健康状况，更会对后代的基因或行为式样产生负面影响。
二、安全性的问题
2.1 基因变异
该技术从根本上可以改变生命体的基因组成，对具体基因进行修改。
长期以来，我们对基因组具有基本信任，但克隆技术给基因组的安全性带来了潜在的风险。
2.2 社会伦理问题
通过克隆技术，设计出完美的人类会是一种社会趋势，但同时也会对社会制造不公平的竞争和矛盾，使得伦理基础被忽略，个别公民的权利受到侵害。
在人们对这些问题不断地关注之际，克隆技术的实现已经成为了国际社会共同探讨和研究的议题。
针对这个问题，社会需要通过合法的渠道来合理的约束和监管克隆技术的发展，同时也需要推广生物安全和生物伦理学的教育，让社会更为深入地认识到该技术在道德、社会和环境问题方面给人类带来的富有责任感的挑战。
总的来说，克隆技术的出现确实为人类带来了巨大的创新，为未来的发展埋下了重要基础。
但同时也需要认清该技术所涵盖的风险和
不确定性，及时进行监管和控制，实现科技与伦理的平衡。
只有这样，克隆技术才能在推动人类生产和生活的同时，真正地为人类的健康和
幸福服务。
基因工程技术的实验问题解答与解决思路
基因工程技术的实验问题解答与解决思路基因工程技术广泛应用于生物学研究、医学治疗和农业生产等领域，但在实验过程中常常面临一系列问题。
本文将针对基因工程实验中常见问题进行解答，并提供解决思路，以帮助科研人员更好地开展实验。
1. 如何选择适合的载体？载体在基因工程实验中承载与转导目标基因的重要作用。
选择合适的载体需要考虑载体的大小、拷贝数和稳定性等因素。
常用的载体包括质粒和病毒。
选择质粒载体时，可以考虑载体的拷贝数较高、易提取和方便操作等优点；选择病毒载体时，可以考虑其高效率的转导能力。
根据实验需求，综合考虑以上因素，选择适合的载体。
2. 如何确保基因插入的准确性？在基因工程实验中，准确地插入目标基因是关键。
常用的方法包括限制性内切酶切割、PCR扩增和基因克隆等。
限制性内切酶切割通过特异酶切割目标DNA和载体DNA，然后将其黏合，使目标基因被准确地插入载体。
PCR扩增可以通过合成引物和反应条件的控制，将目标基因准确扩增。
基因克隆技术则通过DNA重组酶和适当调节操作条件，将目标基因高效地插入载体。
在实验中需严格控制反应条件，检验插入产物是否准确。
3. 如何解决基因表达低的问题？基因表达低是常见的实验问题。
可以采取以下措施提高基因表达水平：优化启动子和转录起始位点的选择以增强转录效率；调整培养条件，如调节温度和培养基成分等，以影响蛋白质合成速率；引入增强子或增强子序列，以增加基因的表达水平；使用合适的宿主系统，如大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞等，根据不同基因的特性选择合适的宿主。
4. 如何解决基因编辑中的误操作？基因编辑是一项复杂的技术，误操作常常会导致实验失败或产生不准确的结果。
为了避免误操作，首先应详细阅读实验操作手册，了解每个步骤的详细操作要求，并明确实验目标。
另外，严格控制实验条件和实验步骤，如温度、时间和试剂使用等。
在实验过程中，可以进行实时监测和验证，确保操作的准确性。
同时，实验操作前应进行充分的练习和训练，提高操作的熟练度，减少误操作的可能性。
基因克隆过程出现单碱基突变的原因
基因克隆过程出现单碱基突变的原因下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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基因工程中的克隆不稳定问题
基因工程中的克隆不稳定问题基因工程是一项极具革命性的科学领域，它涉及到对生物体内的基因进行修改、调整和改变，以达到改善或增强特定特征的目的。
克隆是基因工程中常用的一种技术手段，它可以用来复制和扩增特定基因片段或整个基因组。
然而，克隆技术在实践中也存在一些问题，其中一个重要问题就是克隆不稳定性。
克隆不稳定性是指在克隆过程中，复制的基因片段或基因组可能发生变异或丧失，导致克隆体表现出不同的性状或功能。
这个问题在基因工程中尤为重要，因为基因工程的目的经常是为了增强或改变特定的性状或功能。
克隆不稳定性的原因可以是多方面的。
首先，基因工程中常用的DNA重组技术（如PCR、DNA连接酶等）本身就具有一定的误差率。
在重组过程中，会存在一定概率的碱基插入、缺失或替换，从而导致克隆片段的不准确复制。
其次，克隆过程中的细胞分裂和复制也可能引起基因组的变异。
细胞分裂是复制和传递基因信息的基本过程，但在细胞分裂过程中，可能发生复制错误或基因组结构重排，导致克隆体的基因组变异。
此外，克隆过程中的培养条件、病毒感染等环境因素也可能对基因组稳定性产生影响。
最后，克隆不稳定性还可能受到物种特性的影响。
不同物种的基因组结构和复制机制不同，因此在基因工程中对不同物种的克隆可能会面临不同程度的稳定性问题。
