基因敲除技术改造工业酿酒酵母菌株
乙醇脱氢酶Ⅰ基因敲除的酿酒酵母重组菌构建的初步研究
参考文献：
Ｍ为分子量标准（ＤＬ ２０００，天为时代）；泳道ｌ和２均为扩增的样品
分子量为１０２３ｂｐ。
图４
以ＨｙＢｌ和Ｈ［ｙＢ２为引物扩增转化酵母基因组结果
筛选抗性菌落。结果显示（图３），有部分菌株可以在含 有潮霉素的平板上生长，表明其体内含有潮霉素抗性，
而在空白对照平板上（未涂有１００ ｐ ｇ，ｍｌ潮霉素）没有菌落 生成。
利用酵母基因组提取试剂盒，提取转化后酵母及野 生酵母的基因组ＤＮＡ，以ＨｙＢｌ和ＨｙＢ２引物进行ＰＣＲ 扩增。结果发现（图４），在酵母基因组上，扩增出本实 验所需要的片段１０２６ｂｐ，说明外源基因已经整合到酵母 基因组上。 ２．５ 发酵实验
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)做为传统的乙醇生产菌株，具有乙醇耐受性强，发酵工艺成熟，工业应用范围广泛，与其它微生物比较生物 安全性好等特点。同时，酿酒酵母是第一个基因组完成测序的真核生物，遗传背景非常清楚，由于其体内具有高效的同源重组机制，在分子和基因水平
进行操作非常容易。在实际工业生产中，为了降低发酵工艺成本、实现高效的转化率和产出率，菌种的优劣在整个生产流程中尤为重要。因此，菌种的 选育必须以降低生产耗资与高产出为原则。近年来，依据代谢工程理念，应用分子生物学手段对酿酒酵母进行分子育种是主要的研究方向，其中，尤为 突出的是重组DNA技术。应用代谢工程理念使用基因工程手段对菌种改造过程中，敲除或过表达特定基因可以阐明该基因功能，改变代谢途径，从而提高 目标产物产量。同时，该突变株为进一步探索目的基因的转录调控机制、基因与蛋白质相互作用以及分子信号传导通路等提供了理想材料，并为进一步 从基因和分子水平改进酿酒酵母乙醇代谢途径，构建优良性状高产乙醇生产菌奠定了基础。本研究利用酿酒酵母细胞内的同源重组机制，运用基因敲除 和过表达技术，降低了由乙醛生成乙酸的分解代谢流，并在此基础上增强了己糖代谢率。与原始出发菌株相比，不仅提高了乙醇产量，而且缩短了发酵 周期，提高了发酵产率。研究内容如下：
基因敲除在工业微生物育种方面的应用
基因敲除在工业微生物育种方面的应用基因敲除技术在工业微生物育种中的妙用嘿，伙计们！今天咱们来聊聊那个让人眼前一亮的玩意儿——基因敲除技术。
这玩意儿就像是给工业微生物开了个“超能力”，让它们变得更强大、更高效，简直就像科幻电影里的超级英雄一样！首先得说说什么是基因敲除技术。
简单来说，就是通过“咔嚓”一下把某个基因给“敲掉”，让它从我们的目标微生物体内消失不见。
这样一来，原本那些影响产量、品质或者成本的小麻烦就统统消失了，剩下的都是高效率、低成本的好宝贝！想象一下，如果我们的工业微生物育种工作像打怪升级一样，有了基因敲除这个“神级技能”，那效率和产量不就能嗖嗖地往上涨吗？想想看，以前咱们辛辛苦苦培育一个菌种，可能要花上几个月甚至几年的时间，还得担心会不会出现什么意外情况。
但现在，有了基因敲除技术，说不定几天、几周甚至几个月就能搞定一个菌种，是不是感觉轻松多了？再说说成本问题，以前咱们为了提高产量，可能得不断地尝试、筛选、淘汰，这个过程既费时又费力。
现在有了基因敲除技术，咱们可以一次性解决这些问题，省去了很多不必要的麻烦和浪费。
而且，由于产量和品质都得到了保证，成本自然也就降下来了。
当然啦，基因敲除技术也不是万能的。
有时候，一些特殊的环境因素或者遗传变异可能会影响它的效果。
这就需要我们不断摸索、试验，才能找到最佳的应用方案。
不过别担心，科学家们可是一直在努力研究这个问题呢！相信在不久的将来，我们一定能够克服这些困难，让基因敲除技术发挥出更大的作用！总之啊，基因敲除技术就像是给工业微生物开了个“超能力”，让我们能够更加轻松、高效地完成育种工作。
虽然它也有一些挑战需要我们去面对，但我相信只要我们不断努力、探索，总有一天会实现这个梦想的！最后再给大家提个小建议：在利用基因敲除技术进行工业微生物育种的时候，一定要注意安全性和环保性哦！毕竟这可是关系到食品安全和环境保护的大事儿呢！。
酿酒酵母细胞cdc50基因敲除及其转录组测序分析
酿酒酵母细胞cdc50基因敲除及其转录组测序分析李鑫玉;唐秀琴;李子航;刘佳;王琦;邹伟【期刊名称】《中国酿造》【年(卷),期】2024(43)4【摘要】为探讨cdc50基因对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞功能的影响,该研究以PYM14质粒为模板,采用醋酸锂转化法对野生型酿酒酵母BY4742进行cdc50基因敲除,测定突变菌株Δcdc50生长情况,分别对野生型酵母菌株BY4742和突变菌株Δcdc50进行转录组分析,筛选二者差异表达基因(DEGs),并对其进行基因本体论(GO)、京都基因与基因百科全书(KEGG)富集分析。
结果表明,成功构建酿酒酵母cdc50基因缺失菌株Δcdc50,cdc50基因缺失后酵母细胞形态由圆形变为杆状,培养12 h后菌株Δcdc50相对生长率为1.98%,较野生型酵母BY4742菌株显著降低(P<0.05)。
与野生型酵母菌株BY4742相比,菌株Δcdc50的DEGs共有581个,其中271个基因上调,310个基因下调。
GO富集分析表明,DEGs主要富集在生物学过程中的氧化还原过程等,分子功能中的氧化还原酶活性、辅助因子结合和跨膜转运体活性等。
