酪氨酸酶的种类及分布
酪氨酸酶
酪氨酸酶概念：酪氨酸酶(EC 1．14．18．1)是一种含铜的氧化还原酶，它与生物体合成色素直接相关．（长的黑有很大的一部分原因在自己）在人体中，它与色素障碍性疾病及恶性黑色素肿瘤的发生与治疗有关（酪氨酸酶的分布与动物的生理功能息息相关，不同动物的酪氨酸酶在体内分布的部位不同．多数昆虫在正常生理状态下，酪氨酸酶以酶原的形式存在，不同类型的酪氨酸酶存在于昆虫的特定部位，以完成特定的生理功能．美洲蜚蠊存在于血红细胞内，而麻蝇则仅存在于血浆中，并且在表皮中主要以活化形式的酪氨酸酶存在．昆虫酪氨酸酶除参与黑色素的形成外还是唯一参与角质硬化的酶．昆虫高度硬化的角质能阻断微生物和异物的入侵，并为柔软的元脊椎动物身体提供了保护．在节肢动物中，酪氨酸酶还参与其他两种重要的生理过程——防御反应和伤口愈合．哺乳动物酪氨酸酶催化产生的黑色素被分泌进入到表皮和毛发的角质细胞中，使体表着色，从而起保护皮肤和眼睛、抵御紫外线的辐射和防止内部组织过热等作用．哺乳动物酪氨酸酶常见于黑素细胞中，黑素细胞是存在于皮肤，发囊和眼睛中并产生色素的高度特异性的细胞[1“]．酪氨酸酶功能减退或缺失时，即会影响黑色素代谢，从而发生疾病如白癫疯和白化病．动物与人的常染色体隐性疾病也与酪氨酸酶的缺失或活性下降有关．）作用机制：酪氨酸酶主要参与两个反应过程：催化L．酪氨酸羟基化转变为L-多巴和氧化L-多巴形成多巴醌，多巴醌经一系列反应后，形成黑色素，与人体雀斑、褐斑等黑色素过度沉积等疾病的发生有关，并与昆虫的蜕皮（蝉蜕可以入药）和（苹果）果蔬的褐化有很大关系（黑色素生物合成过程可大体分为两个阶段，第一阶段是由酪氨酸酶催化酪氨酸被羟化反应形成L_3，4一二羟基丙氨酸(L_多巴)(单酚酶活性)，并进步将L_多巴氧化生成多巴醌(二酚酶活性)。
这两步反应都是由酪氨酸酶催化的，酪氨酸酶在这里显示了独特的双重催化功能．第二阶段从多巴醌(DOPAqui—non)为原料从两个不同途径分别生成真黑素和褪黑素的过程．真黑素生成，多巴醌经多聚化反应等一系列反应生成无色多巴色素，极不稳定的无色多巴色素被另一分子多巴醌氧化为多巴色素，多巴色素经异构、脱羧生成5，6一二羟基吲哚(DHI)，5，6一二羟基吲哚(DHI)由酪氨酸酶催化氧化为真黑色素的前体吲哚一5，6一醌(IndQu)；褪黑素生成，多巴醌(DOPAquinon)与半胱氨酸(Cys)反应生成产生5-Cys一多巴及5-Cys一多巴醌，然后成环、脱羧变成苯肼噻嗪的衍生物，最后形成褪黑素．在第二阶段，只有少数几步反应由酪氨酸酶、异构酶或金属离子催化，大部分反应都是自发的，因此酪氨酸酶是整个黑色素生成反应的限速酶，第一阶段的两步反应是限速步骤．）活性中心：酪氨酸酶的活性中心是由两个含铜离子位点构成．在催化过程中，双核铜离子位点以3种形态存在，分别是氧化态、还原态和脱氧态．研究表明与酪氨酸酶结合的双核铜离子活性中心与在血蓝蛋白中发现的活性中心非常相似、白化病概念：白化病是由黑色素合成相关基因突变导致黑色素沉着减少或缺失引起的一类遗传性疾病的总称。
酪氨酸酶的固定化及其对水中酚类物质的去除
酪氨酸酶的固定化及其对水中酚类物质的去除摘要本文制备了不同质量比的壳聚糖/有机累托石插层复合物（CTS/OREC），并以CTS/OREC为载体通过吸附法和交联法固定酪氨酸酶。
结果表明，吸附法固定化酶（A-TYR）的最佳条件为以壳聚糖/有机累托石质量比4:1的插层复合物为载体，pH值5.0，酶与载体质量比30 mg/g，固定化时间6h，制备得固定化酪氨酸酶的载酶量为17.30mg/g，单位载体酶活为11.67kU/g，酶活回收率87.9%；戊二醛交联法固定化酶（C-TYR）的最佳条件为以壳聚糖/有机累托石质量比为4:1的插层复合物为载体，pH值4.0，酶与载体质量比30 mg/g，固定化时间4 h，制备得固定化酪氨酸酶的载酶量为26.52mg/g，单位载体酶活为6.14kU/g，酶活回收率29.7%。
固定化酶比游离酶有更好的操作稳定性和储存稳定性。
4℃储存20天后A-TYR相对酶活为63.9%，C-TYR相对酶活为89.6%。
A-TYR去除苯酚的最佳反应条件为pH 7.0、温度40℃；A-TYR去除4-氯酚的最佳反应条件为pH 5.0、温度30℃；A-TYR去除2,4-二氯酚的最佳反应条件为pH 6.0、温度30℃。
A-TYR在最佳条件下完全去除苯酚、4-氯酚和2,4-二氯酚时的最佳酶与底物质量比分别为3.50mg/mg、1.38mg/mg、1.38mg/mg。
关键词：酪氨酸酶；固定化；壳聚糖；累托石；插层复合物；酚Immobilization of tyrosinase and removal of phenoliccompounds in waterAbstractIn this paper, different mass ratio of chitosan (CTS) and organic rectorite (OREC)was used to prepared intercalation composite(CTS/OREC) and CTS/ORECwith mass ratio of 4:1 was used as a carrier to immobilize tyrosinase through adsorption and cross-linking method. The optimal immobilization condition of tyrosinase for adsorption (A-TYR)was pH5, the mass ratio of enzyme to support 30 mg/g, immobilization time 6 h. In this condition, the protein loading yield of A-TYRwas 17.30mg/g, enzyme activity of the unit support 11.67kU/g, and activityrecovery 87.9%. The optimal immobilization condition of tyrosinase for glutaraldehyde cross-linking (C-TYR)was pH4, the mass ratio of enzyme to support 30 mg/g, immobilization time 4 h. In this condition, the protein loading yield of C-TYR was26.52mg/g,enzyme activity of the unit support 6.14kU/g, and activity recovery 29.7%. The immobilized tyrosinase retained higher relative activity when the temperature and pH value changed, compared with the free enzyme. The immobilized tyrosinase have batter storage stability than the free enzyme, the A-TYRand C-TYR still retained 63.9%and 89.6%relative activity, respectively,even after 20 days stored in 4℃. A-TYR was used to removephenol, 4-chlorophenoland 2,4–dichlorophenol, the removal ratio can reach 100% when the mass ratio of enzyme to substrate is 3.50mg/mg,1.38mg/mg,1.38mg/mg, respectively.Key words: tyrosinase; immobilization; chitosan; rectorite; intercalation composite material; phenolic compounds目录1.