8 第八章 原位杂交组织化学
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第八章 原位杂交组织化学
原位杂交组织化学（ISHH）
原理： 用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定核酸 序列的方法。 特点：杂交在载玻片上的细胞进行。 分类： 根据所用探针和靶核苷酸不同--
DNA-DNA杂交、 DNA-RNA杂交、 RNA-RNA杂交
根据探针标记物是否直接被检测— 直接法、间接法
包括系列不同浓度，不同温度的盐溶液的漂洗。
目的：通过杂交后的洗涤将组织切片中非碱基配对除去，有
效地减低背景染色，获得较好的反差效果。 洗涤的条件：如盐溶液的浓度、温度、洗涤次数和时间因核 酸探针的类型和标记的种类不同而略有差异，一般遵循的共 同原则是盐溶液浓度由高到低，而温度则由低到高。
注意事项： 漂洗过程中切勿使切片干燥。干燥的切片即使大量的溶液 漂洗也很难减少非特异性结合，从而增强了背景染色。 放射性标记探针杂交后漂洗过程中可用底片曝光的方法测 背景染色作为改善漂洗程序的指针。
5 显示
Visualization
又称检测系统 Detection system
根据核酸探针标记物的种类分别进行放射自显影或利用酶检
测系统进行不同显色处理。 放射自显影： 图象分析仪检测银粒的数量和分布的差异。 非放射性核酸探针杂交的细胞或组织： 酶检测系统显色 显微分光光度计或图像分析仪检测。
低严格度：杂交及冲洗条件在Tm35–40℃之间，高盐或低 甲酰胺浓度。大约有70%～90%的同源性核苷酸序列被结 合，可导致非特异性杂交信号的产生。 中严格度：Tm 20-30℃的范围。 高严格度：为 Tm10-15℃，低盐和高甲酰胺浓度。只有 具有高同源性的核苷酸序列才能形成稳定的结合。
4 杂交后处理
（二）核酸探针
1
核酸探针的种类
2 探针的标记与应用
1 核酸探针的种类
（1）按标记方式分类
直接法和间接法：
１）直接标记探针 应用藕联异硫氰酸荧光素（FITC）或罗丹明Rhodamine 等荧光物质的dNTP或NTP直接标记探针，杂交洗涤后即可在 显微镜下检测。 ２）间接标记探针 采用生物素或地高辛等半抗原分子作为分子标记探针， 杂交洗涤后分别用抗生物素抗体和抗地高辛抗体作为配体 进行检测，配体上分别连有不同的荧光物质，在荧光显微 镜下观察分析。
（3）减低背景染色
预杂交（Prehybridization）: 是减低背景染色的一种有效手段。预杂交液和杂交
液的区别在于前者不含探针和硫酸葡聚糖。将组织切片
浸入预杂交液中可达到封闭非特异性杂交点的目的，从 而减低背景染色。
杂交后洗涤: 采用低浓度的RNA酶溶液（20μg/ml）洗涤一次，去
除残留的和内源性的RNA酶，减低背景染色。
5 显示
6 对照实验和ISHH结果的判断
1 固定
固定剂的应用和选择原则： ① 保持细胞结构； ② 最大限度地保持细胞内DNA或RNA水平； ③ 使探针易于进入细胞或组织。
DNA：比较稳定，对于DNA的定位来说，固定剂的种类 和浓度并不十分重要。 RNA：易被降解，在RNA的定位上，要使RNA的降解减少 到最低限度，固定剂的种类、浓度和固定的时间十分 重要，而且取材后应尽快予以冷冻或固定。
（2）探针的长度
最佳长度应在50～100个碱基之间。 探针短--- 易进入细胞，杂交率高，杂交时间短。 500个碱基的探针--- 杂交时间约需20h左右。
200～500个碱基的探针--- 可应用.
