细菌的遗传分析

Question
• 我们已知在F＋×F－杂交中，几乎所有F－细菌变 为F＋, F＋×F－→F＋;
• 而在Hfr ×F－杂交中，尽管出现高频重组，但F－ 细菌很少转变为F＋细菌。这个问题使遗传学家感 到迷惑不解。？
中断杂交实验 (Interrupted-mating experiment）
Wollman 和 Jacob进行中断杂交实验:
细菌的遗传分析
概述
• 细菌、放线菌和蓝细菌等均属于原核生物(prokaryotes)。 • 主要特征：没有核膜，其核基因组是由一个裸露的环状
DNA分子构成，称为拟核。细胞内没有以膜为基础的 细胞器，也不进行典型的有丝分裂和减数分裂。 • 细菌是单细胞生物，结构简单，繁殖能力强，分布广， 世代周期短，个体数量多，在正常条件下，完成一个世 代仅20 min， 较容易诱变和筛选各类型突变。 • 细菌不仅是许多病毒的宿主细胞，而且有自身的遗传特 性，又易于培养建立纯系，长期保存，成为遗传学研究 的常用实验材料。
Hfr ： thr+ Leu+ azir tonr Lac+ gal+ strs ×
F- ：thr－ Leu－ azis tons Lac－ gal－ strr
azi：叠氮化钠； ton：噬菌体T1； str：链霉素； Lac：乳糖； gal：半乳糖
结果发现Hfr的未选择性标记基
因进入F－所需时间： • 9分钟时：
细菌的细胞结构：简单 (原核生物） • 基本结构: 细胞壁 (cell wall), 细胞膜 (cell membrane)； 拟核 ( nucleoid )，核糖体 (ribosome), 细胞质 (cytoplasm)，内含物等；
• 特殊结构: 一定条件下具有的结构 e.g. 荚膜 (capsule) 和鞭毛 (flagella)
通过供体与受体之间的接触而传递DNA； •转化（transformation）
游离的细菌DNA片段被吸收到细菌细胞内； •转导（transduction）
指一种细菌的DNA片段经过噬菌体传递给另一种细菌。
接合（Bacterial conjugation）
• 经细菌细胞的直接接触，把一个细胞（供体）的遗传 物质传递给另一个细胞（受体），从而实现遗传重组。
3）抗性突变型（resistant mutants）
•对噬菌体的抗性突变往往是以某种方式改变细菌的膜蛋白， 而使得噬菌体不能吸附或吸附在这种突变细菌上的能力降低。 •对抗生素产生抗性的突变是一个严重的公害问题，所以究 得较深入，且细菌对各种抗生素的抗性机制各不相同。
e.g. 对T1噬菌体抗性表型以T1r表示，对T1噬菌体敏感 (sensitive)表型则以T1S表示；对链霉素(streptomycin) 抗性表型以Strr，对链霉素敏感型以Strs表示。
• 营养型突变的筛选： e.g. 选择氨基酸营养缺陷型 1）处理过的细菌涂布在含20种氨基酸的培养基上； 2）待菌落出现后，用印迹法影印到基本培养基，鉴定； 3）从母版上选择的克隆，培养在缺失某种氨基酸的培养基，判定。
细菌的遗传分析
细菌的遗传重组可以通过三种途径来实现： •接合（conjugation）
• 接合能传递大段的DNA，在细菌的遗传重组中效率最高。
细菌经典的杂交实验
不同营养缺陷型的菌株：
A菌株：met- bio- thr+ leu+thi+ ， B菌株：met+ bio+ thr- leu-thi-，
•A和B是营养缺陷型，不 能在基本培养基上生长。 •A+B菌株混合培养，在培 养基上，涂布基本培养基， 长出原养型菌落。
高频重组（high frequency of recombination, Hfr）:
在E.coli 的F因子整合进细菌染色体的雄性细胞，当F因子促 进与雌性细胞（F－）接合时，雄性细菌的基因高频率地转移 到雌性细胞中, 叫高频重组。
带有一个整合的F因子的细胞叫做高频重组细胞：Cavalli和 Hayes先后从能育的A(F＋)品系中分离出了两个新的品系,它 们和菌株B（F－）杂交时，出现的重组体频率很高，通常比 A F＋×B F－杂交组合高出一千倍，这个新菌株叫做 Hfr菌株。