前言1.1酚类化合物的性质 (1)1.2酚类化合物的处理方法 (1)2.实验材料及方法2.1 实验试剂 (3)2.2 实验仪器 (3)2.3 累托石的有机化 (3)2.4 壳聚糖/有机累托石插层复合物的制备 (3)2.5 壳聚糖/有机累托石插层复合物的结构表征 (4)2.6 酪氨酸酶的固定化 (4)2.6.1 吸附法 (4)2.6.2 交联法 (4)2.7 酪氨酸酶活性的测定 (4)2.7.1酶活单位及相对酶活的定义 (4)2.7.2酶活回收率及载酶量的测定 (5)2.8 酚的去除 (5)3.结果与讨论3.1壳聚糖/有机累托石插层复合材料的结构表征 (6)3.2酪氨酸酶的固定化 (8)3.2.1正交试验 (8)3.2.2单因素筛选 (10)3.2.3 酪氨酸酶固定化的最佳条件及固定化酶活力参数 (13)3.2.4 固定化酪氨酸酶的性质 (14)3.3酚的去除 (20)3.3.1 正交试验 (20)3.3.2单因素对酚的去除的影响 (21)3.3.3 A-TYR对酚去除的重复使用性 (24)4.结论 (25)5.不足与展望 (26)6.参考文献 (27)7.致谢 (29)1.前言1.1酚类化合物的性质酚是十分重要的化工原料之一，在炼油、焦化、印染、制药等产业中有着广泛的应用。
L-酪氨酸的酶法合成及分析
五、工艺路线
工艺路线一 • L-酪氨酸是目前仍采用酸水解法生产的少 数氨基酸之一，收率低，环境污染严重， 应用酶法取代水解法生产L-酪氨酸具有重 要的应用价值。用TPL合成L-酪氨酸，首先 开展的工艺是丙酮酸路线。 • Para等将包埋于聚丙烯酰胺凝胶中的 C．intermiedius固定化细胞作为催化剂， 分批添加底物，建立75mmol/L丙酮酸钠、 45mmol/L硫酸铵、45mmol/L氯化铵和 55mmol/L苯酚的转化体系，反应5h后可积 累L-酪氨酸10g/L。若将反应体系置于连续 的柱反应器内，苯酚对L-酪氨酸的转化率 达90%，且稳定性可维持5d。
试样制备： • 1. 高氯酸滴定液（0.1mol/L） • 配制：取无水冰醋酸（按含水量计算，每1g水加醋酐 5.22mL）750mL，加入高氯酸（70~72%）8.5mL，摇匀， 放冷，加无水冰醋酸适量使成1000mL，摇匀，放置24 小时。若所测供试品易乙酰化，则须用水分测定法测 定本液的含水量，再用水和醋酐调节至本液的含水量 为0.01%~0.2%。 • 标定：取在105℃干燥至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾 约0.16g，精密称定，加无水冰醋酸20mL使溶解，加 结晶紫指示液1滴，用本液缓缓滴定至蓝色，并将滴 定结果用空白试验校正。每1mL高氯酸滴定液 （0.1mol/L）相当于20.42mg的邻苯二甲酸氢钾。根 据本液的消耗量与邻苯二甲酸氢钾的取用量，算出本 液的浓度。
进行电位滴定时，被测溶液中插入一个参比电极， 一个指示电极组成工作电池。随着滴定剂的加入， 由于发生化学反应，被测离子浓度不断变化，指 示电极的电位也相应地变化。在等当点附近发生 电位的突跃。因此测量工作电池电动势的变化， 可确定滴定终点。
试剂： 水（新沸放置至室温）， 冰醋酸，无水 甲酸，高氯酸滴定液（0.1mol/L），基 准邻苯二甲酸氢钾，无水冰醋酸，结晶 紫指示液 仪器： 烧杯，玻棒，电子天平，棕色试剂瓶， 滴定管、滴定池、指示电极、参比电极
酪氨酸酶单酚酶和双酚酶
酪氨酸酶单酚酶和双酚酶
酪氨酸酶是一种结构复杂的含铜氧化还原酶，它具有双重催化功能，既可以作为单酚酶，也可以作为双酚酶。
以下是关于酪氨酸酶单酚酶和双酚酶的详细介绍：
一、酪氨酸酶单酚酶
1.催化单酚羟基化：酪氨酸酶作为单酚酶时，能够催化单酚的羟基化反应，将其转化为二酚。
这是黑色素合成的第一步反应，为后续的反应提供了必要的中间产物。
2.对底物的特异性：酪氨酸酶对底物具有一定的特异性，它主要催化含有酚羟基的化合物，如酪氨酸等。
这种特异性使得酪氨酸酶在生物体内能够精确地调控黑色素的合成。
二、酪氨酸酶双酚酶
1.催化邻二酚氧化：酪氨酸酶作为双酚酶时，能够催化邻二酚的氧化反应，生成邻二醌。
这是黑色素合成的第二步反应，也是酪氨酸酶催化过程中的关键步骤之一。
2.对黑色素合成的影响：邻二醌是黑色素合成的重要中间产物，它的生成量直接影响着黑色素的最终产量。
因此，酪氨酸酶作为双酚酶的活性对于调控黑色素的合成具有至关重要的作用。
总的来说，酪氨酸酶的单酚酶和双酚酶活性共同参与了黑色素的合成过程，通过催化单酚羟基化和邻二酚氧化等反应步骤，实现了黑色素在生物体内的生成和调控。
这种双重催化功能使得酪氨酸酶在生物体内具有广泛的生理作用和应用价值。
酪氨酸酶的催化作用
酪氨酸酶的催化作用[原理]酪氨酸酶是一种以铜为辅基的结合蛋白酶，这种氧化酶可直接作用于底物多巴生成多巴醌，然后经过一系列的反应，最终生成黑色素。
在多巴转变为多巴醌的反应中，酪氨酸酶使多巴中的氢原子的两个电子传递给分子氧，使后者转变为氧离子，游离在溶液中的两个质子与氧离子化合生成水。
其催化的主要反应及电子传递过程如下：酪氨酸是甲状腺素、肾上腺素和黑色素的前体。
人类皮肤、毛发和眼睛虹膜的黑色素是酪氨酸在酪氨酸羟化酶催化作用下生成了3,4-二羟苯丙氨酸（简称多巴，DOPA ），后者在酪氨酸酶的作用下生成多巴醌，而后经过一系列中间反应，最后聚合成黑色素。
白化病（albunism ）是一种表现为皮肤、毛发和虹膜变白，因为缺乏酪氨酸酶而不能合成黑色素的先天性代谢缺陷性疾病。
酪氨酸酶也广泛分布于植物界，例如新鲜蘑菇、马铃薯（外层含量尤多）和谷物等。
[试剂]1．酪氨酸溶液 0.1g 酪氨酸溶于100ml 0.1%碳酸钠溶液中。
2．马铃薯抽提液 切碎马铃薯约6g 置于研钵中，加少量净砂，研成匀浆，再加蒸馏水l0ml 充分研磨；最后通过棉花过滤，即可获得含有酪氨酸酶的马铃薯抽提液。
3．煮沸过的马铃薯滤液 取2ml 试剂2于试管内，在酒精灯上加热至沸以破坏酶的活性。
4．液体石蜡[主要器材]研钵、恒温水浴箱CHCOOH NH 2 酪氨酸 2[操作步骤]取试管3支按表10进行操作表10试剂（滴） 1 2 3煮沸过的马铃薯液20 ——马铃薯抽提液—20 20酪氨酸液20 20 20充分混匀各管液体石蜡—— 5置35℃~40℃水浴约30分钟，观察并记录各管颜色，试解释所得的结果。
[注意事项]1．煮沸马铃薯液时，小心勿使液体溅出。
2．加液体石蜡时宜斜执试管，沿管壁缓缓加入，不要产生气泡；加入的液体石蜡必需完全覆盖液面，以隔绝空气。
酪氨酸酶结构功能分析及其抑制物的设计
科技与创新┃Science and Technology&Innovation ·118·2017年第13期文章编号：2095－6835（2017）13－0118－02酪氨酸酶结构功能分析及其抑制物的设计熊东彦，李志远，黄丹，慕昕，刘桢（东北农业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨150030）摘要：黑色素生成与酪氨酸酶相关。
在保证健康的前提下，为了适当抑制黑色素生成，美白皮肤，我们使用生物信息学方法研究了酪氨酸酶的性质，并针对其性质设计了抑制分子。
利用遗传算法得到了不同物种的酪氨酸酶系统进化树，发现东非狒狒、猕猴等的酪氨酸酶与人类的具有较高的相似度。
在PDB数据库中预测到人类酪氨酸酶与巨大芽孢杆菌酪氨酸酶在空间结构上具有最大相似度。
