基因敲除技术改造工业酿酒酵母菌株

基因敲除技术改造工业酿酒酵母菌株

亚硫酸盐是食品及啤酒行业普遍采用的抗氧化剂，在啤酒酿造过程中能与醛类物质发生加成反应而起稳定风味的作用。作为抗氧化剂主要是由于亚硫酸盐能够结合氧而产生无毒害影响的硫酸根离子。作为风味稳定剂主要是由于亚硫酸盐能够与含醛类化合物结合产生不挥发性的亚硫酸盐加成物，减少了啤酒中游离醛类物质的含量。

然而啤酒酿造过程中形成的亚硫酸盐被亚硫酸盐还原酶还原而不能在啤酒

中积累，故其在发酵液中含量一般较低，不能起到稳定啤酒风味的作用。啤酒中亚硫酸盐有多种来源，然而两个主要来源是发酵过程中酵母代谢产生的和在啤酒瓶装或罐装前外加进的。硫酸盐进入酵母细胞后，在ATP-硫酸化酶的催化下，

首先被三磷酸腺苷活化，经过一系列酶促反应后，变为亚硫酸盐。亚硫酸盐是中间产物，其进一步被亚硫酸盐还原酶还原后，形成硫化氢。亚硫酸盐能与啤酒中主要的老化物质羰基化合物通过复杂的反应，生成对风味稳定性无影响的较稳定的复合物，能够延长啤酒的保鲜期。

酿酒酵母的met10基因编码了一个115kD的亚硫酸盐还原酶必需的多肽，它可能是亚硫酸盐还原酶的亚单位，缺失met10基因的酿酒酵母在发酵过程中亚硫酸盐的含量可能会大幅度提高，亚硫酸盐作为一种抗氧化剂，在啤酒中含量增加对啤酒的稳定性有利，用此种酵母生产的啤酒的风味稳定性比用常规酵母高得多。可以避免在发酵完毕时，添加抗氧化剂亚硫酸盐，而引起生成较多的H2S。

影响啤酒质量的诸多因素中，酵母菌种的好坏起着至关重要的作用，可以说酵母是啤酒的灵魂。高质量的啤酒当然需要性能优良的酵母菌种，酿酒酵母是最早人类认识和利用微生物之一。几个世纪以来，酿酒酵母被用于食品和酒精饮料

生产，如今它也被应用于制药、表达异源蛋白等不同行业中。酿酒酵母因其不表达内毒素而不具致病性，使得其被分类为GRAS (Gene- rally Regarded As Safe)生物，其在工业上大规模的被用于生产面包、酒精和啤酒。

在选育菌种时，不论是为了改进工艺或是提高某一方面的质量，都应保证原啤酒酵母的优良酿造特性不变。为了达到这一目的，采用基因工程是最有效的，也是最理想的方法。其中基因敲除(gene knock-out)是通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，精细地定点修饰和改造基因DNA片段的技术。具有位点专一性强、打靶后目的片段可以与染色体DNA共同稳定遗传的特点，基因敲除技术早在20世纪70年代就在酿酒酵母(S.cerevisiae)中得以应用。

采用PCR产物来直接实现基因敲除的方法是近年发展起来的新技术，这种方法是首先用PCR法构建一个两端带有需敲除基因同源序列的抗性基因，再用PCR产物直接转化受体细胞，外源基因上的同源序列通过同源重组来实现基因敲除，利用抗性基因来筛选转化子。

应用LFH-PCR法构建的含有同源序列的外源基因片段，可使得抗性基因两端同源序列变得很大(300-800bp)，以便能更高效的实现基因敲除。

2005年，山东大学微生物实验室通过LFH-PCR对工业酿酒酵母中met10基因进行敲除来提高啤酒中亚硫酸盐含量以稳定啤酒的风味并延长啤酒保质期。

实验室首先用LFH- PCR法从质粒pFA6a- knaMX4及酿酒酵母染色体上构建了两端带有酿酒酵母met10基因同源序列的具有G418抗性的外源基因片段。利用完整细胞转化法将构建的外源基因片段导入工业酿酒酵母细胞内，外源基因片段通过同源重组而整合于酿酒酵母染色体，破坏酿酒酵母met10基因，通过特定的抗性筛选而得到met10基因敲除菌株。