met
bio+）进入另一个品系的细胞，
因为这种转化作用而产生了上述的营养型？
1950年Davis：U型管实验，有力的支持了细菌菌株杂交的判断。
Conclusion：
要有原养型细 胞的形成，两 个菌株间的直 接接触必不可少。
Explanation
Lederberg根据实验，认为上述原养型是两个亲本基因的重组体。 在E.coli 中基因重组经一系列步骤进行： • 细胞融合：亲本细胞的遗传物质经过融合形成二倍体合子； • 遗传物质发生交换的合子经过减数分裂产生了带有重组基 因的子代细菌。 • 实质：在两个亲本细菌之间，就象真核细胞的有性过程一样， 发生了杂交和遗传物质的交换，产生了基因重组体。
有少量叠氮化物抗性的菌落，少数
azir 基因进入F -细胞。但对T1菌噬
9'
体敏感，tonAr基因还未进入F-细胞
11'
• 11分钟时： 出现抗菌噬体T1的F-细菌。
18'
• 18和25分钟时：
分别出现乳糖和半乳糖发酵基因，
即lac+和galb+进入F-细胞。
25'
从下图可以看到，从Hfr菌株的基因在F－细菌中出现开始， 随着时间的推移，具有这一基因的菌落逐渐增加，直到某 一百分数为止；出现的时间愈早，它所达到百分数也愈高。
用基因符号图解表示：
•E.coli 遗传物质的单方向(one-way)转移：上述的解释 虽然比较正确，但其中有一点却被Hayes的一个意外发 现所否定。
e.g.两个亲本类型对后代的遗传贡献并不相等，有些 亲本基因的组合会在后代出现，有一些则不会出现， 而且所有后代中出现的基因都是连锁的，因此，E.coli 的有性过程应该是异宗配（heterothallic）。 证明： E.coli遗传物质的传递方式与具有典型减数分裂
• 如果让Hfr F+ ×F－杂交 继续进行，长达二小时， 然后使之中断，发现某些F－受体转变为Hfr F+，这说明 Hrf F＋的全部基因已转移完毕，排在最后的F因子最后 转移到受体，使它成为供体，但效率很低，是线性染色 体的最后 一个单位，可得下图：
Question?
• 这种与亲代不同的能在基本培养基上生长的细菌不一定
是基因型的改变，可能是培养上的互补，即一些物质从
一个品系的细胞中泄漏出来而被另一个品系的细胞所吸
收呢？
• 还是另一种可能，是基因型的改变，但不一定是由于两
个品系间的杂交，而是一个品系的DNA片段逸出细胞后，
携带着相应的基因（如
+
原养型重组体
③A × streptomycin处理B MM
无原养型重组体产生
证明：这是单向的遗传物质转移。
F因子（Fertility factor） 1953年，Hayes获得证据：
E.coli 的遗传交换仅供体细胞→受体细胞。 E.coli 两个品系间遗传物质的转移是通过 一个Sex factor F 因子介导实行。 供体细胞有F因子→F＋ ，受体细胞缺乏F因子→F－ 现在已经证实F因子是一种质粒（plasmid），能够 自我复制的环状DNA分子，作用像一个微型染色体 （minichromosome），包含约接近100个基因。 F因子结构包含3个区域:
“ 拟核”区域中，这种结构有利于外源DNA的插入。 拟核结构 (nucloid)
• 有些细菌还含有小的，可自我复制的环状DNA分子， 被称为质粒。
大肠杆菌基因组DNA在松弛状况：1 300 μm，而要装入 一长2μm、宽1 μm的细胞中，是其细胞长度的1000倍， 必须压缩最少1000倍后才能装入细胞中，对拟核成分分 析表明，DNA占80％，其余为RNA和蛋白质。
的生物不同。 •Hayes做了一个杂交实验，用的品系与Lederbery用的相似。
品系A：met－thr+ Leu+ thi+ (Donor) male
品系B：met+ thr－Leu－thi(Receptor) female
① Streptomycin 处理 A × B MM
原养型重组体
② 对照 A × B MM
细菌的培养与突变型筛选
细菌突变型的筛选——影印法
黎德伯格等(Lederberg J. 1952)设计