N端与C端分别有1个β-折叠，N端与C端之间有多个α-螺旋。
由此发现，Zn2+和Cl-能够有效降低酪氨酸酶的活性。
黑色素合成受信号通路调控，JNK通路可以通过阻止cAMP应答元件结合蛋白来抑制酪氨酸酶的合成。
雌激素为黑色素合成的“第一信使”，其作用通过ER途径介导，由此寻找到抑制其活性的分子，比如埃克替尼、阿帕替尼。
关键词：酪氨酸酶；生物信息学；抑制分子；系统进化树中图分类号：S917.4文献标识码：A DOI：10.15913/ki.kjycx.2017.13.118黑色素是一种生物色素，能保护生物体免受紫外线伤害，过多的黑色素沉积易引发黑色素瘤。
黑色素合成受多个途径调控，其中，由酪氨酸酶参与的合成途径是黑色素合成的重要途径之一。
酪氨酸酶是一种氧化还原酶，广泛存在于各生物中，与生物体合成色素直接相关。
目前，酪氨酸酶在医疗美容方面的应用发展迅速。
随着生活水平的提高，人们对美的享受也越来越讲究，美白剂的开发随之成为化妆品行业关注的焦点之一。
目前，市场上的美白剂主要有熊果苷、曲酸等，文献表明这些物质均具有较好的美白功效，但这些物质具有一定的皮肤刺激性，或稳定性较差。
酪氨酸酶是黑素合成的关键酶
酪氨酸酶抗体（一）检测方法：TYR抗体在白癜风患者血清中检出。
Song等[11]1994年用细菌合成人TYR，免疫印迹法检测TYR抗体。
这种方法相对不敏感且不能定量检测。
Baharav等[12]1996年使用蘑菇TYR，ELISA法检测TYR抗体，此法敏感，但所用蘑菇TYR与人TYR同源性低。
而Xie等[13]1996年则用人MC提取物作为TYR的来源，免疫沉淀法等检测TYR抗体。
Kemp等[14]1997年采用放免法（RIA）检测TYR抗体。
近来此法已被用来检测自身免疫性疾病患者血清中的特异性抗体[15-17]。
这种方法能敏感定量检测抗体。
（二）产生、特点、特性：1.抗TYR抗体的产生：用人TYR cDNA转染L细胞，获得L-TY细胞，免疫同源性C3H鼠，即用5×106L-TY细胞与等量Frend佐剂混合，腹膜内注入有6周鼠龄的雌性C3H鼠体内，每次间隔2周，第3，4次用5×106细胞裂解物与等量Frend佐剂混合免疫动物。
第4次注射后3天，抽血，分离血清，同时用未转染L细胞去除非特异反应性成分，结果用人TYR cDNA转染L细胞免疫的8只C3H鼠中，4次免疫后，有4只对TYR cDNA转染L细胞的鼠血清抗体滴度＞10-4，C3H鼠免疫前及正常鼠对L-TY细胞无反应性。
用L-TY细胞免疫动物获得的血清能沉淀L-TY和有色素MMC细胞裂解物。
免疫沉淀法可见分子量为70kD～80kD的宽幅条带，可能为TYR生物合成中间代谢产物，未转染L细胞，TYR阴性无色素MMC中未见特异性条带。
2.免疫印迹法检测TYR抗体：用抗TYR血清10-3稀释度，在TYR 转染L细胞和有色素MMC可见细胞内颗粒染色，亲代L细胞内无胞内染色，在L-TY细胞，细胞内染色颗粒位于核周和胞质内。
无色素MMC，不表达TYR mRNA，无TYR活性，与TYR抗体无相互作用。
有色素MMC 和培养MC，高度表达TYR活性，黑素形成多，细胞质颗粒深度染色。
酪氨酸酶
简介
酪氨酸酶又称多酚氧化酶,是一种约75 ku含铜的氧化还原酶，广泛存在于动植物、微生物及人体中,是黑色 素合成的限速酶,直接影响黑色素的合成。酪氨酸酶由多个亚基组成，每个亚基含有2个金属铜离子，而2个铜离 子分别与3个组氨酸残基的亚氨基共价结合固定在活性中心上，另外有1个内源桥基将2个铜离子在一起，构成酪 氨酸酶的活性中心。如果铜被氧化，酶就会失活并且可以通过电子供体被重新激活，例如L-3, 4二羟苯丙氨酸、 抗坏血酸、超氧阴离子，以及可能的一氧化氮。在植物中，酪氨酸酶为多酚氧化酶；在昆虫中则称为酚氧化酶； 在微生物和人体中，才称为酪氨酸酶。酪氨酸酶基因家族在催化黑色素生成时产生作用的共有3种，即TYR、 TYRP1和TYRP2，其中TYRP1和TYRP2在控制黑色素细胞产生黑色素类型的最后几步中起催化作用，TYR是在黑色素 合成起始过程中的一种关键的限速酶，至少具有酪氨酸羟化酶和多巴氧化酶两种活性，在黑色素合成过程中涉及 到酪氨酸酶的氧化以及转运。酪氨酸在酪氨酸酶的作用下生成多巴，再经过一系列的步骤最终生成黑色素。黑色 素使动物呈现较暗颜色，特别是黑色和棕色，有时出现黄色。酪氨酸酶的表达和活性决定着黑色素生成的速度和 产量，酪氨酸酶活性越高，皮肤中黑色素形成的量就越多。
酪氨酸酶
氧化酶
01 简介
目录
02 研究历史
03 的种类及分布
04 的作用机制
05 的应用研究
酪氨酸酶( EC 1. 14. 18. 1， tyrosinase，TYR)又称多酚氧化酶、儿茶酚氧化酶、陈干酪酵素等，是1 种结构复杂的含多亚基的含铜氧化还原酶，广泛存在于微生物、动植物和人体中。
受体酪氨酸激酶分类
受体酪氨酸激酶分类引言：受体酪氨酸激酶是一类重要的酶，广泛存在于细胞膜上，参与多种细胞信号转导过程。
根据其结构和功能的差异，受体酪氨酸激酶可以分为多个亚型，每个亚型都具有特定的生物学功能。
一、RTK（Receptor Tyrosine Kinase）RTK又称受体酪氨酸激酶，是一类跨膜蛋白，具有双重功能，既是受体分子，又是酪氨酸激酶。
RTK的活性状态能够受到配体结合的调控，进而激活下游信号通路。
RTK在生物体内广泛分布，参与了细胞增殖、分化、存活等多种生理过程。
二、Cytokine Receptor（细胞因子受体）细胞因子受体也是一类受体酪氨酸激酶，其结构与RTK类似，都具有酪氨酸激酶活性。
不同之处在于，细胞因子受体的配体是细胞因子家族中的成员，如肿瘤坏死因子（TNF）家族、白细胞介素（IL）家族等。
细胞因子受体通过配体的结合激活酪氨酸激酶活性，进而传递细胞信号。
三、Non-Receptor Tyrosine Kinase（非受体酪氨酸激酶）与RTK和细胞因子受体不同，非受体酪氨酸激酶没有受体分子的结构，但具有酪氨酸激酶活性。
非受体酪氨酸激酶广泛存在于细胞内质网、线粒体、细胞骨架等细胞结构中，参与细胞信号传导、细胞凋亡、细胞增殖等生物学过程。
四、Receptor-like Tyrosine Phosphatase（受体样酪氨酸磷酸酶）受体样酪氨酸磷酸酶是一类具有酪氨酸磷酸酶活性的受体酪氨酸激酶。
与前面几类受体酪氨酸激酶不同的是，受体样酪氨酸磷酸酶主要通过去磷酸化的方式调节细胞信号转导。
受体样酪氨酸磷酸酶在细胞凋亡、细胞黏附、细胞增殖等过程中发挥重要作用。
五、Dual-specificity Kinase（双特异性激酶）双特异性激酶是一类既能磷酸化酪氨酸，又能磷酸化丝氨酸或苏氨酸的酶。
与其他受体酪氨酸激酶不同，双特异性激酶的底物不仅仅限于酪氨酸，还可以磷酸化其他氨基酸，从而调控多种细胞信号通路。
六、Atypical Tyrosine Kinase（非典型酪氨酸激酶）非典型酪氨酸激酶是一类与传统酪氨酸激酶结构和功能差异较大的酶。
酪氨酸酶抑制剂的应用研究进展
