土壤酶活性测定方法

土壤酶活性测定方法

一、蔗糖酶: 3，5-二硝基水杨酸比色法

1. 试剂配制

（1）2N氢氧化钠200mL：称取16g 氢氧化钠，用蒸馏水溶解，定溶于200mL容量瓶中。

（2）3，5-二硝基水杨酸溶液1000mL：称5g二硝基水杨酸，溶于200mL2N氢氧化钠和500mL蒸馏水中，再加300g酒石酸钾钠，用蒸馏水稀释至1000mL（不超

过7天）。

（3）1/15M 磷酸氢二钠1000mL：23.867g N a2HPO4·12H2O溶于1000mL蒸馏水中。

（4）1/15M 磷酸二氢钾1000mL：9.078g KH2PO4溶于1000mL蒸馏水中。

（5）pH5.5磷酸缓冲液100mL：5 mL磷酸氢二钠(1/15M)加95mL磷酸二氢钾(1/15M) （6）8%蔗糖1000mL：称取80g蔗糖，用水溶解，稀释至1000mL。

（7）甲苯。

（8）标准葡萄糖溶液（1mg/mL）1000mL：取少量葡萄糖在真空干燥箱中，于55℃条件下真空干燥至恒重。然后取1.00g葡萄糖溶于100ml蒸馏水中成标准葡萄

糖母液（10mg还原糖/ml）。取此母液10ml, 用蒸馏水定容至100mL即成标准

葡萄糖液（1mg/ml）；

2. 操作步骤

（1）标准曲线绘制：分别取标准葡萄糖液0.4mL，0.8 mL，1.2mL, 1.6mL, 2.0mL,2.8mL, 3.2mL于50 mL比色管中，另取一管做空白对照。用蒸馏水补足至10mL。加入3.0mL 3，5-二硝基水杨酸，沸水浴5min，随即在自来水流下冷却。最后用蒸馏水稀释至50mL，并在分光光度计上于波长508nm处进行比色。

比色后，以光密度值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制成标准曲线。

（2）土壤蔗糖酶活性测定：称5.00g土样，置于50mL三角瓶中，注入15.0mL 8%蔗糖溶液，5.0mL pH5.5磷酸缓冲液和5滴甲苯。摇匀混合物后，放入恒温箱，在37℃下培养24h。到时取出，6000rpm离心10min。取1.0mL上清液（新鲜土样所吸取的上清液体积为1.0mL；风干土及保存1个月的土样所吸取的上清液体积为0.5mL）于50mL比色管中，然后按绘制标准曲线显色方法进行比色测定。

为消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖引起的误差。每一土样需做无基质对照。整个实验需作无土壤对照。

3．结果计算

蔗糖酶活性以24h后1g土壤葡萄糖的毫克数表示。

葡萄糖（mg）=(a-b)×c

式中 a---从标准曲线查得的样品（加了基质）对应的葡萄糖浓度，mg/mL；

b---从标准曲线查得的样品对照组的葡萄糖浓度，mg/mL；

c---换算成1g土的系数。

二、脲酶: 靛酚比色法

1. 试剂配制

（1）pH6.7柠檬酸盐缓冲液1L：取184g柠檬酸溶于300mL蒸馏水中，另取147.5g KOH溶于水，再将两种溶液合并，用1N NaOH将pH调至6.7，并用水稀至1L。

（2）苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL丙酮，然后用乙醇稀释至100mL(A液)，保存在冰箱中。称取27g NaOH溶于100mL

水中（B液），保存在冰箱中。使用前，取A、B两液各20mL混合，并用蒸馏

水稀释至100mL备用。

（3）次氯酸钠溶液100mL：取10%的次氯酸钠溶液9mL，用水稀释定容于100mL 容量瓶中，即活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。

（4）10%尿素溶液500mL：取50g尿素，用水稀释至500mL。

（5）甲苯。

（6）氮的标准溶液1L：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水并稀释至1L，则得含氮

0.1mg/mL的标准液。再稀释10倍得到N工作液。

2. 操作步骤

（1）标准曲线绘制：分别取氮的工作液1、3、5、7、9、11、13mL于50 mL比色管中，另取一管做空白对照。用蒸馏水加至20mL。再加4.0mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计上于波长578nm处进行比色。根据光密度值与溶液浓度绘制标准曲线。

（2）土壤脲酶活性测定：称5.00g土样，置于50mL三角瓶中，加入1.0mL 甲苯。15min 后加10mL10%尿素液和20mLpH6.7柠檬酸盐缓冲液。摇匀后在37℃恒温箱中培养24h。到时取出，6000rpm离心10min。取3.0mL上清液（新鲜土样所吸取的上清液体积为2.0mL；风干土及保存1个月的土样所吸取的上清液体积为0.5mL）于50mL刻度试管中，然后按绘制标准曲线显色方法进行比色测定。

3. 结果计算

脲酶活性以24h后1g土壤中NH3—N的毫克数表示。

NH3—N（mg）= a×b

式中 a---从标准曲线查得的NH3—N浓度，mg/mL；

b---换算成1g土的系数。

三、蛋白酶：茚三酮比色法

1. 试剂配制

（1）1%酪素溶液1000mL：取10g酪素，用1000mL pH7.4的0.2M磷酸盐缓冲液稀释定容至1L的容量瓶中。

（2）0.1N硫酸。

（3）20%硫酸钠500mL：取100g硫酸钠加水，加热溶解，冷却后稀释至500mL。

（4）2%茚三酮液：2g茚三酮溶于100mL丙酮。

（5）甲苯。

（6）甘氨酸标准溶液：取0.1g甘氨酸溶于水中，定容1L，则得到含氨基氮0.02mg/mL 的标准溶液。

2. 操作步骤

（1）标准曲线绘制：分别取甘氨酸标准溶液1，3，5，7，9，11 mL于50 mL比色管中，另取一管做空白对照。加入1mL茚三酮，冲洗试管内壁后在沸水浴上加热10min，将获得的着色溶液用蒸馏水稀释至50ml。在分光光度计上于波长500nm处进行比色。以光密度为纵坐标，以氨基氮浓度为横坐标，绘制标准曲线。

（2）土壤蛋白酶活性测定：称5.00g土样，置于50mL三角瓶中，加入20mL1%的酪素和1mL 的甲苯，小心振荡后用棉塞塞紧，在30℃恒温箱中放置24h。到时取出，于混合物中加入2mL0.1N硫酸和12mL20%的硫酸钠液，以沉淀蛋白质，然后6000rpm离心15min。取上清液2.0mL滤液（新鲜土样所吸取的滤液体积为1.0mL；风干土及保存1个月的土样所吸取的滤液体积为2.0mL）于50mL比色管中，然后按绘制标准曲线显色方法进行比色测定。

每个土样均要做无基质对照，以除掉土壤原来含有的氨基氮而引起的误差。整个实验要做无土壤对照。

3. 结果计算

蛋白酶活性，以24h后1g土壤中的氨基氮的毫克数表示。

NH2-N(mg)= (a-b)×c

式中 a---从标准曲线查得的样品（加了基质）对应的氨基氮浓度，mg/mL；

b---从标准曲线查得的样品对照组的氨基氮浓度，mg/mL；

c ---换算成1g土的系数。