KEGG富集分析表明,DEGs主要富集于糖酵解/糖异生、脂肪酸降解和碳代谢通路等。
【总页数】6页(P123-128)【作者】李鑫玉;唐秀琴;李子航;刘佳;王琦;邹伟【作者单位】昆明医科大学公共卫生学院;昆明医科大学基础医学院【正文语种】中文【中图分类】Q78;Q93;R33【相关文献】1.酿酒酵母细胞基因组中与转录因子Rim101亚细胞定位相关的磷酸酶和激酶基因的筛选2.基于转录组测序分析Ppp2ca条件性敲除小鼠的睾丸差异表达基因及相关通路3.转录组测序分析3种不同链长脂肪酸对酿酒酵母基因转录水平的影响4.CXCR2基因敲除HeLa细胞株构建及转录组测序分析因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
酿酒酵母基因组编辑技术原理
酿酒酵母基因组编辑技术原理基于Red同源重组和CRISPR/Cas9的酿酒酵母基因组编辑服务。
成熟的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）编辑体系，助您成功实现基因敲除、基因插入和点突变。
基于Red同源重组法的酿酒酵母基因组改造酿酒酵母基因敲除的传统方法是利用自身的Red系统对外源进入的DNA进行同源重组，从而实现目标基因的等位替换。
通过设计靶基因的同源融合片段，将其克隆至自杀载体中，自杀载体通过接合输入到靶细菌。
通过抗生素筛选细菌基因组靶位点整合有自杀载体的插入突变株。
在第二轮反向选择压力下，只有酿酒酵母基因组发生第二次同源重组并丢失自杀质粒才可以存活。
基于CRISPR/Cas9平台的酿酒酵母基因组改造CRISPR/Cas9系统是细菌和古细菌特有的一种天然防御系统,用于抵抗病毒或外源性质粒的侵害。
研究内容•酿酒酵母基因敲除（Saccharomyces cerevisiae gene knockout）•酿酒酵母基因敲入（Saccharomyces cerevisiae gene knockin）•酿酒酵母基因点突变（Saccharomyces cerevisiae gene point mutation）下游应用•发现新的基因功能•优化代谢通路，提升代谢产物产量，实现工业化生产参考文献：•Selle K, Barrangou R. Harnessing CRISPR–Cas systems for bacterial genome editing[J]. Trends in microbiology, 2015, 23(4): 225-232.•Zerbini, F., Zanella, I., Fraccascia, D., König, E., Irene, C., &Frattini, L. F., et al. (2017). Large scale validation of an efficient CRISPR/Cas-based multi gene editing protocol in Escherichia coli. Microbial Cell Factories, 16(1), 68.。
酵母基因敲除方法
酵母基因敲除方法
酵母基因敲除是一种常用的基因功能研究方法，其原理是通过DNA重组技术将目标基因的编码序列替换为可识别的选择标记物，进而利用选择标记物筛选敲除目标基因的突变菌株。
常用的选择标记物有抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等。
酵母基因敲除方法的步骤主要包括：1.设计合适的引物，扩增选择标记物和目标基因的DNA片段；2.将选择标记物和目标基因的DNA 片段进行重组；3.将重组的DNA片段转化到酵母细胞中；4.筛选并鉴定目标基因敲除的突变菌株。
酵母基因敲除方法不仅可以用于研究基因功能，还可以用于制备工业酶、发掘新的代谢途径等方面。
但是该方法也存在着一些限制，例如敲除基因可能会导致生长变差或死亡等问题。
因此，在进行酵母基因敲除实验时需要根据具体情况进行优化和调整。
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基因敲除技术改造工业酿酒酵母菌株
基因敲除技术改造工业酿酒酵母菌株亚硫酸盐是食品及啤酒行业普遍采用的抗氧化剂，在啤酒酿造过程中能与醛类物质发生加成反应而起稳定风味的作用。
作为抗氧化剂主要是由于亚硫酸盐能够结合氧而产生无毒害影响的硫酸根离子。
作为风味稳定剂主要是由于亚硫酸盐能够与含醛类化合物结合产生不挥发性的亚硫酸盐加成物，减少了啤酒中游离醛类物质的含量。
然而啤酒酿造过程中形成的亚硫酸盐被亚硫酸盐还原酶还原而不能在啤酒中积累，故其在发酵液中含量一般较低，不能起到稳定啤酒风味的作用。
啤酒中亚硫酸盐有多种来源，然而两个主要来源是发酵过程中酵母代谢产生的和在啤酒瓶装或罐装前外加进的。
硫酸盐进入酵母细胞后，在ATP-硫酸化酶的催化下，首先被三磷酸腺苷活化，经过一系列酶促反应后，变为亚硫酸盐。
亚硫酸盐是中间产物，其进一步被亚硫酸盐还原酶还原后，形成硫化氢。
亚硫酸盐能与啤酒中主要的老化物质羰基化合物通过复杂的反应，生成对风味稳定性无影响的较稳定的复合物，能够延长啤酒的保鲜期。