酪氨酸酶抑制剂的应用研究进展胡泳华;贾玉龙;陈清西【摘要】酪氨酸酶是一类络合铜离子的金属酶类,广泛存在于动植物、微生物及人体中,是生物体合成黑色素、果蔬褐变的关键酶.酪氨酸酶的异常表现可能会出现黑色素瘤等,黑色素异常生成造成的色素沉着是动物衰老及果蔬褐变的重要表现.综述了酪氨酸酶抑制剂在美容保健、色素型皮肤病的治疗、病虫害防治以及食品保鲜等方面的应用,如:通过直接抑制酪氨酸酶活性以及调控细胞中酪氨酸酶的表达量来有效调控黑色素的生成,从而达到美白及治疗色素紊乱症的作用;抑制果蔬褐变,延长货架期;抑制昆虫蜕皮时的鞣化,达到杀灭农业害虫的目的;提高微生物对于紫外线及其他辐射的敏感度,进一步达到抑菌的目的.【期刊名称】《厦门大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2016(055)005【总页数】9页(P760-768)【关键词】酪氨酸酶抑制剂;医疗美容;害虫防治;保鲜;生物抗菌【作者】胡泳华;贾玉龙;陈清西【作者单位】厦门大学生命科学学院,福建厦门361102;厦门大学生命科学学院,福建厦门361102;厦门大学生命科学学院,福建厦门361102【正文语种】中文【中图分类】Q356.1酪氨酸酶(tyrosinase，EC 1.14.18.1)广泛分布于微生物、动植物及人体中,在植物中,酪氨酸酶一般称为多酚氧化酶;在昆虫中,一般称为酚氧化酶;在微生物和人体中,称为酪氨酸酶.酪氨酸酶是生物体合成黑色素、果蔬褐变的关键酶,在昆虫蜕皮时的鞣化过程和伤口愈合中起重要作用,细菌的黑色素能保护细菌细胞和孢子免受紫外线的伤害.酪氨酸酶具有单酚酶和二酚酶双重催化功能,在单酚酶的作用下,酪氨酸被羟基化成L-多巴(L-DOPA),在二酚酶的作用下,L-DOPA被氧化生成多巴醌,多巴醌再经过一系列的反应之后生成黑色素[1].酪氨酸酶表现异常,有可能会出现黑色素瘤及早发性老年痴呆疾病等,黑色素异常生成造成的色素沉着是动物衰老及果蔬褐变的重要表现[2].酪氨酸酶抑制剂应用广泛,涉及美容保健、色素型皮肤病治疗、病虫害防治以及食品保鲜等多个领域.黑素细胞中酪氨酸酶的基因转录是在小眼转录因子(microphthalmia transcription factor,MITF)的调控下进行的，MITF是黑素细胞增殖及黑素生成过程中起决定性作用的转录因子.现有研究表明,很多信号途径参与调节MITF的表达,例如:Wnt信号途径、cAMP(cyclic adenosine monophosphate)信号途径、P38及MAP(mitogen activated protein)激酶信号途径等[3]，一些主要信号通路总结于图1所示.在阳光照射(即紫外线的刺激下),皮肤角化细胞中的黑色素体受到刺激,可以通过促使分泌促肾上腺皮质激素和α-MSH黑色素细胞刺激素激活ACTH(adreno cortico tropic hormone)和PGE2(prostaglandin E2)蛋白的活化,激活cAMP调节CREB和CRE复合体的形成,进一步激活通路下游的酪氨酸酶活化;CREB/CRE复合体也可以通过上游NOS活化导致PKG(protein kinase G)通路激活而完成,DAG调控的PKC(protein kinase C)通路同样可以达到活化复合体的作用.CREB/CRE复合体激活之后,调节黑色素信号通路中的关键因子MITF在细胞核内完成MBOX结合,激活酪氨酸酶、相关蛋白TRP-1和DCT的大量表达活化.在完成黑素合成相关基因转录后,黑素在黑素小体内主要通过酪氨酸酶的作用进行合成，在人体皮肤角化细胞中,黑色素的形成导致表皮褐变,产生黑斑.以酪氨酸酶抑制剂作为化妆品美白添加剂的作用靶点主要是通过抑制酪氨酸酶的活性和调节酪氨酸酶的转录.其中抑制酪氨酸酶活力的作用模式是目前市场上大多数美白化妆品类开发应用的依据[4].黑色素细胞树突生长障碍是造成白癜风的病因之一,Wang等[5]研究了Rnaset2在人体黑色素细胞中的作用,研究结果表明Rnaset2是调控色素细胞树突生成的关键蛋白之一.Ito等[6]研究诱变白斑病相关酚类发现其能被酪氨酸酶催化,但相应的酚类抑制剂却不能被催化,证实酚类酪氨酸酶抑制剂在开发时需要先检查其是否能够被酪氨酸酶催化.孙道权等[7]研究了水溶性丝胶蛋白能够有效抑制黑色素生成,丝胶粉能够抑制皮肤中的酪氨酸酶活性,从而抑制黑色素的生成,对皮肤起到一定美白作用.陈龙等[8]的研究发现鱼胶原肽能够有效地抑制酪氨酸酶活性,鱼胶原肽可作为无毒副作用的纯天然美白化妆品原料.成静等[9]的研究发现胶原三肽作为构成胶原的最小单位,能够很好地抑制酪氨酸酶活性,在小鼠的黑色素瘤B16细胞中,既能够很好地抑制黑色素生成，同时又对细胞毒性较低.刘琦等[10]研究了维生素C、乙基醚、烟酰胺、β-熊果苷等美白化妆品成分对酪氨酸酶活性的抑制作用,研究表明3种美白剂对于酪氨酸酶的抑制作用表现为非竞争型抑制机理,说明他们与酪氨酸酶的独立部位结合,而不会和底物竞争活性中心.张凤兰等[11]研究表明,熊果苷具有一定的毒性,但它能被人体皮肤表面分离的菌株代谢转变成氢醌类化合物,但转变程度不足以对人CHO (Chinese hamster ovary)细胞产生致畸作用.杨美花等[12]的研究表明L-半胱氨酸能够有效抑制酪氨酸酶的活性,并且能够被酪氨酸酶催化成一种无色底物,使酪氨酸酶不表现出活性,并在细胞水平上证明L-半胱氨酸能够作为一种安全无毒的美白化妆品有效成分.还有很多研究发现多种药用植物中能够提取出有效抑制酪氨酸酶活性的成分,从而极大地丰富了酪氨酸酶抑制剂来源.Bae等[13]从毛壳属植物中提取的毛壳素就能够很好地抑制酪氨酸酶活性并且抑制小鼠黑色素瘤中黑色素的生成.柯静霞[14]的研究表明,蛇婆子提取物在使用8周水平上,能够有效抑制酪氨酸酶活性,降低黑色素活性,并且有效降低黑色素生成量,从而具有一定的美白功效.罗倩仪等[15]通过酪氨酸酶抑制模型研究了几种美白祛斑复配配方的实际筛选和功能优化,实验证明壬二酸衍生物、红景天提取物能够具有一定的美白祛斑作用.Lin等[16]从台湾火刺木中分离的活性物质也能够高效低毒的对酪氨酸酶产生良好的抑制效果并且作为美白剂进行使用.铃木敏幸等[17]对美白化妆品的发展方向进行综述时也提到,通过酪氨酸酶的阻碍实验可以有效地评价美白剂的相关作用,并且能够反映化妆品降低黑素生成的能力.早在2005年刘之力等[18]提到,中药复方乙醇提取物对酪氨酸酶有时也会存在激活作用,但激活酪氨酸酶活力并不代表能够在动物试验中增加黑色素生成的作用.马秋华等[19]从商品化的药物筛选到壬二酸，发现其具有抑制酪氨酸酶活性,并且能够有选择性地抑制黑色素过多的异常化细胞,作为一种美白化妆品的原料.付晓磊等[20]基于商品化的酪氨酸酶抑制剂对苯二酚合成了一系列对苯二酚氨基酸缀合物,通过表征实验证明其能够有效地抑制酪氨酸酶活性,通过构效关系模型研究证实了其具有良好的抑制活性;宋长伟等[21]基于龙胆酸化合物设计合成了系列衍生物,也具有良好的抑制黑色素生成的作用.以上的研究结果显示,酪氨酸酶抑制剂在化妆品研制过程中作为美白添加剂,能够保护人体皮肤免受紫外线辐射.酪氨酸酶在植物体内广泛存在,其很早就被作为植物储藏期间色变腐烂的原因加以研究.果蔬体内多酚氧化酶主要存在于完整细胞的质体、线粒体等细胞器内膜和细胞膜上及细胞质中,而酚类底物存在于液泡中,这种区室化分布减少了酚类物质与酶的接触,避免了正常组织中酶促褐变的发生.果蔬等产品在受到机械损伤或处于低温、高温环境下,细胞膜的完整性被破坏,区室化分布受到损害,使得酚类物质与多酚氧化酶相接触,加速了正常组织的褐变过程[22-23].在多酚氧化酶作用下,果蔬内源性多酚类物质如酪氨酸、多巴等氧化形成醌,醌类物质再聚合形成类黑色素,从而导致产品变色,造成营养丢失及经济损失.早期,含硫化合物广泛应用于食品的抗褐变中,王伟等[24]发现亚硫酸氢钠对马铃薯多酚氧化酶具有显著的抑制作用及在马铃薯切片护色中具有防褐变功能.然而,这些含硫化合物由于硫的残留对人体的健康造成一定的影响逐步被限制使用.目前,普遍的保鲜方法大致可以分为以下几类:低温保鲜[25-26]、化学保鲜[27-28]、气调保鲜[29-30]、涂膜保鲜[31-32]、臭氧保鲜[33-34]以及辐射保鲜[35-36]等.这些方法虽然可以不同程度地对食品的保鲜起到一定的作用,但由于成本高、费用多等原因而不能得到广泛应用.因此寻求一种高效、简单、低价的保鲜方法显得十分的重要.Sato等[37]从Lentinula edodes中克隆了1 854 bp的Letyr基因，其编码618个氨基酸残基的分子质量为68 ku的蛋白.该基因在蘑菇采后保鲜过程中的表达量大量增加.Sakamoto等[38]采用抑制消减杂交的方法发现采后的Lentinula edodes中两个酚氧化酶基因(酪氨酸酶tyr和漆酶lcc4)的表达明显增加,并且鉴定出这是导致蘑菇褐变的主要原因.