一些物种可能在克隆过程中更容易产生变异，而另一些物种则可能更稳定。
面对克隆不稳定性的问题，科学家们正在努力寻找解决方案。
一种策略是通过优化克隆技术来减少误差率和变异率。
例如，使用高保真度的DNA聚合酶进行PCR扩增，可以减少碱基插入和缺失的概率。
此外，设计更稳定的克隆载体和选择合适的克隆宿主细胞也可以改善克隆体的稳定性。
另一种策略是利用基因组编辑技术来修复克隆体中的变异或丧失的基因。
CRISPR-Cas9系统是目前应用最广泛的基因组编辑工具之一，它可以精确地修复基因组中的缺失或替换，从而提高克隆体的稳定性。
此外，对克隆体进行筛选和鉴定也是提高克隆稳定性的重要手段。
克隆基因的步骤及其注意事项
克隆基因的步骤姓名：王静马红梅施翔骞武洋梁丹罗星（指导老师）克隆基因的步骤摘要：基因是遗传物质的最基本单位，也是所有生命活动的基础，不论是揭示某个基因的功能还是要改变某个基因的功能，都必须将所要研究的基因克隆出来。
本文将试验中的体会以及查阅文献后获得的知识做一汇总，简述克隆基因中的步骤以及在操作中应该注意到的一些问题。
关键词：基因克隆；质粒；重组基因克隆可概括为∶分、切、连、转、选。
"分"是指分离制备合格的待操作的DNA，包括作为运载体的DNA和欲克隆的目的DNA；"切"是指用序列特异的限制性内切酶切开载体DNA，或者切出目的基因；"连"是指用DNA连接酶将目的DNA同载体DNA连接起来，形成重组的DNA分子；"转"是指通过特殊的方法将重组的DNA 分子送入宿主细胞中进行复制和扩增；"选"则是从宿主群体中挑选出携带有重组DNA分子的个体。
DNA克隆的第一步是获得包含目的基因在内的一群DNA分子，常用的方法有机械切割和核酸限制性内切酶消化。
如果基因的两端部分序列已知，根据已知序列设计引物，从基因组DNA 或cDNA 中通过PCR技术可以获得目的基因。
该试验为设计引物来获得目的基因。
接下来选择载体，本次试验采用的是质粒载体，利用质粒进行载体构建。
载体构建的原理为：依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。
体外重组则可完成上述过程。
体外重组即体外将目的片断和载体分子连接的过程。
大多数核酸限制性内切酶能够切割DNA分子形成有粘性末端，用同一种酶或同尾酶切割适当载体的多克隆位点便可获得相同的粘性末端，粘性末端彼此退火，通过T4 DNA连接酶的作用便可形成重组体，此为粘末端连接。
DNA片段的克隆及常见的问题ppt课件
常用感受态细胞的菌株
TOP10；DH5a BL21(DE3）；BL21(DE3) plysS
重组质粒筛选简介
重组质粒筛选的方法
根据重组载体的 标志筛选 PCR法筛选 抗氨苄青霉素，抗卡那霉素、lacZ基因 用特定引物以转化细胞为模板扩增目的序列
c. 混合均匀，室温静置0.5-1小时，或4℃放置过夜。 d. 取5 μl连接产物转化感受态细胞
DNA克隆的操作步骤 2. 转化
a. 取一管感受态细胞，置于冰浴中，待溶化后用冰预冷的枪头吸取30-50 μl 到一个新的预冷的无菌离心管中，加入连接产物2-5 μl，轻轻旋转以混匀 内容物，在冰中放置20 - 30分钟。（如需加入较多量的DNA，可加大感 受态细胞用量。） b. 将管放在室温（25℃左右）10分钟左右，或者放到42℃循环水浴中放置 60-90秒，不要摇动。 c. 快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1-2分钟。 d. 每管加500 μ l SOC培养基或LB培养基， 置于37℃摇床振摇培养，转速 180 rpm，温育45分钟使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗性基因。 e. 准备含50-100 μ g/ml氨苄青霉素的SOB或LB琼脂培养基平板，加40 μ l X-Gal（以20 mg/ml的浓度溶于二甲基甲酰胺中），用一无菌的弯头玻棒 涂布均匀。TOP10菌株转化后，理论上加不加IPTG都应出现同样的蓝白斑 效果，但若效果不明显，也可加入16 μ l IPTG（50mg/ml）与X-Gal一起 涂布平板后再涂布菌体。
酶切法筛选
测序筛选
酶切比较载体限制酶内切图谱的变化
一般都会用测序对目的序列做最后鉴定
DNA定量分析－分光光度法
分光光度法：
•
DNA在260nm处有最大吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，
基因克隆及常见问题分析
生物信息学 分析等
测序检测
PCR或 或 PCR 酶切鉴定
质粒提取
重组克隆 筛选 筛选
连接克隆分类（以PCR产物克隆为例）
q 酶切连接克隆
PCR引物设计时引入载体上的酶切位点，PCR产物经双酶切后 定向克隆到目的载体上。这种方法的优点是定向连接克隆，筛选 方便。缺点则是PCR产物的酶切和判断比较困难，另外酶切连接过 程本身也相当地费时费力。