酿酒酵母的met10基因编码了一个115kD的亚硫酸盐还原酶必需的多肽，它可能是亚硫酸盐还原酶的亚单位，缺失met10基因的酿酒酵母在发酵过程中亚硫酸盐的含量可能会大幅度提高，亚硫酸盐作为一种抗氧化剂，在啤酒中含量增加对啤酒的稳定性有利，用此种酵母生产的啤酒的风味稳定性比用常规酵母高得多。
可以避免在发酵完毕时，添加抗氧化剂亚硫酸盐，而引起生成较多的H2S。
影响啤酒质量的诸多因素中，酵母菌种的好坏起着至关重要的作用，可以说酵母是啤酒的灵魂。
高质量的啤酒当然需要性能优良的酵母菌种，酿酒酵母是最早人类认识和利用微生物之一。
几个世纪以来，酿酒酵母被用于食品和酒精饮料生产，如今它也被应用于制药、表达异源蛋白等不同行业中。
酿酒酵母因其不表达内毒素而不具致病性，使得其被分类为GRAS (Gene- rally Regarded As Safe)生物，其在工业上大规模的被用于生产面包、酒精和啤酒。
酿酒酵母同源重组方法敲除基因
酿酒酵母同源重组方法敲除基因嘿，朋友们！今天咱就来讲讲酿酒酵母同源重组方法敲除基因这个有趣的事儿。
你说这酿酒酵母啊，就像是一个小小的魔法盒子，里面藏着好多神奇的秘密等待我们去发现。
而同源重组呢，就像是一把神奇的钥匙，能帮我们打开这个盒子，对基因进行一些巧妙的操作。
想象一下，基因就像是一串串复杂的密码，而我们要做的就是找到特定的那一段，然后把它给“咔嚓”掉！这可不是随随便便就能做到的哦。
首先呢，我们得准备好我们的工具和材料，就像厨师做菜要有锅碗瓢盆和食材一样。
我们要有合适的酿酒酵母菌株，这可是我们的主角呀。
然后呢，还得有设计好的敲除片段，这就像是我们做菜的配方，可不能错啦。
接下来，就是见证奇迹的时刻啦！我们要把敲除片段导入到酵母细胞中，让它们在里面发生同源重组。
这就好像是给酵母细胞下达了一个特别的任务，让它们去完成基因的敲除工作。
这过程可不简单哦，就像走迷宫一样，得小心翼翼地找到正确的路。
有时候可能会遇到一些小挫折，比如重组的效率不高啦，或者出现了一些意外的情况。
但别灰心呀，这都是探索过程中的小插曲。
你看，这就像我们平时做事一样，哪能一帆风顺呢？不经历风雨，怎么见彩虹呢？对吧！在这个过程中，我们得时刻保持警惕，仔细观察每一个步骤，就像侦探在寻找线索一样。
一旦发现有什么不对劲的地方，就得赶紧想办法解决。
而且哦，这个实验可不能马虎，每一个细节都可能影响到最终的结果。
就好像盖房子，一块砖没放好，可能整座房子就不牢固啦。
当我们终于成功地敲除了基因，那种喜悦感可真是无法用言语来形容啊！就像是解开了一道超级难的谜题，那种成就感爆棚的感觉，哇，真的太棒啦！总之呢，酿酒酵母同源重组方法敲除基因是一个充满挑战和乐趣的过程。
它需要我们有耐心、细心和创新精神。
虽然会遇到困难，但只要我们坚持不懈，就一定能取得成功。
所以呀，朋友们，大胆地去尝试吧，去探索这个神奇的基因世界，说不定你会有惊人的发现呢！。
基因敲除在工业微生物育种方面的应用
基因敲除在工业微生物育种方面的应用基因敲除技术在工业微生物育种方面的应用随着科学技术的不断发展，基因编辑技术逐渐成为生物技术研究的重要手段。
基因敲除技术作为基因编辑技术的一种，近年来在工业微生物育种领域得到了广泛应用。
本文将从理论层面对基因敲除技术在工业微生物育种方面的应用进行详细阐述。
我们来了解一下基因敲除技术的原理。
基因敲除技术是通过移除或替换微生物细胞中的某个基因，从而实现对微生物生长、代谢等关键性状的调控。
这种技术具有操作简单、高效、可逆性强等优点，因此在工业微生物育种中具有广泛的应用前景。
在工业微生物育种中，基因敲除技术主要应用于以下几个方面：一、提高发酵效率工业发酵是微生物制药、食品加工等行业的关键环节。
通过对目标微生物的基因敲除，可以有效地提高其发酵效率。
例如，在酿酒过程中，通过对酵母菌的基因敲除，可以降低酒精的生成量，提高酒精浓度，从而提高酒的质量。
基因敲除技术还可以用于提高酶活性、改善产物纯度等方面。
二、优化微生物种群结构在工业微生物育种过程中，往往需要筛选出具有特定功能的优良菌株。
通过对这些菌株的基因敲除，可以有效地优化其种群结构，使其更加适应生产需求。
例如，在抗生素发酵过程中，通过对耐药性较强的菌株的基因敲除，可以筛选出具有更高抗性的优良菌株，从而提高抗生素产量。
三、控制微生物污染在某些生产过程中，可能会出现微生物污染的问题。
通过对可能产生污染的微生物的基因敲除，可以有效地控制污染风险。
例如，在废水处理过程中，通过对产生污泥膨胀现象的细菌的基因敲除，可以降低污泥体积，减少处理难度。
四、提高微生物耐受性在工业生产过程中，微生物往往需要面对恶劣的环境条件。
通过对这些条件敏感的微生物的基因敲除，可以提高其耐受性，使其能够在更广泛的环境中生存和繁殖。
例如，在高温环境下进行发酵时，通过对耐热性较差的菌株的基因敲除，可以提高其在高温条件下的存活率和发酵效果。
基因敲除技术在工业微生物育种领域具有广泛的应用前景。
基因工程研究与训练高产酿酒酵母
基因工程研究与训练高产酿酒酵母富有活力的酿酒酵母是酒类生产中至关重要的元素。
它们被用于发酵过程中，转换糖类物质为乙醇和二氧化碳，是酒中香味和口感的产生者。
然而，传统的酵母进行发酵周期较长，且产量相对较低。
基因工程的发展，为此提供了一条新途径，它可以通过改造酵母细胞的基因，创造出更加高产，更加稳定的酿酒酵母。
基因工程研究基因工程技术是一种用于改变或操作生物体遗传信息的方法。
对于酿酒酵母工程来说，这种方法可以被用来创造出更加强大的酿酒酵母菌株。