因此,可以通过抑制酪氨酸酶的活力达到抑制或延缓食品褐变的发生,而且酪氨酸酶还是各种微生物生命活动所必需的酶,抑制酪氨酸酶的活性还能抑制腐烂菌的生长,达到保鲜防腐的目的,且不影响食品的风味及口感. 常见的酪氨酸酶抑制剂如半胱氨酸、抗坏血酸、柠檬酸等已应用于食品的保鲜中[39-40].Dawley等[41]研究了4-己基间苯二酚对蘑菇酪氨酸酶的抑制作用,而4-己基间苯二酚已被应用于防止苹果片褐变[42]以及延缓虾类产品体内水溶性色原物质被氧化成黑色素而造成虾头胸部黑变[43].Lin等[28]研究了没食子酸丙酯对酪氨酸酶的作用,而后将其应用于龙眼的保鲜中,取得了很好的抗褐变效果.Xing等[44]发现铁取代磷酸盐(Na6PMo11FeO40)对酪氨酸酶是可逆的非竞争型抑制作用,并且其可以显著地延缓莲藕切片的褐变.植酸(又称为肌醇六磷酸)可以很好地抑制苹果汁中的多酚氧化酶活力从而可以显著地降低苹果汁在加工过程中褐变的发生[45].另外,冷冻处理、70 ℃热变性或者300～1 000 MPa高压处理也可以使酪氨酸酶活力失活[46],但这些处理可能对食品的品质造成一定的影响,因此从酪氨酸酶抑制剂出发寻找高效的保鲜剂不失为一种有效的手段.本研究采用酪氨酸酶抑制剂研究了抑制剂对马铃薯条、双孢蘑菇、龙眼及荔枝的抗褐变保鲜,研究结果如图2所示.由图2可知,对照组的马铃薯条比实验组褐变严重；对照组的蘑菇表皮褐变严重，出现腐烂现象；对照组的龙眼表皮褐变严重，有掉果及腐烂现象；而对照组的荔枝果实出现褐变、发霉现象.可见酪氨酸酶抑制剂可以很好地延缓果蔬褐变的发生.随着人口数量的不断增长及生活质量的不断提高,粮食短缺所带来的威胁也越来越严重,粮食产量受到自然灾害及病虫害的极大挑战.农药是控制病虫害、提高粮食产量的最有效手段之一.然而由于农药的广泛应用使得害虫的抗药性不断上升,农药本身的毒性亦不断上升,这对自然环境以及人类自身都构成了极大的威胁.面对这一严峻形势,研制新型、无公害、对环境友好的低毒高效杀虫剂已成为农业工业的第一目标,现有的农药品种远远不能满足粮食生产的需要,仍然需要大力加强农药新品种的研究与开发[47].早在1993年著名昆虫毒理学家张宗炳等[48]指出:探索新杀虫药剂的一条最有希望的途径是生物途径,其中酪氨酸酶抑制剂可列入首选.酪氨酸酶在昆虫的正常发育过程中具有重要的生理功能.它主要参与表皮的硬化、黑化过程;参与对外来侵染物的免疫防御反应;参与伤口愈合反应[49-51].在昆虫表皮硬化过程中,酪氨酸酶催化单酚羟化为二酚,然后氧化成醌,醌与表皮层中的角蛋白及几丁质相互作用,互相交联在一起,形成角质,高度硬化的角质可以阻断微生物和异物的入侵,形成保护昆虫的第一道屏障.此外,酪氨酸酶还可产生具有细胞毒杀作用的氧自由基和具有潜在细胞毒杀作用的半醌及三羟酚,进一步增强寄主的防御能力.在较高等的无脊椎动物如节肢动物中,酪氨酸酶除了参与角质的硬化和黑化外,还参与其他2种重要的生理过程,即防御反应(节肢动物免疫)和伤口愈合.对于小颗粒异物如细菌,宿主可通过吞噬作用加以消灭.当入侵的异物太大(如寄生虫),宿主便通过黑色素包被作用来抵抗和消灭寄生虫,而酪氨酸酶在这个过程中起重要作用.由于这些过程可能是害虫形成防御体系的重要反应,因此酪氨酸酶有可能作为害虫控制中的一个作用靶标.天然酪氨酸酶抑制剂将成为继几丁质酶抑制剂后的一类新的环境友好型的害虫生物调控剂.本实验室设计的酪氨酸酶抑制剂3,4-二羟基苯甲酸庚酯对于菜青虫(Pieris rapae L.)具有杀灭作用,将质量浓度分别为0，2.5，5，10，20,40 mg/mL的酪氨酸酶抑制剂和菜青虫饲料混合均匀，制成内吸型杀虫剂配方,对菜青虫喂养持续3 d,在第3天观察效果(图3)发现,5 mg/mL的质量浓度就可以有效抑制菜青虫幼虫的生长,这主要是通过抑制昆虫幼虫生长过程中的表皮糅化来达成的,可见这种质量浓度饲喂的幼虫大小明显小于对照组,而10 mg/mL的质量浓度以上,则可以完全杀灭菜青虫幼虫,说明了酪氨酸酶抑制剂可以有效抑制农业常见害虫幼虫的生长,在高浓度作用下,能够有效杀灭害虫幼虫,具有较好的研究价值和应用前景．Dong等[52]克隆了小菜蛾中的多酚氧化酶(PPO)并通过real-time PCR研究发现PPO存在于小菜蛾的不同发育阶段.Bhonwong等[53]比较了过表达PPO、抑制PPO表达以及正常的马铃薯叶喂养棉铃虫及甜菜夜蛾的生长情况,结果证实了PPO 在抑制棉铃虫及甜菜夜蛾的生长发育中起到重要的作用.Pan等[54]合成了系列的3,4-二羟基烷基酯,该系列化合物可以有效地抑制酪氨酸酶活力,并且发现其能使小菜蛾的生长明显受到抑制,进一步研究发现该系列化合物能使小菜蛾中PPO基因表达下降,从而抑制其生长.此外,曲酸[55]、缩氨基硫脲类化合物[56]、苯胺类席夫碱[57]以及α-巯基-β-取代苯基丙烯酸[58]等化合物对昆虫酚氧化酶具有很好的抑制作用,这为研究开发新型的“昆虫生命活动干扰剂”进行了有益探索.酪氨酸酶是合成黑色素的关键酶,其代谢产生的黑色素能够有效提高细菌对抗紫外线以及其他电离辐射作用[59].蔡信之等[60]甚至将高表达酪氨酸酶的基因转入苏云金芽胞杆菌中，用以增强细菌的抗紫外线以及抗辐射能力.因此,筛选出能够抑制微生物的酪氨酸酶活性便显得尤为重要.Basavegowda等[61]通过对青蒿素提取物进行纳米金属离子处理后,发现其不仅能够有效抑制酪氨酸酶,还能够表现出良好的抑菌活性.田敏等[62]通过对环境微生物进行筛选,以链霉菌X59为鉴定菌的黑色素生物合成抑制剂筛选模型,从4 000余种微生物中筛选出一株活性化合物产生菌,其代谢产物能够有效抑制黑色素的生物合成.黄晓冬等[63]研究了红树植物桐花树叶片多酚提取物能够抑制酪氨酸酶活性并对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌具有明显的抑制活性;鲁卫斌等[64]的研究表明直接从马铃薯中提取的酪氨酸酶用于处理羊毛,具有一定的抗菌功效,并且对金黄色葡萄球菌的抑菌率能达到76.32%.Xia等[65]的研究表明,5-羟基-4-乙酰基-2,3-萘二羧酸酐萘酚-呋喃能够有效地抑制酪氨酸酶活性,同时抑制细菌的生长.王聪慧等[66]的综述中也提到,茶多酚作为一种天然化合物,能够有效地抑制酪氨酸酶活性,同时具有很好的抑菌功效,对伤寒杆菌、副伤寒杆菌、痢疾杆菌、溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌等均有明显的抑制作用;也有前人研究证实丁香酚能够在抑制酪氨酸酶活性的同时,对黄曲霉、烟曲霉、产黄青霉、桔青霉、粘红酵母的生长均有不同程度的抑制作用,是一种良好的天然防腐剂.张丽娟等[67]研究了3-羟基苯甲酸对酪氨酸酶的抑制机理以及几种常见腐败菌的抑制作用,证明了3-羟基苯甲酸具有很好的抑制酪氨酸酶及细菌生长的作用.陈祥仁等[68]研究了3,4-二羟基氰苯对于酪氨酸酶稳态酶活力以及酶促反应的迟滞时间有影响,同时能够很好地抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌3种细菌和真菌白色假丝酵母的生长.本文中研究了酪氨酸酶抑制剂对细菌的抑制作用,研究结果如图4所示.4-苯基丁醇对克雷伯氏肺炎菌(图4(a))、根癌农杆菌(图4(b))和沙门氏菌(图4(c))均有一定的抑制作用并呈浓度依赖效应.3-羟基苯甲醛对克雷伯氏肺炎菌(图4(d))、根癌农杆菌(图4(e))和沙门氏菌(图4(f))有一定的抑制作用,但效果不如4-苯基丁醇明显.综上,酪氨酸酶抑制剂可以很好地应用于生物抗菌中.目前,酪氨酸酶抑制剂已经在医疗、农业抗虫、食品保鲜等多方面得到了广泛的应用,但就其在黑色素合成信号通路的作用、抑制农业害虫及微生物的生长以及食品的防褐变保鲜中的具体作用机制仍需进一步研究.【相关文献】[1] 陈清西,宋康康.酪氨酸酶的研究进展[J].厦门大学学报(自然科学版),2006,45(5):731-737.[2] 陈清西,林建峰,宋康康.酪氨酸酶抑制剂的研究进展[J].厦门大学学报(自然科学版),2007,46(2):274-282.[3] LEE H 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酪氨酸酶