超过500个碱基的探针--- 在杂交前最好用碱或水解酶进
行水解，使其变成短的片段，
达到实验所需求的碱基数。
冷冻切片—— 应用多聚甲醛蒸汽固定干燥后的冷冻切片 也可获得满意效果。
2 玻片和组织切片的处理
（1）玻片的处理
热肥皂刷洗 自来水清洗 清洁液中浸泡24h 清水洗净
烘干
95%酒精中浸泡24h
源自文库
蒸馏水冲洗
烘干
烘箱温度＞150℃过夜以去除RNA酶
盖玻片硅化处理 锡箔纸包裹无尘存放
（2）增强组织的通透性和核酸探针的穿透性 根据应用固定剂种类、组织种类、切片厚度和核酸探 针长度而定。 常用方法： 稀释的酸洗涤、去垢剂或称清洗剂 Triton X-100、酒精或 某些消化酶等。 优点: 通过去蛋白作用增强组织通透性和探针的穿透性,提高杂 交信号. 缺点: 减低RNA的保存,影响组织结构形态.因此，在用量及孵 育时间上应慎为掌握。
随机引物法 (Random Primer)
末端标记法 PCR标记法 体外转录标记法
生物素标记cRNA探针 在原位杂交组织化学中的应用
1 光敏生物素标记cRNA探针的应用 2 酶促生物素标记cRNA探针的应用
1 光敏生物素标记cRNA探针的应用
光敏生物素标记核酸方法，不需昂贵的酶，只在光照 10 ～ 20min，生物素就结合在DNA或RNA分子上，属于化学修饰法， 此方法简单；成本低；适用于大量制备（>50ug）。
一 原位杂交的由来与发展
（一）核酸分子杂交技术
按其作用方式大致分为液相杂交和固相杂交两种 液相杂交：参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。 液相分子杂交技术包括： ① 吸附杂交 ② 发光液相杂交 ③ 液相夹心杂交 ④ 复性速率液相分子杂交
固相杂交： 是将参加反应的一条核酸链固定在固体的支持物上常 用的有硝酸纤维素滤膜，其它如尼龙膜、乳胶颗粒和微 孔板等），另一条参加反应的核酸链游离在溶液中。 ① 菌落原位杂交 ② 斑点杂交法 ③ Southern印迹杂交
杂交时间：
16-20h或孵育过夜
（4）杂交严格度（Hybridization stringency ）
杂交严格度：表示通过杂交及冲洗条件的选择对完全配对 及不完全配对杂交体的鉴别程度。 错配对杂交的稳定性较完全配对杂交体差，因此，通过 控制杂交温度、盐浓度等，可减弱非特异性杂交体的形成， 提高杂交的特异性。所以，杂交的条件愈高，特异性愈强， 但敏感性降低，反应亦然。
两种方法的比较：
（1）直接标记的DNA探针杂交后经过简单洗涤就可显
示杂交信号，简单方便，而间接标记的探针杂交后需 通过繁琐的检测步骤；
（2）间接标记的探针可进行多步骤信号放大，但其受
配基亲和力的影响。而直接标记的信号放大一般受到 限制，目前多用Dupon公司的TSA系统进行直接标记信 号的放大。
（4）防止RNA酶的污染
① 在整个杂交前处理过程都需戴消毒手套。
② 所有实验用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日臵高温
烘烤——消除RNA酶,亦可用消毒锅。
③ 要破坏RNA酶，最低温度必须在150℃左右。 ④ 消毒的玻璃器皿外包以锡箔纸以利于标记和防止取出 时空气污染。 ⑤ 杂交前及杂交时所用的溶液需经高压消毒处理。
杂交注意环节
（1）探针的浓度
原则:探针浓度必须给予该实验最大的信/噪比值。最佳原 则应是应用最低探针浓度以达到与靶核苷酸的最大饱和结合 度为目的。 杂交液的量要适当:
以10～20μl/每张切片为宜。
