地中海贫血基因检测试剂盒标准操作规程

1.目的：

本试剂盒用于定性检测α地中海贫血和β地中海贫血，可用于检测从人血液或血斑样本中获得的人基因组DNA中与地中海贫血相关的25个突变位点，包括19个β地中海贫血和6个α地中海贫血的突变位点。检测结果可以辅助临床诊断，也可用于流行病学调查、婚检及产前检测等领域。

2.责任人：

3.适用范围：

本标准化操作规程适用于晶芯®地中海贫血基因检测试剂盒（微阵列芯片法）整体解决方案操作使用的全过程。

4.PCR扩增：

4.1 设备与耗材

4.1.1 4℃/-20℃冰箱；

4.1.2 超净工作台2台（分别用于PCR体系配制和模板加样）；

4.1.3 微型高速离心机（Eppendorf，5424）；

4.1.4漩涡混合器；

4.1.5 PCR扩增仪（博奥生物集团有限公司，晶芯®E-Cycler TM96 PCR仪）；

4.1.6单道移液器（1000µl，200µl，20µl），8道移液器（10µl），灭菌枪头（1000µl，200µl，20µl）；

4.1.7 离心管架，96孔板，1.5ml离心管，PCR扩增管或八连排管（200µl）；

4.1.8 记号笔，手套（无粉乳胶，PE）；

4.1.9 75%酒精棉，废液缸和消毒液；

4.2 试剂

晶芯®地中海贫血基因检测试剂盒（微阵列芯片法）B部分中的扩增试剂A，B，C，D，

E以及PCR扩增酶试剂，阳性对照品（博奥生物集团有限公司）。

4.3 样本

人基因组DNA（提取方法详见干血斑基因组提取标准操作规程）。

4.4 实验前准备

4.4.1 打开超净台紫外灯照射20min，开风机15min后打开日光灯进行操作；

4.4.2 准备实验用品，包括PCR扩增试剂，离心管架，96孔板，移液器等；

4.4.3 从-20℃冰箱取出PCR扩增试剂及基因组DNA，室温融化，涡旋混匀后瞬时离心；

4.4.4 核对样本名称及数量，排好顺序，将样本的加样顺序记录下来。

4.5 操作过程

4.5.1 用75%酒精棉擦拭双手，超净台面，移液器，96孔板及离心管架；

4.5.2 按照加样顺序准备PCR反应管，并在管盖和管身同时做好相应标记；

4.5.3根据样本数目准备5倍数量的200µl PCR扩增管，在试剂准备区内，将融化后混匀的PCR 扩增试剂A、B、C 、D、E按17µl/管，分别分装到5个PCR 扩增管中。再分别向这5个PCR扩增管中加入3µl的PCR扩增酶试剂。

4.5.4 在模板加样区内，用75%酒精棉擦拭移液器、台面及双手，晾干后，向相对应的A、

B、C、D、E系列试剂中各加入5µl同一样本核酸溶液，混匀，按照地中海贫血基因检测PCR扩增程序进行PCR扩增；

4.5.5扩增：将PCR扩增管或八连排管置于PCR扩增仪中，按表2中的热循环程序进行PCR扩增反应；（扩增程序设定方法详见晶芯®E-Cycler TM96 PCR仪标准操作规程）

5.芯片杂交：

5.1 设备与耗材

5.1.1 4℃/-20℃冰箱；

5.1.2 芯片杂交仪（博奥生物集团有限公司，晶芯®BioMixer™ II）；

5.1.3芯片洗干仪（博奥生物集团有限公司，晶芯®SlideWasher TM）；

5.1.4杂交盒若干套（博奥生物集团有限公司，HybSet基因微阵列芯片杂交盒）；

5.1.5单道移液器（1000µl，200µl，20µl），灭菌枪头（1000µl，200µl，20µl）；8道移液器（10µl，200µl）；

5.1.6 离心管架，96孔板，1.5ml离心管、八连排管（200µl）；

5.1.7 磁力架和磁力板；

5.1.8 记号笔，75%酒精棉，废液缸；

5.1.9 手套（无粉乳胶，PE）；

5.1.10 15ml离心管。

5.2 试剂

5.2.1 晶芯®地中海贫血基因检测试剂盒（微阵列芯片法）A部分中的磁珠、结合液、芯片；B部分中的杂交液缓冲液和PCR扩增试剂A、B、C、D、E，以及阳性对照品（博奥生物集团有限公司）；

5.2.2 NaOH溶液（10 M），纯化水；

5.2.3 20×SSC、10% SDS（博奥生物集团有限公司）。

5.3 实验前准备

5.3.1提前打开杂交仪运行程序50℃预热（杂交程序设定方法详见晶芯®BioMixer II芯片杂交仪标准操作规程）；

5.3.2杂交液：从试剂盒B部分中取出杂交缓冲液（白色盖），50℃温浴使其完全融化；

5.3.3 变性液：根据需要量，用纯化水将NaOH 溶液（10 M）稀释100 倍，涡旋混匀得到变性液（0.1 M）（需每次新鲜配制）；

5.3.4芯片：第一次使用时提前从4℃取出，平衡至室温再使用，开封后室温保存。5.4 操作过程

5.4.1 清洁与准备

①用75%酒精棉擦拭实验台面双手，移液器，96 孔板及离心管架；

②按照样本数量准备相应的离心管，并在管身做好相应标记；

提示：以8份备检样本为例，需准备2个1.5ml离心管（分别配制磁珠及变性液）和5个200µl八连排管（用于放置产物，磁珠，变性液和杂交液）

5.4.2 磁珠的准备

以一份样本为例，涡旋振荡混匀磁珠与结合液，取离心管置于离心管架上，加入50µl

结合缓冲液，再加入磁珠20µl，静置磁力架上吸附15 s，去除溶液。将离心管撤离磁力架，再加入50µl 结合缓冲液，涡旋混匀。

5.4.3 磁珠纯化

①检测一人份需用2个离心管，分别在2个离心管上进行标注，1号管和2号管；在1 号管中加入A体系PCR产物10µl和B体系PCR产物10µl，混匀；在2号管中加入C体系PCR产物10µl、D体系PCR产物10µl和E体系PCR产物10µl，混匀。

②向1号管中加入5.4.2中制备好的磁珠悬液20µl，向2号管中加入5.4.2中制备好的磁珠悬液30µl，混匀后静置10 min，期间在静置5min后需用移液器进行一次吹吸，以防止磁珠沉积。然后，将产物-磁珠混合物置于磁力板上，吸附15 s，吸弃溶液，撤离磁力架。

③NaOH变性：再向1、2 管中分别加入新配制的0.1 M NaOH 60 µl，将聚集在离心管壁上的磁珠吹吸打散，充分混匀，静置10 min，期间在静置5 min后需用移液器进行一次吹吸，以防止磁珠沉积。然后，将离心管置于磁力板上，吸附15 s，吸弃溶液，撤离磁力板。

★变性期间，分装杂交液于一干净的八连排管中，每一人份需要杂交液120µl,分装时每份大于120µl备用。

5.4.4 杂交反应混合物准备

①向变性结束后的离心管中加入温浴后并充分混匀的杂交缓冲液40µl，对着管壁四周轻轻吹打，以去除干净管壁上残留的NaOH溶液，置磁力板上吸附15 s，吸弃溶液，撤离磁力板；

②向上述管中加入杂交缓冲液20µl，将聚集在离心管壁上的磁珠吹吸打散，充分混匀，准备杂交。

5.4.5 芯片杂交