拓扑异构酶
Ø
1. 2. 3. 4.
作用机理 作用机理
酶与DNA结合使双链解旋； DNA 结合使双链解旋； 将一条链切开，并与切口两端结合阻止螺旋旋转； 将一条链切开，并与切口两端结合阻止螺旋旋转； 使另一条链经过切口，然后再将两端连接起来； 使另一条链经过切口，然后再将两端连接起来； 酶从DNA上脱落，两条链复原。 DNA
TIANGEN公司的Marker
Ø MD100系列
Ø Ø Ø 100 bp Ladder
单一条带混合而成 严格控制每条50ng 特别加亮的100ng
Ø MD200系列
Ø
Ø
单一质粒DNA或噬菌体 DNA单酶切而成 按比例计算每条带的质 量
DNA 克隆的几大要素
Ø 目的DNA片段 DNA Ø 克隆载体 Ø 连接酶 Ø 感受态细胞
2.
Ø
反应条件 反应条件
4 ℃或16℃过夜
Ø
对应载体
pBS-T、pGM-T
q 连接体系
反应组分 目的PCR 片段 对照插入片段（700 bp, 50 bp ng/μll ng/ ） ） T载体 T 载体 Ligase 10×Ligation Buffer 10 无菌去离子水 无菌去离子水 反应体系 2 – 7 μl —— 1 μl 0.51 μl 0.5 1 μl 补足到10 μl 阳性对照 —— 1 μl 1 μl 0.51 μl 0.5 1 μl 补足到10 μl 22－26℃ 22 26 快速连接 （5－30分 5 30 钟） 钟） 反应条件 4℃或者 4 或者 16℃过夜 16 过夜
基因克隆技术的使用中常见问题
基因克隆技术的使用中常见问题基因克隆技术作为现代生物科学中的重要工具，在许多领域中都发挥着重要作用。
然而，在基因克隆技术的使用过程中，也经常会遇到一些常见问题。
本文将探讨基因克隆技术使用中经常出现的问题，并提供解决方案。
首先，一个常见的问题是如何选择合适的载体。
在进行基因克隆的过程中，选择正确的载体对于成功完成克隆实验至关重要。
首先要考虑的是载体的大小是否适合所需克隆的基因。
此外，还需考虑载体的复制方式、转染效率和选择标记等因素。
解决这个问题的关键在于研究人员需要对不同的载体进行仔细比较和评估，选择最适合自己实验的载体。
其次，基因克隆技术中常见的问题是如何处理DNA片段。
在克隆过程中，将目标DNA片段与载体连接是一个关键步骤。
然而，DNA连接反应并不总是顺利进行。
一种常见问题是连接反应的效率低，导致难以获得想要的克隆产物。
解决这个问题的建议是优化连接反应条件，包括优化反应体系，调整连接反应的时间和温度等。
此外，还可以尝试不同的连接酶和缓冲液，以提高连接效率。
此外，基因克隆技术中常见的问题还包括如何识别重组克隆和筛选正碱基突变。
在基因克隆中，识别重组克隆和筛选正碱基突变是至关重要的。
一种常见的方法是通过PCR扩增和测序验证重组克隆和序列的准确性。
此外，在测序过程中，还需要确认序列中是否有正确的突变。
解决这个问题的关键在于研究人员需要仔细设计引物和选择适当的条件进行PCR扩增和测序。
另一个常见问题是如何处理低克隆发率。
在实际应用中，由于基因克隆技术的复杂性，克隆发率可能较低。
可能导致低发率的因素包括目标DNA片段的质量或浓度问题，连接效率的低下，以及环化和限制性内切酶切割的问题等。
解决这个问题的方法包括提高目标DNA片段的质量，优化连接反应，并使用高效转染和筛选方法。
最后，一个常见的问题是如何处理有毒基因。
在基因克隆过程中，有时需要克隆或操纵有毒基因。
然而，有毒基因对细胞的生长和生存能力可能造成不利影响。
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感受态细胞
感受态细胞的种类：野生型、化学转化型、电转化型 感受态效率的测定： 产生菌落的总数
转化效率＝
铺板DNA的总量
保存：-70℃冻存，避免反复冻融
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TIANGEN感受态细胞
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零背景载体—实验例
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零背景载体—平末端连接
混匀内容物，离心3-5秒
室温反应5分钟
将离心管置于冰上，进行后续的转化反应
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零背景载体—粘末端连接
A
70℃反应5分钟 冰上短暂冷却
B
室温反应5分钟 冰上短暂冷却
4）转有700bp片段的感受态细胞＋抗性平板
5）转有目的片段的感受态细胞＋抗性平板
检查载体效果