杂交液过多浪费，且液量过多常易致盖玻片滑动脱落,过量 的杂交液含核酸探针浓度过高，易导致高背景染色等后果。
3 杂交（Hybridisation）
杂交:核酸探针进入细胞或组织与其内的靶核苷酸相结合。
是ISHH中关键的而且是最重要的一个环节。
杂交方式:是将杂交液滴于切片组织上，加盖硅化的盖玻片。
加盖片的目的
防止孵育过程中的高温（50℃左右）导致杂交液的蒸发; 硅化的盖玻片的优点是清洁无杂质，光滑,无气泡,不会影响 组织切片与杂交液的接触; 盖玻片自身重量能与杂交液吸附达到覆盖和防蒸发的作用。
光敏生物素核酸探针原位杂交组化程序如下：
１ 石蜡切片脱蜡入水后，PBS洗；冰冻切片直接入PBS洗。 ２ 0.1mol/L甘氨酸PBS洗5min。 ３ 0.4%Trixtion X-100 PBS洗15min。 ４ 1ug/ml蛋白酶K，37℃保温30min。 ５ 4%多聚甲醛PBS固定。 ６ 0.1mol/L PBS洗2×3min。 ７ 0.25%乙酸酐10min。 ８ 2×SSC洗10min。 ９ 取10ul含相应探针的杂交液滴于标本上，如果是cDNA探 针，则用前将探针于95℃水浴中保温10min，马上冰浴冷 却，然后再用。 10 盖上硅化盖玻片或蜡膜，43℃湿盒保温12—16h。
光敏生物素试剂种类： 光生物素（乙酸盐） 补骨脂素生物素。 生物素-聚乙二醇-当归素（BPA）：在长波UV下它可与DNA 碱基共价键结合。BPA反应物与DNA结合比光敏生物素更特 异，在可见光下它不与核酸反应，这个特异性可使BPA只 标记粗制细胞裂解物中的核酸，而不标记蛋白、多糖和其 他细胞大分子。
二 原位杂交组织化学基本技术
原位杂交的基本方法和应用原则：
① 杂交前准备，包括固定、取材、玻片和组织的处理，
如何增强核酸探针的穿透性、减低背景染色等； ② 杂交； ③ 杂交后处理； ④ 显示（visualization）： 放射性自显影显色、非放射性标记显色
（一）原位杂交的基本要求
1 固定 2 玻片和组织切片的处理 3 杂交 4 杂交后处理
箱温度恒定，在-70℃可保存数月之久不会影响杂交结 果。
病理学活检取材—— 福尔马林固定和石蜡包埋，这种标 本对检测DNA和mRNA有时也可获得杂交信号。
石蜡包埋切片—— 由于与蛋白质交叉连接的增加，影响 核酸探针的穿透，因而杂交信号常低于冰冻切片，同时， 在包埋的过程中可减低mRNA的含量。
6 对照实验和ISHH结果的判断
① Northern 和 Southern印迹杂交法。 ② 可用结合的免疫组织化学和ISHH法从蛋白质（或多肽）水 平和转录水平在相邻切片或同一切片中证明同一种多肽和相 应mRNA共存于同一细胞中。 ③ 预先将切片用DNA酶或RNA酶消化，然后用ISHH技术证明 丢失的是DNA或RNA。事先与特异性的cRNA或cDNA进行杂交。 再进行ISHH，其结果应为阴性。由于同一RNA探针和组织内 mRNA序列顺序是相同的，应用其进行ISHH，结果应为阴性。 ④ 检测系统的对照如乳胶或酶显色系统也应在无标记探针 的情况下进行。 多因素都将影响ISHH的实验结果。
（3）杂交的温度和时间
杂交温度：
DNA或RNA需加热或变性、解链后才能进行杂交。原位杂
交中，DNA、RNA探针需要的Tm分别是90℃、95℃，这种 高温对保存组织形态完整和保持组织切片粘附在载玻片 上是不可能的。因此，在杂交液中加入盐和甲酰胺，减 低Tm。根据探针的种类不同，温度略有差异。
甲酰胺和硫酸葡聚糖：
固定剂：
多聚甲醛、醋酸-酒精混合液、Bouin’s固定剂、 Carnoy’s液 优缺点：