酪氨酸酶(EC 1.14.18.1,Tyrosinase)是一种含铜的金属酶,广泛分布于微生物、动植物及人体中[1]. 在植物中,酪氨酸酶一般称为多酚氧化酶;在昆虫中,则称为酚氧化酶;在微生物和人体中,才称为酪氨酸酶.酪氨酸酶主要参与两个反应过程:催化L-酪氨酸羟基化转变为L-多巴和氧化L-多巴形成多巴醌,多巴醌经一系列反应后,形成黑色素.酪氨酸酶在生物体中具有重要的生理功能.同时,它也与人体雀斑、褐斑等黑色素过度沉积等疾病的发生有关,并与昆虫的蜕皮和果蔬的褐化有很大关系[2].自从发现了人黑色素细胞可以以L-3,4-二羟基丙氨酸(L-多巴)为底物合成黑色素,这个反应成为酪氨酸酶活性和定位检测的基础.在之后的研究中,酪氨酸酶成为第一个用亲和色谱纯化的酶,酪氨酸酶也是最早发现能将酶分子内部氧原子参入到有机物中的酶;并为酶自杀性失活提供了早期实例.现今,人们已经从微生物、植物及多种动物中提取并纯化了酪氨酸酶.目前,对酪氨酸酶的研究主要集中在酶的分离纯化、催化机制、活性调控以及酪氨酸酶基因及其在生物体内的生理作用等方面,在结构方面,其三维结构仍未得到.鉴于此,对编码酪氨酸酶基因的结构、表达及其调控,酪氨酸酶的合成和运输的研究也在不断发展.酪氨酸酶的理化性质高等脊椎动物、低等脊椎动物和原核生物的酪氨酸酶的理化性质不同.由表1可以看到,从Strepto- myces antibioticus的272个氨基酸到Homo sapiens的529个氨基酸,不同生物中的酪氨酸酶氨基酸数目差异很大.虽然它们在生物体内具有相似的生理功能,但它们的理化性质却有不同程度的差异性.酪氨酸酶在同工酶的研究也占有非常重要的地位,是生物体内具有同工酶的一大类酶.据研究,哺乳动物、原核动物、真菌的酪氨酸酶一般为单聚体或二聚体;而昆虫、两栖类的酪氨酸酶一般为二聚体、四聚体或五聚体等多聚体.3 酪氨酸酶的活性中心结构酪氨酸酶的活性中心是由两个含铜离子位点构成.在催化过程中,双核铜离子位点以3种形态存在,分别是氧化态(Eoxy)、还原态(Emet)和脱氧态(Edeoxy). 研究表明与酪氨酸酶结合的双核铜离子活性中心与在血蓝蛋白中发现的活性中心非常相似[16,17].由X射线吸收光谱(XANES, X-Ray Absorption Near Edge Structure)分析,酪氨酸酶和血蓝蛋白含铜活性中心主要的构象变化基本相同,铜离子位点的几何构型是可变的.血蓝蛋白氧化态结晶学和延伸X射线吸收结构光谱(EXAFS, Edge X-ray Absorption Fine Struc-ture)的研究结果表明[18],Cu-Cu键长约为0.35 nm,每个二价铜离子构型为正四棱锥状,受到两个强的赤道面配位原子的调控和一个相对较弱的轴向NHis配基的调控,形成5个配位键(结构可见图1).其电子构象为3d9.即与蛋白上的组氨酸残基上的氮原子形成3个配位键,外源氧分子作为过氧化物与铜离子形成两个配位键占据了铜离子的两个赤道面位置,并可作为两个铜离子之间的桥联配体.所以Eoxy活性中心可以写成Cu(I) -O2-Cu(I),但通常更适合用过氧化态Cu(II) -O2-Cu(II)表示[16].过氧化物的电子结构对于Eoxy的生物功能很重要.由于受强的R*受体作用,过氧化物带有较少的负电荷,而P电子受体与过氧化物的R*轨道上的电子作用,大大的削弱了氧氧键,使图1 酪氨酸酶活性中心的双核铜中心结构Fig.1 The structure of the active center containing Cu of ty- rosinase之容易断裂.酪氨酸酶被认为是血蓝蛋白的祖先蛋白,因为酪氨酸酶在非常原始的生物体中也有发现.Eoxy的结构比血蓝蛋白的结构更紊乱,因此酪氨酸酶相对于血蓝蛋白存在更多构象不同的底物与其活性中心结合.还原态酪氨酸酶与氧-铜离子态的酶相似,都含有两个四角形的反磁铜离子,不同的是,桥联配体是氢氧化物而不是过氧化物.每个亚铜离子电子构象为3d10,分别与两个吲哚上的氮原子形成两个键长为0.19 nm的配位键,与第三个吲哚上的氮原子形成键长为0.27nm的配位键,环绕Cu-Cu轴形成近似C3V的对称结构.当加入过氧化物,酶从Emet变为Eoxy;当缺少过氧化物时,酶由Eoxy变为Emet.纯化后得到的酶是由\85%的Emet和[15%的Eoxy组成的混合物.半亚铜离子态酪氨酸酶含有一个2价铜离子和一个1价铜离子.2价铜离子含有未配对的电子,由电子顺磁共振分析,未配对的电子占据一个dx2 -y2轨道.根#732#厦门大学学报(自然科学版) 2006年据两个铜离子之间电子离域的电子顺磁共振和可见光谱特征,证明在两个铜离子之间同样有桥连配体的存在.通过对铜离子态血蓝蛋白的研究表明:Edeoxy的活性中心由两个一价铜离子组成.1938年Kubowitz证明了这种酶形态的存在.图2 酪氨酸酶催化生成黑色素过程Fig.2 The process of the melanin biosynthesis catalyzed by tyrosinase。
酪氨酸酶抑制及激活作用动力学的分析
三、实验报告
采用四人一组，每两人选择两个化合物进行测 1 试。因为每个实验由10个点构成，可以去掉几
个点得到比较理想的曲线。
两名学生只对自己所做的实验过程和结果进行
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分析，按照研究论文形式写出实验报告。
实验中尽可能了解其他同学的实验过程和实
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验结果，如果可能结合起来一起进行分析。
四、实验注意事项
• 酪氨酸酶的底物结合部位，由于铜原子与氧的结合部位关 系密切，故凡能与铜原子形成复合物的化学试剂均有可能 是酶的有效抑制剂。苯甲酸、叠氮化物、氰化物、苯硫脲 和半胱氨酸等对O2与酶结合有竞争作用；非酚类芳香族 化合物对底物与酶结合有竞争作用。近些年来，人们从植 物中分离出多种酪氨酸酶抑制剂用于化妆品工业，如熊果 苷、曲酸、根皮素等。
• 大量的研究表明，黑素细胞内黑色素的生物合成是一个由 酪氨酸酶催化体内酪氨酸羟化而启动的一系列生化反应： 体内酪氨酸在酪氨酸酶催化下生成 3,4-二羟基苯丙氨酸 即多巴，多巴进一步氧化生成多巴醌，多巴醌经多聚化反 应与氧化反应生成多巴色素，在多巴色素异构酶 作用下, 多巴色素羟化为5,6-二羟基吲哚羧酸, 脱羧成 5,6-二羟基 吲哚, 再在酪氨酸酶催化下氧化成 5,6-吲哚醌, 最后与其 它中间产物结合形成真黑色素。脱黑色素的形成其前部分 -由酪氨酸到多巴醌与真黑色素一致, 但在以后的反应中有 半胱氨酸参加, 产生Cys-多巴和 Cys-多巴醌, 通过关环､ 脱羧, 最后形成脱黑色素。
实验仪器和条件
北京普析通用UV-1901 紫 外可见分光光度计
实验条件： 缓冲液：0.1mol/LpH 6.8磷酸盐缓冲液。 底物：25mol/L 邻苯二 酚 化合物溶液的配制： 1-萘酚和二羟基二苯甲酮 用乙醇配成50mol/L。 2-萘酚和六羟基二苯甲酮 用乙醇配成10mol/L。 硫酸亚铁和硫酸铜用蒸馏 水配成50mol/L。
土豆中酪氨酸酶的提取及其催化活性的研究 (终稿)
