生物发光检测法分解
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样品ATP提取方法的优化
三种ATP提取方法比较 实验了3 种提取食品 中细菌ATP 的方法。 分别为双蒸水、磷酸 盐缓冲溶液加热提取 和三氯乙酸( 0. 03% TCA) 室温化学裂解 方法。3 种方法提取 结果见右图
a- 双蒸水体系煮沸; b- 磷酸盐缓冲体系 煮沸; c- 三氯乙酸裂解
测定样品生物发光值
反应影响因素考察以及标曲图绘制
影响因素 pH、温度、BSA浓度 标准曲线的绘制 移取100 μL ATP 标准溶液加入微孔板, 再 加入100 μL 虫萤光素-萤光素酶底物溶液, 微孔板振荡器上混匀1 min后立即室温检测。 以ATP 浓度和发光强度分别取对数进行线 性拟和。
反应影响因素考察以及标曲图绘制
ATP生物发光法检测步骤
取样 样品ATP的提取 添加荧光素-荧光素酶 测定生物发光值 计算出ATP的浓度和活菌数量
关键点
ATP的提取 游离的ATP的去除 提取剂的选择 提取条件的优化 反应条件的优化 D-荧光素浓度、萤火虫荧光素酶浓度、反 应pH、温度
便携式荧光光度仪
荧光分光光度仪
ATP生物发光技术举例
pH对发光反应的影响 温度对发光反应的影响
BSA浓度对发光反应的影响
ATP生物发光反应标准曲线
样品ATP的提取
用生理盐水稀释酸奶和经过搅拌机绞碎的 火腿及蛋糕样品。三磷酸腺苷双磷酸酶用 于清除样品中所含游离ATP。 将前处理好的样品与pH 7.4 的缓冲溶液等 体积混合, 沸水浴中加热3 min 提取ATP, 12000 r/min 离心1 min,取上层清液待测。
其他领域的应用
医学领域 药物敏感性试验,新药筛选和药物评价。 细胞学领域 细胞免疫活性检测。 环境工程领域 污染物浓度变化。
未来优化方向
可以尝试将ATP 生物发光法与DNA 分子识 别结合起来,可以鉴定菌种。 建立最优的游离ATP 去除体系。 找到最佳的微生物ATP 提取方法。 确立ATP 酶促反应的最佳百度文库件。
移取100 μL 样品提取液加入微孔板, 再加 入100 μL 虫萤光素-萤光素酶底物溶液, 微 孔板振荡器上混匀1 min后立即室温检测得 出发光值。
计算出ATP的浓度和活菌数量
对照由标准ATP试剂测量所得发光值和 ATP的浓度标准曲线,根据发光值得到 ATP的浓度,最后转化为微生物的浓度。
与传统方法的比较
ATP生物发光技术历史发展
ATP 生物发光法检测ATP 含量最初在1949 年被阐述。 ATP生物发光技术产生于20世纪70年代 1963 年McElroy最先引入荧光素酶-ATP 检测法,发现反应的结果是把化学能转化 为光能。
ATP生物发光技术历史发展
1983 年,Moyer等最早提出细胞内源性 ATP 含量可以反映细胞的活性和活细胞的 数量。同年Gronroos等也证实该技术是一 种可靠、灵敏度高的确定细胞活性度的检 测方法。 20 世纪80 年代,英国人首先研制出ATP 检测仪,并逐步发展到欧洲、美国和日本。 20世纪末,ATP 检测仪及技术被引进我国。
未来发展趋势
随着科学技术的飞速发展,相信ATP 生物 发光法会变得更加成熟,其相应的仪器设 备等也会越来越先进,满足食品、医疗、 环境等行业的实际需求,为我们人类造福。
ATP生物发光法原理
D-荧光素+ATP+O2
总思路:荧光
荧光素酶 Mg2+
Oxy-荧光素+AMP+PPi+H2O+荧光
微生物数量
ATP
第一步:荧光
ATP
其他底物过量,荧光强度与ATP含量成正比。 第二步:ATP 微生物数量
ATP仅存在于活的生物体中,且每个细胞的ATP含量大致相 同,因此可通过ATP的含量确定活的微生物的含量。
实验目的:
探索提取以及反应的最佳条件 分别用ATP生物发光法和菌落计数法测定 五种样品(青岛啤酒、三鹿君乐宝酸奶、 三鹿君乐宝高该酸奶、双汇王中王火腿和 康师傅妙芙欧式蛋糕)中的细菌含量,并 比较这两种方法的相关性。
实验主要仪器与试剂
仪器 搅拌机、离心机、微孔板、微孔振荡器、 微孔板发光分析仪 试剂 ATP、萤光素、萤光素酶、三磷酸腺苷双 磷酸酶、小牛血清白蛋白(BSA)、三氯 乙酸、缓冲溶液、双氧水
ATP生物发光技术
食品加工与安全研1301 胡程
萤火虫
栉水母
发光海虫
腰鞭毛虫
发光蘑菇
初识生物发光
生物发光是指生物自身发光细胞构成发光 器而发光。生物发光属于化学发光的范畴, 化学能转化为光能的效率几乎为100%。 发光机制:细胞合成的化合物质,在特定 酶的作用下,使化学能转化为光能。 近年来,多种生物发光技术已经广泛应用 到科学的各个领域,其中ATP生物发光技 术是应用比较成熟的一种技术。
同时参照GBPT 4789. 2- 2003 , 采用传统方法培养 样品中细菌, 进行 菌落计数,其结果 与ATP生物发光法 方法检出ATP浓度 相比较。
生物发光法检测结果与 传统方法培养结果相关比较
ATP生物发光技术优点
检测灵敏 操作简便 结果快速 准确率较高 测定范围广
ATP生物发光技术缺点
受游离ATP和体细胞的影响 无法鉴定细菌种属 试剂昂贵 酶促反应影响条件多 某些时候灵敏度不够
ATP生物发光法在食品领域的应用
食品快速筛选和检测(微生物的快速检测) 肉品新鲜度,乳制品中的乳酸菌,啤酒中 菌落总数,脱水蔬菜的细菌学测定,粉状 食品和调味食品的细菌学测定。 食品生产设备与环境 色素、致癌物 农药残留