对酵母细胞的基因进行编辑，可以使其拥有更加高产的特性，以及更加稳定的品质。
这项技术不断发展，提高酒类生产的效率和成品质量的同时，也为相关领域的发展注入新的活力。
以西斯酿酒酵母为例，这是一种常用的酿酒酵母，但通常需要比较长的温度周期来完成发酵过程。
通过基因工程的手段，可修改酵母细胞的基因，使其产率更高，代谢速率更快。
这样可以大大缩短发酵时间，提高产品产量和品质。
训练高产酿酒酵母除了基因工程技术，训练高产酿酒酵母也是创造更强大的菌株的另一种方法。
一个成功的酵母菌株训练过程包括以下几个步骤：1. 选择目标酵母：训练酵母之前，必须选择一种具备较高发酵能力的初代菌株，作为训练的目标。
2. 静态训练：将目标酵母菌株置于对它来说非常适宜的环境中。
在较短的时间内使其发展繁殖，逐渐使其进入发酵状态。
这种方法可以提高酵母的发酵能力。
3. 动态训练：在静态训练给出的条件基础上，增加外部压力如利用离心力、沉淀、酸性烁杯中培养等方式来逼迫酵母反应并提高其发酵能力，加快发酵周期。
4. 选优汰劣：在训练过程中，将表现不佳的菌株逐渐淘汰，只保留和满足需求的菌株，最后得到高效、高产的酵母菌株。
结论可以预见，随着基因工程技术的不断发展，酿酒酵母生产将会有一个新的革命性的突破，将会大幅提高生产效率，改进产品制造流程和品质。
因此，在这个永远充满变化的行业里，基因工程和训练高效酿酒酵母都是不可或缺的工具，让我们拭目以待酒类生产业的蓬勃发展！。
基因敲除GCV2的酿酒酵母构建
基因敲除GCV2的酿酒酵母构建熊志钦;周世水【摘要】[目的]构建低甲醇生成的酿酒酵母工程菌用于酿造低甲醇酒.[方法]利用基因敲除技术,敲除酵母代谢甘氨酸生成甲醇途径的甘氨酸裂解酶系的基因GCV2.[结果]成功构建出基因敲除GCV2的工程酵母L5,用L5酿造酒中的相对甲醇含量为131 mg/L,比初始菌株的192 mg/L降低31％.[结论]利用基因敲除GCV2的工程酵母菌可有效减少酒中由甘氨酸代谢生成甲醇的量.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2015(000)015【总页数】3页(P63-65)【关键词】基因敲除;甲醇;酿酒酵母【作者】熊志钦;周世水【作者单位】华南理工大学生物科学与工程学院,广东广州510006;华南理工大学生物科学与工程学院,广东广州510006【正文语种】中文【中图分类】S188+.4甲醇是酒中一种对人体有害的物质，其对人体致死量为143 mg/kg，特别是在人体内有蓄积作用，不易排出［1］。
因此，降低酒中甲醇的含量对饮酒人群的健康意义重大。
而酒中甲醇来源主要有2个途径:一是由果胶、纤维素等酿酒原料分解产生的甲醇，二是酵母菌自身代谢甘氨酸生成的甲醇［2］，即甘氨酸经甘氨酸裂解酶系催化反应生成甲醇，该酶系复合体中的甘氨酸脱羧酶是由基因GCV2编码生成的P蛋白亚基。
基因敲除或基因沉默GCV2能有效地阻断酵母代谢甘氨酸生成甲醇［3］。
因此，笔者构建基因敲除酵母GCV2的工程菌，并应用于酿造低甲醇健康酒。
1 材料与方法1．1 材料1．1．1 菌种与质粒。
酿酒酵母S1由华南理工大学发酵工程实验室保存，质粒pUG6（含抗G418的Kanr筛选标记）购于杭州宝赛生物科技有限公司。
1．1．2 酶、试剂和仪器。
TaqHS酶购于TaKaRa公司，G418、醋酸锂购于纽普诺博生物制品有限公司，小量酵母基因提取试剂盒、质粒制备试剂盒购于艾比根生物技术有限公司。
安捷伦7890A气相色谱仪、DB-FFAP毛细管柱（30m×0．53 m×1．00 μm）和安捷伦7694E顶空进样器。
Cre-loxP重组酶技术敲除酿酒酵母丙酮酸脱羧酶编码基因pdc1和pdc5
doi:10.3969/j.issn.1009-0002.2019.04.004研究报告收稿日期：2019-04-23基金项目：国家自然科学基金（31570492）；黑龙江省教育厅重点项目（HDJCCX-2016Z05）作者简介：刘磊（1996-），男，硕士，（E-mail ）liuleiheida@ 通信作者：葛菁萍，（E-mail ）gejingping@Cre-loxP 重组酶技术敲除酿酒酵母丙酮酸脱羧酶编码基因pdc1和pdc5刘磊a ，b ，王长丽a ，b ，葛菁萍a ，b黑龙江大学 a.农业微生物技术教育部工程研究中心，黑龙江哈尔滨150500；b.生命科学学院微生物省高校重点实验室，黑龙江哈尔滨150080［摘要］目的：分别构建含有酿酒酵母丙酮酸脱羧酶基因pdc1和pdc5同源序列loxP-kanMX-loxP 的质粒，敲除丙酮酸脱羧酶基因。
方法：以两端含40bp pdc1或pdc5的同源序列为引物，以pUG6质粒DNA 为模板，通过PCR 扩增loxP-kanMX-loxP 基因敲除片段，将其分别插入pMD18-T 、pEASY-T3，构建表达载体pTWCL-PDC1与pTWCL-PDC5并测序，构建后的质粒利用醋酸锂转化法转化酿酒酵母H5，经筛选鉴定后进行摇瓶发酵试验。
结果：分别含有1693、1672bp 目的片段pdc1-loxP-kanMX 、pdc5-loxP-kanMX 的质粒pTWCL-PDC1与pTWCL-PDC5构建成功，发酵试验显示重组酿酒酵母H5-01与H5-02较原始菌株的乙醇产量分别下降了14.53%与17.54%，证明pdc1或pdc5基因被敲除。
