引物合成常见问题分析

引物合成常见问题分析

引物1合成中常见问题的分析。应该合成多少脱氧寡核苷酸？

一般来说，20BP 2 OD引物可进行400-500个50ul标准聚合酶链反应和2000-2500个测序反应因此，2 OD的脱氧核糖核酸的量足以进行一般的实验工作。如果进行基因剪接或退火后再连接，1 OD就足够了，无论是PAGE纯化还是HPLC纯化，每次增加纯化量都会大大降低产品的纯度因此，为了保证产品的质量，我们通常将净化量控制在每次2 OD左右。

如何确定引物的光密度值:

DNA的量与260纳米处的吸光度值(光密度值)成正比，因此用紫外分光光度计定量是最科学的，测定时溶液的光密度最好稀释到0.2-1.0。当测定OD值时，分光光度计上显示的值是每毫升溶液的OD值。

例如，你得到一管引物DNA干粉，用1毫升水将其溶解在母液中。将50微升母液稀释至1微升，并在1微升标准试管中测量吸光度至0.25，表明50微升含有0.25脱氧核糖核酸，也就是说，最初的1微升母液含有5脱氧核糖核酸

2。如何检测寡脱氧核糖核酸的纯度？

实验室检测更方便的方法是聚丙烯酰胺凝胶电泳一般情况下，16%聚丙烯酰胺凝胶加7M尿素用于电泳，20%凝胶用于小于12bp的短

链，12%凝胶用于大于60bp的引物取0.2-0.5分钟的引物，用尿素饱和溶液溶解或向引物溶液中加入尿素干粉至饱和，在装载前加热变性(95℃，2分钟)在600伏电压下进行电泳，在一定时间后(约2-3小时)将凝胶剥离。荧光薄层板在紫外灯下观察。主带下未发现杂质带，表明纯度良好。如果条件允许，也可以用银染法染色。

3。为什么用3%琼脂糖凝胶电泳合成的寡核苷酸产物中有许多条带？

由于寡脱氧核糖核酸是单链脱氧核糖核酸，很容易形成复杂的三维结构，所以在进行琼脂糖电泳时，很容易出现多个泳带(更不用说琼脂糖电泳定量)寡核苷酸的电泳必须使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，琼脂糖电泳不能充分区分小的单链DNA引物。此外，在紫外灯下观察到荧光薄层板，主带下没有杂质带，表明纯度良好。如果条件允许，也可以用银染法染色。

4。琼脂糖电泳后的EB染色发现条带较弱。寡脱氧核糖核酸的数量不足吗？

EB通过嵌入核酸的双螺旋结构而着色，而合成的DNA是单链的，只能通过形成局部发夹结构或其它双螺旋结构来染色由于不同引物的

碱基组成不同，形成二级结构的可能性不同，EB的染色程度也不同。

例如，寡糖(dT)等不形成二级结构，EB染色效果非常差所以不要用电子束染色法进行定量，而是用紫外分光光度计进行检测，或者用上述聚丙烯酰胺凝胶电泳在紫外灯下用荧光薄层板进行观察，或者用银染法。

5。进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时，为什么长度完全相同的寡核苷酸不在同一位置？

◆A、G、C、T有不同的组成和电泳速度。◆DNA具有不同的三维结构和电泳速度。寡核苷酸越短，

越容易发生，长链寡核苷酸之间的差异越小。

6。合成引物聚合酶链反应后无目的条带的原因是什么？

聚合酶链反应失败的原因很多，可以从以下几个方面考虑◆引物和模板是否匹配；

◆引物本身是否具有三维结构，或者两个引物之间是否形成高级结构；◆聚合酶链反应试剂是否正常；◆聚合酶链反应仪工作是否正常；

◆聚合酶链反应条件是否合适；◆底漆设计是否有问题；

如果一切正常，问题无法解决，可能是引物合成的问题。我们可以免费重新合成引物。如果再合成不成功，这可能不是引物的问题(如果合成两次不成功，将收取费用)

7。在确定寡核苷酸的外径值后，发现A260/A280