然后通过摇瓶试验证实了met10基因敲除菌株与原始菌株在不同培养基中的生长特性没有差异。说明met10基因敲除菌株没有生长劣势，不会导致生产周期的延长。又进行1000L发酵罐发酵试验，但该试验只涉及啤酒生产的主发酵期，没有进行后发酵及贮酒过程。此项试验主要是基因敲除菌株与原始菌株的生长及发酵性能的监测与比较，通过比较来确定来基因敲除菌株的生长及发酵性能是否具有优越性或者不足。试验证实：met10基因敲除菌株呼吸强度、降糖速度强于原始菌株，但还原双乙酰的能力弱于原始菌株，met10基因敲除菌株发酵周期短于原始菌株且发酵性能略好于原始菌株；met10基因敲除菌株酿造的啤酒中乙醛等醛类物质含量低于原始菌株酿造的啤酒中含量而醇类物质含量略高，说明啤酒中醛类物质可能还原的较为充分而利于啤酒的贮藏。最后通过100吨发酵罐试验及贮藏试验（包括了啤酒生成的全过程，检测的成份是成品啤酒中相应的成份）通过检测基因敲除菌株酿造的成品啤酒成份含量，来确定基因敲除菌株是否达到了预期的目的及应用工业生产的可能性。证实了met10基因敲除酿造的未加外源亚硫酸盐的啤酒可能能贮藏较长的时间。

啤酒的风味稳定性是指啤酒罐装后，酒的风味长期不变的可能性。实际上，啤酒罐装后，在保存过程中，风味是不断变化着的。开始时出现黑栗子味，随即消失，而后出现甜味、面包味、焦糖味、奶酪味，严重时则出现纸板味和金属腥味等，同时口感也变得粗、涩、后苦。这一切风味上的变化，习惯上称之为氧化味、老化味或败坏味。啤酒的老化是啤酒行业面临的严重问题，它直接关系到啤酒的销售及企业的效益。因此如何解决啤酒的氧化问题已成为国内外研究的重点。

为了提高啤酒的口味稳定性，生产中常常在制麦汁和滤酒时添加亚硫酸氢钠、亚硫酸、液态SO2等，添加量不超过20ppm，最好在8- 10ppm，可提高成品啤

酒亚硫酸盐含量1- 2ppm。亚硫酸盐含量小于10ppm，不会引起不愉快的气味，过量则会产生硫的口味。大量啤酒研究人员认为：包装啤酒中亚硫酸盐含量在

8-9ppm对啤酒风味稳定性是最合适的。由于亚硫酸盐对健康影响的缘故，其含量受到严格检查。欧洲对食品添加剂中二氧化硫含量限度是：瓶装啤酒中总二氧化硫含量≦20ppm，桶装啤酒中总二氧化硫含量≦30ppm。而美国市场，整个二氧化硫的法定最高含量为10ppm。

目前预防啤酒老化有多种措施，其中最理想的措施之一就是构建具有能增加啤酒中亚硫酸盐含量的酿酒酵母菌株。酿酒酵母met10基因编码亚硫酸盐还原酶的α亚基，利用基因敲除技术改造后的酿酒酵母其met10基因部分或完全消除，使亚硫酸盐还原酶失活，亚硫酸盐不能进一步还原，而在发酵液中得以累积，作为抗氧化剂及风味稳定剂，从而延长啤酒的保鲜期。酿酒酵母的met10基因敲除可能会使得酵母的生理活性发生一定的变化，其发酵性能可能比原始菌株更具有优越性，其酿造的啤酒更有利于保鲜期的延长，也可避免使用无机添加剂亚硫酸盐和其它抗氧化剂，不失为一种值得推广的安全可靠的方法。