结论：利用Cre-loxP 重组酶技术分别敲除了酿酒酵母pdc1和pdc5基因，为后续在酿酒酵母中连续敲除pdc1和pdc5奠定了良好的技术基础。
［关键词］酿酒酵母；丙酮酸脱羧酶；醋酸锂转化法；2，3-丁二醇［中图分类号］Q78［文献标识码］A［文章编号］1009-0002（2019）04-0479-07Cre-loxP Recombinase Technology Knocks out Saccharomy⁃ces cerevisiae Pyruvate Decarboxylase Encoding Genes pdc1and pdc5LIU Lei a,b ,WANG Chang-Li a,b ,GE Jing-Ping a,b *a.Engineering Research Center of Agricultural Microbiology Technology,Ministry of Education,Harbin 150500;b.Key Laboratory of Microbiology,College of Heilongjiang Province,School of Life Sciences,Harbin 150080;Hei⁃longjiang University,China*Corresponding author,E-mail:gejingping@［Abstract ］Objective:To construct plasmid containing homologous loxP-kanMX-loxP fragment of Saccharomyces cerevisiae pyruvate decarboxylase gene pdc1or pdc5to knock out pyruvate decarboxylase gene.Methods:The loxP-kanMX-loxP gene knockout fragments were amplified by PCR using homologous sequences containing 40bp pdc1or pdc5at both ends as primers from pUG6plasmid DNA template,and were inserted into pMD18-T and pEASY-T3to construct expression vectors pTWCL-PDC1and pTWCL-PDC5respectively and sequenced.The con⁃structed plasmid was transformed into S.cerevisiae H5by a lithium acetate conversion method,and subjected to a shake flask fermentation test after screening and identification.Results:The plasmids pTWCL-PDC1and pTWCL-PDC5containing the1693,1672bp fragment pdc1-loxP-kanMX and pdc5-loxP-kanMX respectively were success⁃fully constructed,and the fermentation experiments showed that the ethanol production of recombinant strains S.cere⁃visiae H5-01and H5-02decreased by14.53%and17.54%compared with the original strain respectively,demon⁃strating pdc1or pdc5gene knockout.Conclusion:pdc1and pdc5in S.cerevisiae were successfully knocked out by using the Cre-loxP recombinant enzyme technology,which laid a good technical foundation for the subsequent con⁃tinuous knocking out of pdc1and pdc5in S.cerevisiae.［Key words］Saccharomyces cerevisiae;pyruvate decarboxylases;lithium acetate transformation;2,3-butanediol2，3-丁二醇（2，3-butanediol；2，3-BD）及其衍生物是重要的平台化合物，在化工、燃料、食品等领域具有很高的应用价值[1-2]。
酿酒酵母的基因编辑技术及其应用
酿酒酵母的基因编辑技术及其应用酿酒是一项古老而精细的工艺，其制作过程中需要使用到酒酵母。
虽然在传统的发酵过程中酵母的扮演十分重要，但是其性能和特性却有着种种限制，导致在酿制过程中出现了一些问题，为了解决这些问题，人们研究出了酿酒酵母的基因编辑技术。
本文将详细介绍酿酒酵母基因编辑技术的原理和应用。
一、酿酒酵母基因编辑技术的原理目前，利用基因功能整合技术进行酵母基因编辑的方法有多种。