本科毕业论文（设计）题目：土豆中酪氨酸酶的提取及其催化活性的研究学生：蒋泽琦学号： 201040320111学院：生命科学学院专业：生物科学入学时间： 2010 年 09 月 15 日指导教师：张秋研职称：助理实验师完成日期： 2014 年 05 月 04 日诚信承诺我谨在此承诺：本人所写的毕业论文《土豆中酪氨酸酶的提取及其催化活性的研究》均系本人独立完成，没有抄袭行为，凡涉及其他作者的观点和材料，均作了注释，若有不实，后果由本人承担。
承诺人（签名）：年月日土豆中酪氨酸酶的提取及其催化活性的研究不同因素对酪氨酸酶活性的影响学位申请人：蒋泽琦导师：张秋研摘要酪氨酸酶从目前的研究看来是一种由Cu+ 或Cu2+作为辅助因子构成的全酶，空气中的氧对多巴的氧化反应就是由其催化的[1]。
而我们可以通过多巴转换反应过程中的颜色变化检测其中的催化过程，所以酶的活性我们可以通过对于吸光度随时间的变化的测定来求得。
本论文则是首先从土豆中提取出酪氨酸酶，而后采用分光光度计法对其的活性进行测定，大约于480nm处使用紫外分光光度计测定土豆提取液的吸光度，将吸光度对于时间的变化率（△A/△V）作为反应的速率，并以此建立对于多巴溶液的转换动力学曲线，得出酪氨酸的活性[2]。
关键词酪氨酸酶；提取；活性；活性动力学曲线Extraction and catalytic activity of Tyrosinase potatoes Abstract：From tyrosinase appears to be a current study of Cu + or Cu2 + as a cofactor holoenzyme composed of the oxygen in the air is oxidation of dopa by catalysis. We can convert the catalytic process and reaction process wherein the color change is detected by dopa, the enzyme activity that we can change with time for the measurement of absorbance to obtain. This paper is the first extract from potato tyrosinase, followed by the spectrophotometer its activity was measured at approximately at 480nm using a UV spectrophotometer absorbance potato extract, the absorbance changes with respect to time rate (△ A / △ V) as the reaction rate, and thus create a solution for the conversion of dopa kinetic curve derived tyrosinase activity.Key words：Tyrosinase; extraction; activity; activity kinetics目录1引言 (1)2 材料与方法 (3)2.1 材料 (3)2.2 方法 (3)2.2.1 酪氨酸酶的提取 (3)2.2.2 酪氨酸最大吸收波长确定 (3)2.2.3 酪氨酸酶的活性测定 (3)2.2.4 酶活性因素测量 (3)3 结果与分析 (4)3.1 酪氨酸最大吸收波长确定 (4)3.2 建立酶的动力学曲线 (4)3.3 计算酶的活性 (6)3.4 影响酶的活性的因素研究 (7)3.4.1 pH值对酶活性的影响 (7)3.4.2 温度对酶活性的影响 (7)3.4.3 抑制剂EDTA对酶活性的影响 (8)4结论 (9)5参考文献 (10)1 引言酪氨酸酶（Tyrosinase），简称TYR，是一种75kD含铜的多酚氧化酶，酪氨酸酶非常普遍的存在于微生物、动植物及人体中[3]。
酪氨酸酶的提取及其酶促反应动力学研究
酪氨酸酶的提取及其酶促反应动力学研究一、实验目的1.认识生物体中酶的存在和催化作用，了解生物体系中在酶促反应的特点，认识一些生物化学过程的特殊性。
2.掌握生物活性物质的提取和保存方法，了解研究催化反应特别是生物化学体系中催化过程的基本思想和方法。
二、实验原理酶（enzyme）是由生物细胞合成的、对特定底物（substrate）起高效催化作用的蛋白质，是生物催化剂。
生物体内所有的化学反应几乎都是在酶的催化作用下进行的。
只要有生命活动的地方就有酶的作用，生命不能离开酶的存在。
在酶的催化下，机体内物质的新陈代谢有条不紊地进行着；同时又在许多因素的影响下，酶对代谢发挥着巧妙的调节作用。
生物体的许多疾病与酶的异常密切相关；许多药物也可通过对酶的作用来达到治疗的目的。
随着酶学研究的深入，必将对人类社会产生深远影响和作出巨大贡献。
酶的化学本质是蛋白质。
结构上，同样具有一、二、三级结构，有些酶还具有四级结构。
分子的化学组成上，有单纯酶和结合酶之分。
单纯酶分子是仅由蛋白质构成的酶，不含其他物质，如脲酶、活化蛋白酶、淀粉酶、核糖核酸酶等等。
结合酶分子是由蛋白质分子和非蛋白质部分组成，前者称为酶蛋白（apoenzyme），后者称辅助因子（cofactor）。
辅助因子是金属离子或有机小分子。
酶蛋白与辅助因子结合形成的复合物称全酶（holoenzyme），酶蛋白和辅助因子各自独立存在时，均无催化活性，只有全酶才有催化活性。
在酶促反应中酶蛋白决定着反应的专一性和效率，而辅助因子则决定着反应的种类和性质。
辅助因子按其与酶蛋白结合的紧密程度和作用特点，一般分为辅酶（coenzyme）和辅基（prosthetic group）。
辅酶是指辅助因子与酶蛋白结合松弛，没有固定的组成比，往往可用透析或超滤法除去，在反应中作为底物接受质子或基团后离开酶蛋白，参加另一酶促反应并将所携带的质子或基团转移出去，或者相反。
而辅基是指与酶蛋白结合比较紧密，与酶蛋白有一定的组成比，不能通过透析或超滤法除去，在反应中辅基不能离开酶蛋白。
酪氨酸酶是什么东西
酪氨酸酶是什么东西
酪氨酸酶是黑色素合成的关键酶，可能是白癜风自身免疫的重要抗原，最近发现部分白癜风患者血清中有酪氨酸酶抗体，且与白癜风临床类型和分期密切相关，提示自身免疫性白癜风发病机制与酪氨酸酶抗体水平有关，为其免疫治疗提供依据。
扩展资料
酪氨酸酶抗体可以作为白癜风活动性的.一个指标，酪氨酸酶是一种75kD含铜酶，来源于胚胎神经鞘细胞，是黑色素代谢和儿茶酚胺的关键酶，眼、皮肤白化病是酪氨酸酶基因突变所致，该病酪氨酸酶阳性患者色素性皮肤损害发生率高，超氧化物负离子、能穿透黑素细胞入胞内，酪氨酸酶通过利用超氧化物负离子保护透黑素细胞，免受超氧化物负离子细胞毒作用。
所以理论上来讲酪氨酸酶可以有效治疗白癜风，在生活中白癜风患者可以通过食物来补充酪氨酸酶，比如我们常见的金枪鱼、带鱼、鲈鱼、黄花鱼、鲤鱼、茶叶、白酒、水果酒、啤酒、陈醋、大酱、腐乳、臭豆腐、松花蛋等。
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酪氨酸酶的种类及分布
下午4点至8点 随着微循环的增强， 血液中含氧量提高，心 肺功能特佳，能充分吸 收营养，这段时间最适 宜职业女性到美容院作 保养，还可根据爱好进 行健身运动。
晚上8点至11点 此时皮肤最易出现 过敏反应，微血管抵抗 力衰弱，血压下降，人 体易水肿、流血及发炎， 故不适宜做美容护理。
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当加入过氧化物,酶 从Emet 变为Eoxy ; 当缺少过氧 化物时,酶由Eoxy 变 为Emet . 纯化后得 到的酶是由≥ 85 %的Emet 和≤15 %的Eoxy组成的混 合物.