沉淀性固定剂：酒精/醋酸混合液、Bouin’s液、 Carnoy’s液
能增加核酸探针的穿透性，但不能最大限度地保存RNA， 且对组织结构有损伤。 戊二醛：能较好地保存RNA和组织形态结构，但由于和蛋白质 产生广泛的交叉连接，从而影响了核酸探针的穿透性。
甲酰胺：在杂交液中占50%左右；调节杂交反应温度，利于 保持组织形态结构；防止低温时非同源性片段结合；但具 有破坏氢键的不稳定作用。 硫酸葡聚糖：在核酸杂交液中硫酸葡聚糖占10%左右；是一 种大分子的多聚胺化合物，具有极强的水合作用，因而能 大大增加杂交液的粘稠度；促进杂交率，特别是对双链核 酸探针。
（3）对于多色FISH，往往选择直接标记法标记探针。
（2）按核酸性质分类
① ② ③ ④
DNA探针 cDNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针
（3）按染色体上位臵分类： ① 重复序列探针
② 涂染探针 ③ 基因探针及其它
2 探针的标记与应用
不同模板需不同标记方法
切口平移法（Nick translation）
多聚甲醛：仍被公认为ISHH较为理想的固定剂。
多聚甲醛——mRNA的定位
将组织固定于4%多聚甲醛磷酸缓冲液中1～2h，在冷冻 前浸入15%蔗糖溶液中，臵4℃冰箱过夜，次日切片或保
存在液氮中待恒冷箱切片机或振荡切片机切片。
组织也可在取材后直接臵入液氮冷冻，切片后才将其浸 入4%多聚甲醛约10min，空气干燥后保存在-70℃。如冰
固相杂交技术包括：
④ Northern印迹杂交
⑤ 组织原位杂交
（二）原位杂交技术的发展
在近20年飞跃发展的突出特点： ① 由分子遗传学研究提供的探针大量增加； ② 探针生产的可靠性和速率大大发展了； ③ 非放射性标记物的发展使原位杂交技术成为实验室的常 规技术和临床日常应用的诊断技术。 ④ 新的非放射性标记技术正在继续不断涌现。
原位杂交组织化学（ISHH）
原理： 用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定核酸 序列的方法。 特点：杂交在载玻片上的细胞进行。 分类： 根据所用探针和靶核苷酸不同--
DNA-DNA杂交、 DNA-RNA杂交、 RNA-RNA杂交
根据探针标记物是否直接被检测— 直接法、间接法
包括系列不同浓度，不同温度的盐溶液的漂洗。
目的：通过杂交后的洗涤将组织切片中非碱基配对除去，有
效地减低背景染色，获得较好的反差效果。 洗涤的条件：如盐溶液的浓度、温度、洗涤次数和时间因核 酸探针的类型和标记的种类不同而略有差异，一般遵循的共 同原则是盐溶液浓度由高到低，而温度则由低到高。
注意事项： 漂洗过程中切勿使切片干燥。干燥的切片即使大量的溶液 漂洗也很难减少非特异性结合，从而增强了背景染色。 放射性标记探针杂交后漂洗过程中可用底片曝光的方法测 背景染色作为改善漂洗程序的指针。
5 显示
Visualization
又称检测系统 Detection system
根据核酸探针标记物的种类分别进行放射自显影或利用酶检
测系统进行不同显色处理。 放射自显影： 图象分析仪检测银粒的数量和分布的差异。 非放射性核酸探针杂交的细胞或组织： 酶检测系统显色 显微分光光度计或图像分析仪检测。
低严格度：杂交及冲洗条件在Tm35–40℃之间，高盐或低 甲酰胺浓度。大约有70%～90%的同源性核苷酸序列被结 合，可导致非特异性杂交信号的产生。 中严格度：Tm 20-30℃的范围。 高严格度：为 Tm10-15℃，低盐和高甲酰胺浓度。只有 具有高同源性的核苷酸序列才能形成稳定的结合。