其中，CRISPR/Cas9技术是目前最常用的一种方法。
CRISPR/Cas9技术是根据细菌侵染噬菌体时的免疫机制，构建出的一种人工的核酸修饰系统。
通过将特异性RNA与Cas9蛋白相结合，特异性切割靶基因的DNA，从而对基因进行编辑。
酿酒酵母基因编辑技术的操作流程如下：1.设计CRISPR/Cas9系统。
根据酿酒酵母对应基因的序列，设计具有特异性的sgRNA，然后构建CRISPR/Cas9表达载体。
2.转化CRISPR/Cas9表达载体。
在完成CRISPR/Cas9表达载体的构建后，将其中的Cas9基因与sgRNA同时导入到目标酿酒酵母中。
3.筛选编辑结果。
等待转化后的酿酒酵母进行定向培养，检测其基因编辑效果。
二、基因编辑技术在酿酒中的应用基因编辑技术可以在酿酒酵母中引入一些新的特性，让其更加适合酿造不同种类的酒。
目前已有许多研究证明了酿酒酵母基因编辑技术的成功应用。
1.改进生产效率。
酿酒酵母基因编辑技术可以通过修改酿酒酵母的基因序列，提高其对果糖和葡萄糖的代谢能力，从而提高生产效率。
2.改进口感。
通过编辑酿酒酵母基因，可以使其产生更多的香气和口感，从而改进酒的口感。
3.改进发酵能力。
在发酵过程中，酿酒酵母会受到各种不同的环境干扰。
通过基因编辑技术，可以增强酿酒酵母的抗干扰能力，保证酿酒发酵过程的顺利进行。
三、基因编辑技术面临的挑战尽管酿酒酵母基因编辑技术在酿酒中的应用前景广阔，但是它面临着一些挑战。
首先是获取更好的基因编辑结果。
基因敲除在工业微生物育种方面的应用
基因敲除在工业微生物育种方面的应用基因敲除技术在工业微生物育种方面的应用随着科学技术的不断发展，基因编辑技术逐渐成为研究热点。
基因敲除技术作为基因编辑技术的一种重要手段，已经在工业微生物育种领域取得了显著的成果。
本文将从理论层面对基因敲除技术在工业微生物育种方面的应用进行探讨。
我们来了解一下基因敲除技术的原理。
基因敲除是指通过特定的方法，使得目标基因失去表达功能或者完全消失。
这种技术可以精确地靶向特定基因，而不影响其他基因的表达。
基因敲除技术主要包括CRISPR/Cas9、TALEN和ZFN等方法。
这些方法的基本原理都是通过特定的酶切割DNA分子，使得目标基因失去表达功能或者完全消失。
接下来，我们将从以下几个方面来探讨基因敲除技术在工业微生物育种方面的应用：一、提高微生物育种效率在工业微生物育种过程中，往往需要通过大量的实验来筛选出具有优良性能的菌株。
而传统的育种方法往往耗时耗力，效率较低。
基因敲除技术可以精确地靶向特定基因，从而提高育种效率。
通过对目标基因进行敲除，可以排除与目标基因相关的不利因素，使菌株的性能得到优化。
基因敲除技术还可以实现多个基因的同时敲除，进一步提高育种效率。
二、优化微生物菌株性能在工业微生物育种过程中，往往需要针对不同的应用场景选择具有不同性能的菌株。
例如，对于发酵工艺来说，需要菌株具有良好的发酵性能；对于分离纯化来说，需要菌株具有良好的分离纯化性能。
基因敲除技术可以通过靶向特定基因，实现对菌株性能的优化。
通过对目标基因进行敲除，可以排除与目标基因相关的不利因素，使菌株的性能得到提升。
基因敲除技术还可以实现多个基因的同时敲除，进一步提高菌株性能的优化效果。
三、降低育种成本在工业微生物育种过程中，往往需要大量的实验来筛选出具有优良性能的菌株。
这不仅耗时耗力，而且成本较高。
基因敲除技术可以精确地靶向特定基因，从而降低育种成本。
通过对目标基因进行敲除，可以排除与目标基因相关的不利因素，减少实验次数，降低实验成本。
酿酒酵母基因编辑的主要技术成果探究
国内外监管政策对比分析
国内监管政策
介绍中国针对基因编辑酿酒酵母的监管政策， 包括审批流程、安全性评估要求等。
国外监管政策
概述国外主要国家和地区对基因编辑酿酒酵母 的监管政策，如美国、欧盟等。
对比分析
对国内外监管政策进行对比分析，探讨其异同点及可能的原因。
未来发展趋势预测
技术发展趋势
预测基因编辑技术在酿酒酵母领域的发展趋势，包括更高效、更精 准的编辑方法等。
记等。
Hale Waihona Puke 基因编辑工具准备基因编辑所需的工具，如 CRISPR-Cas9系统、TALENs或ZFNs 等。
培养基和试剂
准备适合酿酒酵母生长的培养基和试 剂，如YPD培养基、抗生素等。
基因敲除实验流程示例
设计sgRNA
根据靶标基因序列，设计特异性的sgRNA， 并构建到CRISPR-Cas9载体上。
转化酿酒酵母
TALENs技术已成功应用于多种细胞类型的基因 编辑，包括酿酒酵母。
其他新兴基因编辑方法
Base editing技术
该技术可在不切割DNA双链的情况下实现单碱基替换，为酿酒酵母基因编辑提供了新的 思路。
Prime editing技术
该技术结合了CRISPR-Cas9和逆转录酶的功能，可实现更精确的基因编辑。
监管政策趋势
分析未来国内外监管政策的可能变化，如审批流程的简化、安全性 评估标准的更新等。
市场应用前景
探讨基因编辑酿酒酵母在市场应用方面的前景，如其在食品、医药等 领域的潜在应用价值。
06
挑战、争议及前景展望
技术挑战与局限性分析
基因编辑效率
酿酒酵母基因编辑效率受到多种 因素影响，如基因位置、编辑方 法、细胞状态等，提高编辑效率 是技术面临的重要挑战。
如何利用基因编辑技术改造酿酒酵母