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重组子的鉴定方法
准确度高， 一般作为最终鉴定手段
抗性基因
苄青霉素、卡那霉素、 lacZ基因（蓝白斑筛选）
测序
重组子 鉴定
PCR
单酶切/双酶切，鉴定目的 基因连入方向及片段长度
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DNA纯化常见问题及对策
• 凝胶回收无产物或者回收率低 • 回收DNA质量不好
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DNA纯化常见问题及对策
凝胶无回收产物或回收率低
1、胶块太大，未全部溶解 2、起始量少 3、电泳缓冲液老化，PH值 升高 4、使用去离子水进行洗脱 5、洗脱缓冲液用量过少 6、洗脱缓冲液未加在离心柱 中心 1）将胶块切小，增加溶胶时间或是溶胶 液体积 2）增加回收起始量 3）使用新配制的缓冲液进行制胶和电泳 4）最好用试剂盒配备的洗脱液进行洗脱 5）根据起始量使用合适体积的洗脱液 6）应加在离心柱正中间，并放置1～2分 钟，再离心
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克隆方法（以PCR产物克隆为例）
酶切连接克隆
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内容概要
DNA克隆技术简介 DNA克隆实验流程
DNA克隆的要素
DNA克隆常见问题与应对策略
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克隆实验的流程
网上检索 引物设计
PCR扩增 DNA制备 扩增产物 纯化 与克隆载体 连接 转化、 培养
感受态 E.coli制备
生物信息学 分析等
测序检测
PCR或 酶切鉴定
质粒提取
重组克隆 筛选
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DNA 克隆的要素
• • • • 目的DNA片段 连接酶 克隆载体 感受态细胞
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TOP10 DH5α
BL21 BL21plys
化
IPTG,X-gal
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零背景载体
• • 携带致死基因
（无需抗性筛选）
13个酶切位点
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零背景载体—特点
• 零背景：使用携带致死限制酶基因，无需蓝白斑筛选 • 高效：高效连接酶，阳性率>95% • 通用：适合平末端/粘末端PCR产物 • 快速：室温连接5分钟（平末端）/10分钟（粘末端） • 耐受力强：可插入6bp-10kb 的片段
扩增片段末端
粘末端
适合克隆类型 零背景克隆 TA克隆 零背景克隆 TA克隆
零背景克隆
克隆前处理 平端化（平端化酶） 无 无 加A（加尾酶）
平端化（平端化酶）
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目的DNA片段纯化
纯化原因：多余引物、多余dNTP、多余镁离子等，可 能会影响后续连接反应，建议纯化。
TIANGEN六种PCR耐热聚合酶
高扩增效率
高扩增、高保真
高保真
Pfu
Long Taq
长片段扩增
高扩增、高保真、 高特异性
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高特异性
不同DNA聚合酶PCR产物对比
DNA聚合酶 Taq HotMaster Taq
Pfu Taq Plus Long Taq Taq Platinum 平末端 粘末端+平末端 粘末端+平末端 粘末端+平末端 TA克隆 加A（加尾酶）
研究基因表达
其他（如点突变、SNP等）
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克隆方法（以PCR产物克隆为例）
TA克隆—蓝白斑筛选
非定向连接克隆，连接效率高，操作简单，易于长期保存。 可进行测序后对正确克隆扩大培养。
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克隆方法（以PCR产物克隆为例）
零背景克隆—无需蓝白斑筛选
• • • • 目的DNA片段 连接酶 克隆载体 感受态细胞
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T4 DNA连接酶
作用机理
