土壤酶活活性测定方法

土壤脲酶（urease）活性的测定方法：靛酚比色法

（一）方法原理

土壤中脲酶活性的测定是以尿素为基质，酶促水解生成的氨与酚类化合物起反应生成蓝色的靛酚，颜色深度与氨含量相关，因而用于脲酶活性的测定。（二）试剂

1）甲苯

2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100mL。

3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184克和147.5克氢氧化钾溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释至1000毫升。

4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5克苯酚溶于少量乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮，用乙醇稀释至100毫升（A），存于冰箱中；27克NaOH溶于100毫升水（B）。将A、B溶液保存在冰箱中。使用前将2溶液各20毫升混合，用蒸馏水稀释至100毫升。

5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。

6）氮的标准溶液：精确称取0.4717克硫酸铵溶于水并稀释至1000mL，得到1mL含有0.1mg氮的标准液。

（三）测定步骤

（1）标准曲线绘制

吸取配置好的氮溶液10mL，定容至100mL，即稀释了10倍，吸取1，3，5，7，9，11，13mL移至50mL容量瓶，加水至20mL，再加入4mL苯酚钠，仔细混合，加入3mL次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟,用水稀释至刻度。将着色

液在紫外分光光度计上于578nm处进行比色测定，以标准溶液浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制曲线图。

（2）土壤中脲酶活性的测定

称取10 g土壤置于100mL容量瓶中。用2mL甲苯处理15分钟。往瓶中加入10mL 10%尿素溶液和20mL柠檬酸缓冲液（pH6.7）。仔细混合后，将瓶放在37℃恒温箱中，放置3 h。与此同时，进行以水代替基质，及无土壤的基质对照测定。

培养结束后，用热至38℃的水稀释至刻度。摇匀，将悬液过滤。吸取1mL 滤液于50mL容量瓶中，用蒸馏水加至10mL。然后按标准曲线绘制的操作加入苯酚钠等试剂，显色，比色，最后根据标准曲线求出氨态氮含量。

以每克土壤在37℃下24h酶解尿素释放的NH3-N 的毫克数来表示脲酶活性。

土壤蛋白酶活性测定方法：铜盐比色法

（一）方法原理

本法基于以精胶为基质，酶解后所释放的氨基酸使其与铜盐反应形成蓝色复合物。用比色测定颜色深度，计算出氨基酸含量，来度量酶的活性。

（二）试剂

1）1%精胶

2）甲苯

3）铜-磷酸盐溶液：①27.3g CuCl2·H2O溶于 1 L水；②64.5g Na2HPO4·12H2O溶于500mL 水，加入7.2g NaOH，稀释至1L；③57.21g Na2B4O7溶于1.5L 水，加入100毫升0.1 mol/L HCL稀释至2L，使用按照1：2：2的体积分数前将上述①、②、③混合。

4）甘氨酸标准溶液的配制：取267.9mg甘氨酸溶于蒸馏水，稀释至 1 L （1mL含50µg NH3-N）。

（三）操作步骤

（1）标准曲线绘制

取0、5、10、15、20 mL 甘氨酸标准溶液，用蒸馏水加至20 mL，然后加入20 mL 新配制的铜-磷酸盐溶液。显色后，用分光光度计在650nm处测定，绘制标准曲线。

（2）土壤蛋白酶活性测定

称取5g土壤置于100mL 三角瓶中，加入甲苯2mL ，放置15 min，加入20mL 1%精胶溶液，于37℃恒温培养24h，于此同时，以水代替基质作为对照。

培养结束后，将悬液过滤，取10mL 滤液，加水10mL，铜-磷酸盐溶液20mL。显色后，用分光光度计在650nm处测定，根据标准曲线求出NH3-N含量。

以每克土壤在37℃下24h酶解蛋白质释放的NH3-N的质量（µg）表示蛋白酶活性。

土壤磷酸酶测定方法：磷酸苯二钠法

（一）方法原理

本法基于以磷酸苯二钠为基质，酶解释放出的酚，使其与氯代二溴对苯醌亚胺试剂反应生色。用比色法测定出游离的酚量，用以表示磷酸酶活性。

（二）试剂配制

1）0.5％磷酸苯二钠（用缓冲液配制）；

2）pH5醋酸盐缓冲液、pH7柠檬酸盐缓冲液、pH9.4硼酸盐缓冲液；

3）氯代二溴对苯醌亚胺试剂：取0.125g 2,6-二溴苯醌氯酰亚胺，用10mL 96％乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用；

4）酚的标准溶液：

酚原液——取1g重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至1L，贮于棕色瓶中；

酚工作液——取10mL 酚原液稀释至1L（每毫升含0.01毫克酚）；

5）甲苯；

6）0.3％硫酸铝溶液。

（三）操作步骤

（1）标准曲线绘制

取1、3、5、7、9、11和13mL酚工作液，置于50mL容量瓶中，每瓶加入5mL缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，即得0.0002、0.0006、0.0010、0.0014、0.0018、0.0022和0.0026mg·g-1浓度的酚标准溶液梯度。30min后比色测定。绘制标准曲线。

（2）土壤磷酸酶的测定

称取5g风干土置于200mL三角瓶中，加2.5mL甲苯，轻摇15min后，加入20mL 0.5％磷酸苯二钠（酸性磷酸酶用醋酸盐缓冲液；中性磷酸酶用柠檬酸盐缓冲液；碱性磷酸酶用硼酸盐缓冲液），仔细摇匀后放入恒温箱，在37℃下培养24h。后于培养液中加100mL 0.3％硫酸铝溶液并过滤。

吸取3mL滤液于50mL容量瓶中，然后按绘制标准曲线所述方法显色。用硼酸缓冲液时，呈现蓝色，在风光光度计上于660nm处比色。

磷酸酶活性，以37℃下24h后1g土壤中释放处的酚的毫克数表示。

土壤蔗糖酶测定方法：3,5- 二硝基水酸比色法

（一）方法原理

蔗糖酶酶解所生成的还原糖与3,5- 二硝基水酸反应而生成橙色的3-氨基