4 杂交后处理
（二）核酸探针
1
核酸探针的种类
2 探针的标记与应用
1 核酸探针的种类
（1）按标记方式分类
直接法和间接法：
１）直接标记探针 应用藕联异硫氰酸荧光素（FITC）或罗丹明Rhodamine 等荧光物质的dNTP或NTP直接标记探针，杂交洗涤后即可在 显微镜下检测。 ２）间接标记探针 采用生物素或地高辛等半抗原分子作为分子标记探针， 杂交洗涤后分别用抗生物素抗体和抗地高辛抗体作为配体 进行检测，配体上分别连有不同的荧光物质，在荧光显微 镜下观察分析。
（3）减低背景染色
预杂交（Prehybridization）: 是减低背景染色的一种有效手段。预杂交液和杂交
液的区别在于前者不含探针和硫酸葡聚糖。将组织切片
浸入预杂交液中可达到封闭非特异性杂交点的目的，从 而减低背景染色。
杂交后洗涤: 采用低浓度的RNA酶溶液（20μg/ml）洗涤一次，去
除残留的和内源性的RNA酶，减低背景染色。
5 显示
6 对照实验和ISHH结果的判断
1 固定
固定剂的应用和选择原则： ① 保持细胞结构； ② 最大限度地保持细胞内DNA或RNA水平； ③ 使探针易于进入细胞或组织。
DNA：比较稳定，对于DNA的定位来说，固定剂的种类 和浓度并不十分重要。 RNA：易被降解，在RNA的定位上，要使RNA的降解减少 到最低限度，固定剂的种类、浓度和固定的时间十分 重要，而且取材后应尽快予以冷冻或固定。
（2）探针的长度
最佳长度应在50～100个碱基之间。 探针短--- 易进入细胞，杂交率高，杂交时间短。 500个碱基的探针--- 杂交时间约需20h左右。
200～500个碱基的探针--- 可应用.
超过500个碱基的探针--- 在杂交前最好用碱或水解酶进
行水解，使其变成短的片段，
达到实验所需求的碱基数。
冷冻切片—— 应用多聚甲醛蒸汽固定干燥后的冷冻切片 也可获得满意效果。
2 玻片和组织切片的处理
（1）玻片的处理
热肥皂刷洗 自来水清洗 清洁液中浸泡24h 清水洗净
烘干
95%酒精中浸泡24h
源自文库
蒸馏水冲洗
烘干
烘箱温度＞150℃过夜以去除RNA酶
盖玻片硅化处理 锡箔纸包裹无尘存放
（2）增强组织的通透性和核酸探针的穿透性 根据应用固定剂种类、组织种类、切片厚度和核酸探 针长度而定。 常用方法： 稀释的酸洗涤、去垢剂或称清洗剂 Triton X-100、酒精或 某些消化酶等。 优点: 通过去蛋白作用增强组织通透性和探针的穿透性,提高杂 交信号. 缺点: 减低RNA的保存,影响组织结构形态.因此，在用量及孵 育时间上应慎为掌握。
随机引物法 (Random Primer)
末端标记法 PCR标记法 体外转录标记法
生物素标记cRNA探针 在原位杂交组织化学中的应用
1 光敏生物素标记cRNA探针的应用 2 酶促生物素标记cRNA探针的应用
1 光敏生物素标记cRNA探针的应用
光敏生物素标记核酸方法，不需昂贵的酶，只在光照 10 ～ 20min，生物素就结合在DNA或RNA分子上，属于化学修饰法， 此方法简单；成本低；适用于大量制备（>50ug）。
一 原位杂交的由来与发展
（一）核酸分子杂交技术
按其作用方式大致分为液相杂交和固相杂交两种 液相杂交：参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。 液相分子杂交技术包括： ① 吸附杂交 ② 发光液相杂交 ③ 液相夹心杂交 ④ 复性速率液相分子杂交