Lederberg J., 1958 Nobel奖获得者， 发现细菌转导和接合
细菌的培养与突变型筛选
• 糖发酵性突变株Lac-选择： 伊红-美蓝培养基，Lac+紫色，Lac-白色菌落；
• 抗性突变选择： 直接涂布到含有某种噬菌体或抗生素的培养基，形成菌落；
1)原点 (origin)
2) 致育基因 (fertility gene)
3)配对区(pairing region)
F 因子的重要性质： 1）F因子能够复制它的DNA(a); 2）携带F因子的细胞产生伞毛（pilin）(b); 3）F＋细胞能够转移新合成的环状F基因
组拷贝到受体细胞（ F－) (c)。 F＋×F－→F＋
4）F＋细胞通常阻止与另一个F＋细胞 接触，通常不转移F基因组到F＋细胞。
5）偶尔，F因子将自己整合进宿主细 菌染色体上(a)。出现这种情况后，F 因子也能与它自己的DNA一起转移宿 主染色体基因（标记）到受体细胞 (b)。
6）整合的F也能离开细菌染色体回到 细胞质中，少数情况下，脱离染色体 时，可以携带下寄主的少数基因，形 成环状的F。这种含有细菌染色体基 因的F因子叫做F’（F prime）因子， 带有lac基因的F’叫做F’(lac)。
➢ 若不同基因突变可能表现出相同的营养缺陷型表型, 那
么具有这些突变的细菌基因型则用小写斜体字母表示。
e.g.
-
metA
和
-
metB
突变是野生型基因
+
metA
和
metB
+突变
的等位基因。每个突变型的表型都是Met-，这是因为
metA+和metB +这两个基因都是甲硫氨酸合成必需的。
2）分解代谢功能的突变型（catabolic functional mutants）
e.g. azir 基因出现最早， 24分钟时达到90％的F－ 菌落；gal+基因出现最迟， 60分钟取样，仅30％的 菌落属于能利用型。
这说明上述四个基因在混合后24分钟内，以一定的顺序 和时间间隔，先后从Hfr F＋进入F－的细菌中去。
• 根据中断杂交技术，用杂交后Hfr基因最初在受体细菌 中出现的时间作为指标，可以作连锁图。这里距离的 单位是min，如ton在azi开始进入F－细胞后2min进入， 那么azi和ton相隔2单位。
结论：细菌的染色体以高度组装的形式存在。
大肠杆菌的突变类型
1）合成代谢功能的突变型 (anabolic functional mutants)
➢ 概念：野生型/原养型、营养缺陷型 （p157）
➢ 营养缺陷型细菌的命名：根据该菌株所不能合成的物质
命名，前三个字母，第一个大写；
-
e.g. Pur
purine （嘌呤）
• 野生型大肠杆菌能利用不同碳源，具有分解代谢功能。 • 降解功能的实现也需要许多有关基因的表达，其中任
何一个基因的突变都会影响降解功能的实现。 e.g. Lac－突变型不能分解乳糖，因此就不能生长在以乳
糖为唯一碳源的基本培养基中，而野生型Lac＋细 菌都能利用乳糖。 Lac－表型可能是因为lacZ＋或lacY＋基因发生突变， 分别产生了基因型为lacZ－或lacY－的突变型菌株。 这种菌株亦是条件致死突变型。
• 涂布和繁殖：每个细胞在较短时间 内能裂殖到107个子细胞成为肉眼可见 的菌落或克隆(clone)。
繁殖：双链环形DNA分子 随着细胞伸长而采取二分 分裂的方式分开。 世代时间短: 20 min繁殖 一代,容易得到生化突变型。
裸露的环状闭合DNA双链---细菌染色体 长度为250～35 000μm （p156），没有组蛋白和其 他蛋白质结合，也不形成核小体结构，位于细胞内的
细 菌 (bacteria)
细菌: 真细菌（eubacteria） e.g. 大肠杆菌 古细菌（archaebacteria）e. g. 詹氏甲烷球菌
存在：多种形态 球菌（cocci), 杆菌（bacilli ), 螺旋菌（sprilla）
大小： 随种类不同而异 杆菌一般长1～5 ㎛，宽0.5～1 ㎛； 球菌以直径大小表示，一般为0.5～1 ㎛； 螺旋菌则测量弯曲长度一般长为1～50 ㎛，直径为0.5～1 ㎛