如何利用基因编辑技术改造酿酒酵母酿酒已有数千年的历史，是一项古老而重要的饮食文化。
然而，如今的酿酒业不仅仅局限于传统的酿酒工艺，科技的进步使得基因编辑技术成为一种可行的方式，用来改造酿酒酵母，以提高酿酒的质量和效率。
本文将详细介绍如何利用基因编辑技术改造酿酒酵母，以及其中可能面临的挑战和潜在的应用前景。
基因编辑技术是一种通过人工干预生物的基因组，对目标基因进行精确的改变和修复的技术手段。
在酿酒酵母中运用基因编辑技术，可以对其基因组进行精确的修改，以改变酵母的性状和特性。
这种技术的应用可以带来多种优势，如提高酒精产量、改善酒的口感和香气、增强抗逆能力等等。
利用基因编辑技术改造酿酒酵母的第一步是确定需要改变的目标基因。
对于不同的改造目标，可以选择不同的基因编辑工具。
常用的工具包括CRISPR-Cas9系统、TALEN（转录激活因子样核酸修饰酶）以及ZFNs（锌指蛋白）。
这些工具可以用来切割、插入、删除和修复酿酒酵母基因组中的特定位点，从而达到预期的改造效果。
一种常见的改造目标是提高酿酒酵母的酒精产量。
酒精是酿酒过程中的主要产物，它的产量决定了酒的浓度和品质。
利用基因编辑技术，可以通过增强酵母的葡萄糖代谢途径，提高酵母对葡萄糖的利用效率，从而实现酒精产量的提升。
例如，可以通过增加相关酶的表达量或改造酶的催化活性来改变酵母的代谢能力。
另一个改造目标是改善酒的口感和香气。
酿酒酵母不仅参与发酵过程，也会释放出多种化合物，影响着酒的风味特点。
基因编辑技术可以用来调节酵母产生的挥发性物质，从而改变酒的口感和香气。
例如，可以通过调节酵母合成氨基酸的途径，增加或减少某些挥发性化合物的产生，以达到调节酒味的目的。
同时，基因编辑技术还可以改造酿酒酵母的抗逆性。
在酿酒过程中，酵母可能受到温度、酸碱度、酒精浓度等多种外界环境因素的影响，进而影响发酵效果和酒的质量。
通过基因编辑技术，可以改变酵母对这些逆境的响应能力，增强酿酒酵母的耐受性。
GTR-CRISPR系统：一种高效的酿酒酵母多基因编辑工具
GTR-CRISPR系统：一种高效的酿酒酵母多基因编辑工具酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是一种重要的工业微生物，广泛应用于食品、饮料、生物燃料和医药等领域。
为了提高酿酒酵母的性能和产量，需要对其基因组进行精准和高通量的改造。
CRISPR-Cas9技术是一种革命性的基因编辑技术，可以实现目标DNA的特异性切割和修复。
然而，CRISPR-Cas9技术在酿酒酵母中的应用受限于gRNA的表达效率和数量，导致多基因编辑的难度和时间成本较高。
为了解决这一问题，北京化工大学Jens Nielsen与刘子鹤联合实验室开发了一种称为gRNA-tRNA-array CRISPR-Cas9（GTR-CRISPR）的系统，用tRNA序列将多个gRNA串联起来表达，极大提高了在酿酒酵母中的基因编辑数目和效率。
gRNA是指导Cas9核酸酶切割目标DNA的RNA分子，tRNA是参与蛋白质合成的RNA分子，它们之间可以通过RNase P和RNase Z酶进行切割。
通过这种方式，GTR-CRISPR系统可以在一个转录本中表达多个gRNA，从而实现同时编辑多个基因的目的。
刘子鹤团队在2019年首次报道了GTR-CRISPR系统，并将其应用于酿酒酵母的基因组改造。
他们证明了该系统可以以高达87%的效率同时敲除8个基因，是目前已发表的在酿酒酵母中编辑效率最高和数目最多的基因编辑体系。
他们还开发了一种更快捷的GTR-CRISPR系统，跳过大肠杆菌质粒构建步骤，直接将质粒组装反应液和修复DNA共转酿酒酵母，可实现3天一次性编辑6个基因，效率达到60%，这是已报道的最快的多位点编辑系统。
他们利用该快速系统来简化酵母脂质代谢网络，仅在10天内就完成了对8个基因删除，提高了游离脂肪酸产量约30倍。
GTR-CRISPR系统是现有酿酒酵母基因编辑方法的宝贵补充，能够快速改造酿酒酵母基因组，提高性状和产量。
该系统也可以推广到其他生物体中，为多基因编辑提供了一种有效的策略。
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基因敲除技术改造工业酿酒酵母菌株
亚硫酸盐是食品及啤酒行业普遍采用的抗氧化剂，在啤酒酿造过程中能与醛类物质发生加成反应而起稳定风味的作用。
作为抗氧化剂主要是由于亚硫酸盐能够结合氧而产生无毒害影响的硫酸根离子。
作为风味稳定剂主要是由于亚硫酸盐能够与含醛类化合物结合产生不挥发性的亚硫酸盐加成物，减少了啤酒中游离醛类物质的含量。
然而啤酒酿造过程中形成的亚硫酸盐被亚硫酸盐还原酶还原而不能在啤酒
中积累，故其在发酵液中含量一般较低，不能起到稳定啤酒风味的作用。
啤酒中亚硫酸盐有多种来源，然而两个主要来源是发酵过程中酵母代谢产生的和在啤酒瓶装或罐装前外加进的。
硫酸盐进入酵母细胞后，在ATP-硫酸化酶的催化下，
首先被三磷酸腺苷活化，经过一系列酶促反应后，变为亚硫酸盐。
亚硫酸盐是中间产物，其进一步被亚硫酸盐还原酶还原后，形成硫化氢。
亚硫酸盐能与啤酒中主要的老化物质羰基化合物通过复杂的反应，生成对风味稳定性无影响的较稳定的复合物，能够延长啤酒的保鲜期。
酿酒酵母的met10基因编码了一个115kD的亚硫酸盐还原酶必需的多肽，它可能是亚硫酸盐还原酶的亚单位，缺失met10基因的酿酒酵母在发酵过程中亚硫酸盐的含量可能会大幅度提高，亚硫酸盐作为一种抗氧化剂，在啤酒中含量增加对啤酒的稳定性有利，用此种酵母生产的啤酒的风味稳定性比用常规酵母高得多。