固相杂交： 是将参加反应的一条核酸链固定在固体的支持物上常 用的有硝酸纤维素滤膜，其它如尼龙膜、乳胶颗粒和微 孔板等），另一条参加反应的核酸链游离在溶液中。 ① 菌落原位杂交 ② 斑点杂交法 ③ Southern印迹杂交
杂交时间：
16-20h或孵育过夜
（4）杂交严格度（Hybridization stringency ）
杂交严格度：表示通过杂交及冲洗条件的选择对完全配对 及不完全配对杂交体的鉴别程度。 错配对杂交的稳定性较完全配对杂交体差，因此，通过 控制杂交温度、盐浓度等，可减弱非特异性杂交体的形成， 提高杂交的特异性。所以，杂交的条件愈高，特异性愈强， 但敏感性降低，反应亦然。
两种方法的比较：
（1）直接标记的DNA探针杂交后经过简单洗涤就可显
示杂交信号，简单方便，而间接标记的探针杂交后需 通过繁琐的检测步骤；
（2）间接标记的探针可进行多步骤信号放大，但其受
配基亲和力的影响。而直接标记的信号放大一般受到 限制，目前多用Dupon公司的TSA系统进行直接标记信 号的放大。
（4）防止RNA酶的污染
① 在整个杂交前处理过程都需戴消毒手套。
② 所有实验用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日臵高温
烘烤——消除RNA酶,亦可用消毒锅。
③ 要破坏RNA酶，最低温度必须在150℃左右。 ④ 消毒的玻璃器皿外包以锡箔纸以利于标记和防止取出 时空气污染。 ⑤ 杂交前及杂交时所用的溶液需经高压消毒处理。
杂交注意环节
（1）探针的浓度
原则:探针浓度必须给予该实验最大的信/噪比值。最佳原 则应是应用最低探针浓度以达到与靶核苷酸的最大饱和结合 度为目的。 杂交液的量要适当:
以10～20μl/每张切片为宜。
杂交液过多浪费，且液量过多常易致盖玻片滑动脱落,过量 的杂交液含核酸探针浓度过高，易导致高背景染色等后果。
3 杂交（Hybridisation）
杂交:核酸探针进入细胞或组织与其内的靶核苷酸相结合。
是ISHH中关键的而且是最重要的一个环节。
杂交方式:是将杂交液滴于切片组织上，加盖硅化的盖玻片。
加盖片的目的
防止孵育过程中的高温（50℃左右）导致杂交液的蒸发; 硅化的盖玻片的优点是清洁无杂质，光滑,无气泡,不会影响 组织切片与杂交液的接触; 盖玻片自身重量能与杂交液吸附达到覆盖和防蒸发的作用。
光敏生物素核酸探针原位杂交组化程序如下：
１ 石蜡切片脱蜡入水后，PBS洗；冰冻切片直接入PBS洗。 ２ 0.1mol/L甘氨酸PBS洗5min。 ３ 0.4%Trixtion X-100 PBS洗15min。 ４ 1ug/ml蛋白酶K，37℃保温30min。 ５ 4%多聚甲醛PBS固定。 ６ 0.1mol/L PBS洗2×3min。 ７ 0.25%乙酸酐10min。 ８ 2×SSC洗10min。 ９ 取10ul含相应探针的杂交液滴于标本上，如果是cDNA探 针，则用前将探针于95℃水浴中保温10min，马上冰浴冷 却，然后再用。 10 盖上硅化盖玻片或蜡膜，43℃湿盒保温12—16h。
光敏生物素试剂种类： 光生物素（乙酸盐） 补骨脂素生物素。 生物素-聚乙二醇-当归素（BPA）：在长波UV下它可与DNA 碱基共价键结合。BPA反应物与DNA结合比光敏生物素更特 异，在可见光下它不与核酸反应，这个特异性可使BPA只 标记粗制细胞裂解物中的核酸，而不标记蛋白、多糖和其 他细胞大分子。
二 原位杂交组织化学基本技术
原位杂交的基本方法和应用原则：
① 杂交前准备，包括固定、取材、玻片和组织的处理，
如何增强核酸探针的穿透性、减低背景染色等； ② 杂交； ③ 杂交后处理； ④ 显示（visualization）： 放射性自显影显色、非放射性标记显色