催化相邻DNA链的5’-P末端和3’OH末端以磷酸二酯键结合的反应， 需ATP作辅酶。 本酶不仅可以催化粘末端/平末端 之间的DNA的连接，也可以催化 DNA与RNA之间以及少数RNA之 间的连接。
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DNA纯化常见问题及对策
回收DNA质量不好
洗脱产物含有乙醇残留 洗脱时硅胶膜上有漂洗液残留， 会使洗脱产物中含有乙醇，影
响下游操作。在洗脱前可通过
再次离心或置于50℃烤箱中5－ 10分钟，彻底去除漂洗液。
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DNA 克隆的要素
DH5a
转化效率高达108，适用于 高效DNA克隆和质粒扩增 转化效率高达108，适用于 高效DNA克隆和质粒扩增
克隆感受态细胞
Top10 Top10
BL21 ( DE3)
适合含T7启动子的载体中目 的基因的表达 适合毒性蛋白和非毒性蛋 白的表达
表达感受态细胞
BL21 ( DE3) pLysS
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DNA纯化试பைடு நூலகம்盒
凝胶回收试剂盒 DNA Marker
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载体
pGM-T连接试剂盒 pGM-T载体 pGM-T克隆试剂盒 pGM-T平末端加A试剂盒
零背景快速连接试剂盒 感受态细胞 转
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PCR特异性好（单带）
超薄/普通/大量DNA产物 纯化试剂盒 寡核苷酸DNA产物纯化 试剂盒 N96 DNA产物纯化试剂盒 通用型DNA产物纯化试 剂盒
PCR特异性差（多带）
超薄琼脂糖凝胶DNA回 收试剂盒 普通琼脂糖凝胶DNA回 收试剂盒 大量琼脂糖凝胶DNA回 收试剂盒 通用型琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒
检查平板是否含IPTG/X-Gal 以及平板是否新鲜制备 复查抗生素的抗性 用于制备感受态的菌株，传 代次数不能太多（20代以内
未加IPTG/X-Gal或其失效 抗生素失活，敏感菌亦能
生长
3.
用于制备感受态的菌株退 化，丢失了某些重要
对 策
2. 3.
为佳）
因子
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分光光度法
受缓冲体系、样品稀释度、 核酸二级结构、仪器本身等影 响
DNA marker 定量法
EB分子插入DNA分子碱基间， 50ngDNA即可显现清晰条带， 定量方便直观
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TIANGEN公司的Marker
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DNA 克隆的要素
3.
抗生素使用错误
转化后立即涂板忘 记温浴
对 策
2. 3.
使用高效率的感受态细 胞（106以上） 复查质粒抗性，使用正 确的抗生素 转化后温浴45min左右， 让抗性基因得以表达
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DNA克隆常见问题之二
白斑少
原因
1. 2. 3.
4. 5.
A或T突出端丢失 插入片段与载体比例不适 PCR 产物中含有抑制连接 的成分 连接时间不够；温度太高 PCR 产物已经插入，但未 破坏lacZ 基因的翻译框
TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD.
内容概要
DNA克隆技术简介 DNA克隆实验流程
DNA克隆的要素
DNA克隆常见问题与应对策略
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DNA 克隆的目的
目的基因的序列测定及筛选 增加目的基因的拷贝，降低后续实验的难度
DNA克隆常见问题之四
阳性克隆率低
原因
1. 2. 3. 4.
1. 2.
PCR产物不纯，非目的条带 亦被克隆 PCR部分产物发生A尾丢失 PCR所用酶不在产物3’端加 A或只是部分加A 片段与载体比例不适
对 策
3.
4.
重新纯化PCR产物 PCR扩增后，尽量少放置，直 接进行后续的回收连接，以防 A尾丢失 除Taq酶外，使用其它酶扩增 的产物在用于TA克隆时都建议 先加A, 再连接 调整片段与载体的比例，控制 在1:3-1:8之间
酶切法
用特异引物以转化细胞为 模板进行扩增
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内容概要