可以避免在发酵完毕时，添加抗氧化剂亚硫酸盐，而引起生成较多的H2S。
影响啤酒质量的诸多因素中，酵母菌种的好坏起着至关重要的作用，可以说酵母是啤酒的灵魂。
高质量的啤酒当然需要性能优良的酵母菌种，酿酒酵母是最早人类认识和利用微生物之一。
几个世纪以来，酿酒酵母被用于食品和酒精饮料
生产，如今它也被应用于制药、表达异源蛋白等不同行业中。
酿酒酵母因其不表达内毒素而不具致病性，使得其被分类为GRAS (Gene- rally Regarded As Safe)生物，其在工业上大规模的被用于生产面包、酒精和啤酒。
在选育菌种时，不论是为了改进工艺或是提高某一方面的质量，都应保证原啤酒酵母的优良酿造特性不变。
为了达到这一目的，采用基因工程是最有效的，也是最理想的方法。
其中基因敲除(gene knock-out)是通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，精细地定点修饰和改造基因DNA片段的技术。
具有位点专一性强、打靶后目的片段可以与染色体DNA共同稳定遗传的特点，基因敲除技术早在20世纪70年代就在酿酒酵母(S.cerevisiae)中得以应用。
采用PCR产物来直接实现基因敲除的方法是近年发展起来的新技术，这种方法是首先用PCR法构建一个两端带有需敲除基因同源序列的抗性基因，再用PCR产物直接转化受体细胞，外源基因上的同源序列通过同源重组来实现基因敲除，利用抗性基因来筛选转化子。
应用LFH-PCR法构建的含有同源序列的外源基因片段，可使得抗性基因两端同源序列变得很大(300-800bp)，以便能更高效的实现基因敲除。
2005年，山东大学微生物实验室通过LFH-PCR对工业酿酒酵母中met10基因进行敲除来提高啤酒中亚硫酸盐含量以稳定啤酒的风味并延长啤酒保质期。
实验室首先用LFH- PCR法从质粒pFA6a- knaMX4及酿酒酵母染色体上构建了两端带有酿酒酵母met10基因同源序列的具有G418抗性的外源基因片段。
利用完整细胞转化法将构建的外源基因片段导入工业酿酒酵母细胞内，外源基因片段通过同源重组而整合于酿酒酵母染色体，破坏酿酒酵母met10基因，通过特定的抗性筛选而得到met10基因敲除菌株。
然后通过摇瓶试验证实了met10基因敲除菌株与原始菌株在不同培养基中的生长特性没有差异。
说明met10基因敲除菌株没有生长劣势，不会导致生产周期的延长。
又进行1000L发酵罐发酵试验，但该试验只涉及啤酒生产的主发酵期，没有进行后发酵及贮酒过程。
此项试验主要是基因敲除菌株与原始菌株的生长及发酵性能的监测与比较，通过比较来确定来基因敲除菌株的生长及发酵性能是否具有优越性或者不足。
试验证实：met10基因敲除菌株呼吸强度、降糖速度强于原始菌株，但还原双乙酰的能力弱于原始菌株，met10基因敲除菌株发酵周期短于原始菌株且发酵性能略好于原始菌株；met10基因敲除菌株酿造的啤酒中乙醛等醛类物质含量低于原始菌株酿造的啤酒中含量而醇类物质含量略高，说明啤酒中醛类物质可能还原的较为充分而利于啤酒的贮藏。
最后通过100吨发酵罐试验及贮藏试验（包括了啤酒生成的全过程，检测的成份是成品啤酒中相应的成份）通过检测基因敲除菌株酿造的成品啤酒成份含量，来确定基因敲除菌株是否达到了预期的目的及应用工业生产的可能性。
证实了met10基因敲除酿造的未加外源亚硫酸盐的啤酒可能能贮藏较长的时间。
啤酒的风味稳定性是指啤酒罐装后，酒的风味长期不变的可能性。
实际上，啤酒罐装后，在保存过程中，风味是不断变化着的。
开始时出现黑栗子味，随即消失，而后出现甜味、面包味、焦糖味、奶酪味，严重时则出现纸板味和金属腥味等，同时口感也变得粗、涩、后苦。
这一切风味上的变化，习惯上称之为氧化味、老化味或败坏味。
啤酒的老化是啤酒行业面临的严重问题，它直接关系到啤酒的销售及企业的效益。
因此如何解决啤酒的氧化问题已成为国内外研究的重点。
为了提高啤酒的口味稳定性，生产中常常在制麦汁和滤酒时添加亚硫酸氢钠、亚硫酸、液态SO2等，添加量不超过20ppm，最好在8- 10ppm，可提高成品啤
酒亚硫酸盐含量1- 2ppm。
亚硫酸盐含量小于10ppm，不会引起不愉快的气味，过量则会产生硫的口味。
大量啤酒研究人员认为：包装啤酒中亚硫酸盐含量在
8-9ppm对啤酒风味稳定性是最合适的。
由于亚硫酸盐对健康影响的缘故，其含量受到严格检查。
欧洲对食品添加剂中二氧化硫含量限度是：瓶装啤酒中总二氧化硫含量≦20ppm，桶装啤酒中总二氧化硫含量≦30ppm。
而美国市场，整个二氧化硫的法定最高含量为10ppm。
目前预防啤酒老化有多种措施，其中最理想的措施之一就是构建具有能增加啤酒中亚硫酸盐含量的酿酒酵母菌株。
酿酒酵母met10基因编码亚硫酸盐还原酶的α亚基，利用基因敲除技术改造后的酿酒酵母其met10基因部分或完全消除，使亚硫酸盐还原酶失活，亚硫酸盐不能进一步还原，而在发酵液中得以累积，作为抗氧化剂及风味稳定剂，从而延长啤酒的保鲜期。
酿酒酵母的met10基因敲除可能会使得酵母的生理活性发生一定的变化，其发酵性能可能比原始菌株更具有优越性，其酿造的啤酒更有利于保鲜期的延长，也可避免使用无机添加剂亚硫酸盐和其它抗氧化剂，不失为一种值得推广的安全可靠的方法。