（一）原位杂交的基本要求
1 固定 2 玻片和组织切片的处理 3 杂交 4 杂交后处理
箱温度恒定，在-70℃可保存数月之久不会影响杂交结 果。
病理学活检取材—— 福尔马林固定和石蜡包埋，这种标 本对检测DNA和mRNA有时也可获得杂交信号。
石蜡包埋切片—— 由于与蛋白质交叉连接的增加，影响 核酸探针的穿透，因而杂交信号常低于冰冻切片，同时， 在包埋的过程中可减低mRNA的含量。
6 对照实验和ISHH结果的判断
① Northern 和 Southern印迹杂交法。 ② 可用结合的免疫组织化学和ISHH法从蛋白质（或多肽）水 平和转录水平在相邻切片或同一切片中证明同一种多肽和相 应mRNA共存于同一细胞中。 ③ 预先将切片用DNA酶或RNA酶消化，然后用ISHH技术证明 丢失的是DNA或RNA。事先与特异性的cRNA或cDNA进行杂交。 再进行ISHH，其结果应为阴性。由于同一RNA探针和组织内 mRNA序列顺序是相同的，应用其进行ISHH，结果应为阴性。 ④ 检测系统的对照如乳胶或酶显色系统也应在无标记探针 的情况下进行。 多因素都将影响ISHH的实验结果。
（3）杂交的温度和时间
杂交温度：
DNA或RNA需加热或变性、解链后才能进行杂交。原位杂
交中，DNA、RNA探针需要的Tm分别是90℃、95℃，这种 高温对保存组织形态完整和保持组织切片粘附在载玻片 上是不可能的。因此，在杂交液中加入盐和甲酰胺，减 低Tm。根据探针的种类不同，温度略有差异。
甲酰胺和硫酸葡聚糖：
固定剂：
多聚甲醛、醋酸-酒精混合液、Bouin’s固定剂、 Carnoy’s液 优缺点：
沉淀性固定剂：酒精/醋酸混合液、Bouin’s液、 Carnoy’s液
能增加核酸探针的穿透性，但不能最大限度地保存RNA， 且对组织结构有损伤。 戊二醛：能较好地保存RNA和组织形态结构，但由于和蛋白质 产生广泛的交叉连接，从而影响了核酸探针的穿透性。
甲酰胺：在杂交液中占50%左右；调节杂交反应温度，利于 保持组织形态结构；防止低温时非同源性片段结合；但具 有破坏氢键的不稳定作用。 硫酸葡聚糖：在核酸杂交液中硫酸葡聚糖占10%左右；是一 种大分子的多聚胺化合物，具有极强的水合作用，因而能 大大增加杂交液的粘稠度；促进杂交率，特别是对双链核 酸探针。
（3）对于多色FISH，往往选择直接标记法标记探针。
（2）按核酸性质分类
① ② ③ ④
DNA探针 cDNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针
（3）按染色体上位臵分类： ① 重复序列探针
② 涂染探针 ③ 基因探针及其它
2 探针的标记与应用
不同模板需不同标记方法
切口平移法（Nick translation）
多聚甲醛：仍被公认为ISHH较为理想的固定剂。
多聚甲醛——mRNA的定位
将组织固定于4%多聚甲醛磷酸缓冲液中1～2h，在冷冻 前浸入15%蔗糖溶液中，臵4℃冰箱过夜，次日切片或保
存在液氮中待恒冷箱切片机或振荡切片机切片。
组织也可在取材后直接臵入液氮冷冻，切片后才将其浸 入4%多聚甲醛约10min，空气干燥后保存在-70℃。如冰
固相杂交技术包括：
④ Northern印迹杂交
⑤ 组织原位杂交
（二）原位杂交技术的发展
在近20年飞跃发展的突出特点： ① 由分子遗传学研究提供的探针大量增加； ② 探针生产的可靠性和速率大大发展了； ③ 非放射性标记物的发展使原位杂交技术成为实验室的常 规技术和临床日常应用的诊断技术。 ④ 新的非放射性标记技术正在继续不断涌现。