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酪氨酸酶是黑色素合成的关键酶
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酪氨酸酶在生物色素形成中的作用 THIS IS AN EXAMPLE TEXT
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酪氨酸酶——
1.引发白癜风 皮肤和毛囊的黑素细胞内酪氨酸酶活性减低或消失，导致 黑素颗粒(即黑素体)生成的进行性减少或消失，而引起的 局限性或泛发性托色素性病变，从而引起白癜风。 酪氨酸酶是白癜风自身免疫的重要抗原。部分白癜风患者 血清中有酪氨酸酶抗体，且与白癜风临床类型和分期密切 相关。提示自身免疫性白癜风发病机制与酪氨酸酶抗体水 平有关，为其免疫治疗提供依据，因此酪氨酸酶抗体可以 作为白癜风活动性的一个指标。
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酪氨酸酶的分布与动物的生理功能息息相关,不同动物的酪氨酸酶在体内分布的部位 不同. 昆虫 在正常生理状态下,酪氨酸酶以酶原的形式存在,不同 类型的酪氨酸酶存在于昆虫的特定部位,以完成特定 的生理功能
哺乳动物 哺乳动物酪氨酸酶催化产生的黑色素被分泌进入 到表皮和毛发的角质细胞中,使体表着色,从而起保护 皮肤和眼睛、抵御紫外线的辐射和防止内部组织过热 等作用.
10
皮肤颜色为什么会变黑：
在我们的皮 肤基底层中， 基底细胞间 可以看见一 种形状不规 则，呈透明 状的细胞， 叫麦拉宁黑 色素细胞； 它可以产生 黑色素颗粒， 并送到基底 层细胞、棘 细胞中去， 使这些细胞 都含有黑色 素颗粒。
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当加入过氧化物,酶 从Emet 变为Eoxy ; 当缺少过氧 化物时,酶由Eoxy 变 为Emet . 纯化后得 到的酶是由≥ 85 %的Emet 和≤15 %的Eoxy组成的混 合物.
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酪氨酸酶的分布与动物的生理功能息息相关,不同动物的酪氨酸酶在体内分布的部位 不同. 昆虫 在正常生理状态下,酪氨酸酶以酶原的形式存在,不同 类型的酪氨酸酶存在于昆虫的特定部位,以完成特定 的生理功能
哺乳动物 哺乳动物酪氨酸酶催化产生的黑色素被分泌进入 到表皮和毛发的角质细胞中,使体表着色,从而起保护 皮肤和眼睛、抵御紫外线的辐射和防止内部组织过热 等作用.
二、肉类 少吃牛肉、羊肉、猪肉、 内脏、鸡肉、火鸡肉、鸭肉。 因 为这些食物含有丰富的两种氨基酸： 酪胺酸及苯丙胺酸，这两种氨基酸， 是形成黑色素的主要营养素，不要吃 过量，否则黑色素的制造原料一多， 就容易使皮肤变黑，所以海鲜类是比 较安全的食物。
三、柠檬、芹菜、胡萝卜、九层塔、橙类水果等等 这些食材含有光敏感的物质，如果没有清洗干净残 留在手上，照射到阳光时会导致皮肤发红过敏，还 会留下色素沉淀呢。临床上常遇到挤柠檬汁，结果 弄得满手黑黑的人，就是因为挤了柠檬，事后没有 把手洗干净又照射到阳光造成的。
酪氨酸酶 ——浅谈皮肤变黑、美白、护肤
安阳 化二
一、酪氨酸酶的种类及 分布
二、酪氨酸酶的活性中心 结构
三、 酪氨酸酶在生物色 素形成中的作用
酪氨酸酶的种类及分布
酪氨酸酶( Tyrosinase) 是一种含 铜的金属酶,广泛分布于微生物、动植物及人体 中,但酪氨酸酶蛋白的立体结构尚不清楚。在植 物中,酪氨酸酶一般称为多酚氧化酶;在昆虫中, 则称为酚氧化酶;在微生物和人体中,才称为酪氨 酸酶.
全球人种中， 由于黄色人 种、黑色人 种和棕色人 种的皮肤中 所含色素较 多，因而其 维他命D的 合成能力比 含色素较少 的白种人低， 因此，如果 皮肤黑的人 日照不足， 那么极易发 生维他命D 缺乏症。
11
让皮肤变色的食物：
一、红萝卜、木瓜 这些食物含有高量 的β胡萝卜素，吃太多会导致皮肤发黄。 β胡萝卜素可以转换成维生素A,具有良好的 抗氧化效果，但是吃太多反而会使皮肤发 黄，所以红萝卜和木瓜，可以吃但是要注 意不要过量，像是炒菜时加一点红萝卜配 色可以，但是每天喝好几杯红萝卜汁就有 点过头了。
10
皮肤颜色为什么会变黑：
在我们的皮 肤基底层中， 基底细胞间 可以看见一 种形状不规 则，呈透明 状的细胞， 叫麦拉宁黑 色素细胞； 它可以产生 黑色素颗粒， 并送到基底 层细胞、棘 细胞中去， 使这些细胞 都含有黑色 素颗粒。
研究表明， 黑色素量 的多少取 决于黑色 素细胞中 酪氨酸酶 活性的强 弱，酪氨 酸酶活性 越强，合 成的黑色 素量就越 多。
12
最佳护肤作息时刻表：
晚11点至凌晨5点 这时细胞生长和修复最旺盛，细胞分裂的速度要比平时快8倍左右，肌 肤对护肤品的吸收力特别强。这时应使用富含营养物质的滋润晚霜，使保养 效果发挥至最佳状态。
而能影响酪 氨酸酶活性 的因素均对 黑色素形成 有影响，其 中最重要的 是遗传因素， 不同人种其 遗传因子不 同，故产生 色素量亦不 同，表现出 不同的肤色。 中国人的黑 色素中含有 很多天然的 以胡萝卜素 形式存在有 维他命A， 于是皮肤会 呈现出轻微 的黄色。
表皮颗粒层 中的晶体角 质虽然可以 折射阳光， 大量减少紫 外线的穿透， 一旦有少部 分的紫外线 进入皮肤， 便足以刺合 成维他命D。 然而，研究 证明，皮肤 细胞中含色 素越多的， 其合成维他 命D的能力 也越差。
9
酪氨酸酶——
2.美白原理 皮肤白不白，主要取决于黑色素细胞合成黑色素的能力。在人的表皮 基层细胞间，分布着黑色素细胞，它含有的酪氨酸酶可以将酪氨酸氧 化成多糖，中间再经过一系列的代谢过程，最后便可生成黑色素。黑 色素生成越多，皮肤就越黝黑；反之，则皮肤就越白皙。 酪氨酸酶具有独特的双重催化功能，是生物体内黑色素合成的关键酶， 与人的衰老有密切关系。其异常过量表达可导致人体的色素沉着性疾 病。酪氨酸酶抑制剂可以治疗目前常见的色素沉着性皮肤病如雀斑、 黄褐斑、老年斑。市场上流行的美白化妆品中的熊果苷、维生素C衍 生物、曲酸及其衍生物、绿茶提取物、甘草提取物等中药提取物等均 为酪氨酸酶抑制剂，主要是通过抑制酪氨酸酶的活性而达到抑制黑色 素合成，进而发挥美白的作用。
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酪氨酸酶的活性中心结构
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酪氨酸酶的活性中 心是由两个含铜离 子位点构 成. 在催化过程中,双 核铜离子位点以3 种 形态存在, 分别是氧化态 ( Eoxy ) 、还原态 ( Emet ) 和脱氧态 ( Edeoxy ) .
研究表明与酪氨酸酶结 合的双核铜离子活性中 心与在 血蓝蛋白中发现的活性 中心非常相似 酪氨酸酶被认为是血蓝 蛋白的祖先蛋白, 因为酪氨酸酶在非常原 始的生物体中也有发现. Eoxy 的结构比血蓝蛋白的结 构更紊乱,因此酪氨酸 酶相对 于血蓝蛋白存在更多构 象不同的底物与其活性 中心结 合.
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酪氨酸酶——
1.引发白癜风 皮肤和毛囊的黑素细胞内酪氨酸酶活性减低或消失，导致 黑素颗粒(即黑素体)生成的进行性减少或消失，而引起的 局限性或泛发性托色素性病变，从而引起白癜风。 酪氨酸酶是白癜风自身免疫的重要抗原。部分白癜风患者 血清中有酪氨酸酶抗体，且与白癜风临床类型和分期密切 相关。提示自身免疫性白癜风发病机制与酪氨酸酶抗体水 平有关，为其免疫治疗提供依据，因此酪氨酸酶抗体可以 作为白癜风活动性的一个指标。
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TYR是一种铜结合蛋白， 有铜A和铜B位点。
离子铜特异性能与人 TYR结合，一个位点的 铜结合可以促进另一个 位点的铜结合。
酪氨酸在铜B位点 协调其结合。
TYR的多肽链的适 当折叠对铜结合及 其催化活性是关键 性的，TYR突变可 中断铜结合使其催 化酶 的作用下，由酪氨 酸酶转化为多巴， 再经一系列复杂的 生化过程而生成。