实验六 血清ALT活性测定1

丙酮酸 α-酮戊二酸
+ 2,4 二硝基苯肼 丙酮酸丙酮酸-2,4 二硝基苯腙 α-酮戊二酸-2,4二硝基苯腙 酮戊二酸-2,4二硝基苯腙
两者在 碱性条件下 呈 红棕色 ，等摩尔浓度条件 下，丙酮酸 OD 值 大 a-酮戊二酸 3倍。
四、试剂：省略 试剂：
℃ 五、操作步骤：1、将 基质缓冲液 和 血清 在 37℃ 水浴箱 操作步骤： 、 2、按下表操作： 按下表操作： 预温5min。 预温 。 加入物 （ml） ml） 对照管 (B) 测定管 (U) 血清 0.1 0.1 基质缓冲液 — 0.5 混匀，37℃水浴30min 准确记时） 30min（ 混匀，37℃水浴30min（准确记时） 2,4— 2,4—二硝基苯肼溶液 基质缓冲液 0.5 0.5 0.5 —
四、ALT测定的临床意义： ALT测定的临床意义 测定的临床意义：
作为（肝脏）疾病诊断和预后判断的指 作为（肝脏） 标之一。 标之一。
五、测定血清ALT的方法： 测定血清ALT的方法 的方法：
King法 金氏法） King法（金氏法） Reitman法 赖氏法） Reitman法（赖氏法） Mohun法 穆氏法） Mohun法（穆氏法） 1981年全国生化检验方法学讨论会确定 1981年全国生化检验方法学讨论会确定 用赖氏法（改良）作为临床首选，单位为： 用赖氏法（改良）作为临床首选，单位为： 卡门氏单位 。
பைடு நூலகம்
八、实验报告： 实验报告：
1、实验目的及要求： 、实验目的及要求： 2、实验原理： 、实验原理： 3、材料与方法：只写自己所完成的操作 、材料与方法： 4、实验结果：原始结果、计算结果、标准曲线 、实验结果：原始结果、计算结果、 5、体会：结合具体情况 、体会：
九、思考题： 思考题：
2．严重脂血症或黄疸、溶血的血清可 ．严重脂血症或黄疸、 能会引起测定管吸光度增加， 能会引起测定管吸光度增加，因此检测此类 标本时，应作血清对照管。 标本时，应作血清对照管。
3．赖氏法原法标准曲线只到97卡门 赖氏法原法标准曲线只到97卡门 氏单位，直线关系很好。 氏单位，直线关系很好。超过此活力的标本 应稀释后再测，临床上应用甚为不便， 应稀释后再测，临床上应用甚为不便，故卫 生部临检中心推荐法建议标准曲线延长到 150卡门氏单位 实际已不完全成直线了， 150卡门氏单位，实际已不完全成直线了， 卡门氏单位， 只能大致反应酶活性的大小、 只能大致反应酶活性的大小、当血清标本酶 活性超过150卡门氏单位时 卡门氏单位时， 活性超过150卡门氏单位时，应将血清用生 理盐水或缓冲液稀释5 理盐水或缓冲液稀释5倍后再进 行测定。 行测定。
混匀，37℃水浴20min； 20min； 混匀，37℃水浴20min 各管加入0.4 各管加入0.4 M NaOH 5.0 ml，室温放置10 min； ml，室温放置10 min； 在波长505 在波长505 nm 处，以蒸馏水校正零点，读取各管吸光 蒸馏水校正零点， 校正零点 度；根据 (AU--AB) 标准曲线，得到酶活性的卡门氏单位数。 --A 标准曲线，得到酶活性的卡门氏单位数。
实验六 血清ALT活性测定 血清ALT活性测定
复习： 复习：
一、何谓ALT？ 何谓ALT？ 谷丙转氨酶
（glutamic pyruvic transaminase，GPT） transaminase，GPT） 丙氨酸氨基转移酶 （alanine aminotransferase，ALT） aminotransferase，ALT）
二、ALT催化的化学反应: ALT催化的化学反应 催化的化学反应:
反应式
大多数氨基酸可参与转氨基作用， 大多数氨基酸可参与转氨基作用，但赖 氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸除外。 氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸除外。
丙氨酸 +α-酮戊二酸
ALT
丙酮酸 + 谷氨酸
三、ALT的分布: ALT的分布 的分布:
主要分布于肝、肾细胞、心肌细胞等， 主要分布于肝、肾细胞、心肌细胞等，血 清中的含量很低。 清中的含量很低。 病变时，细胞受损，血清ALT含量升高。 ALT含量升高 病变时，细胞受损，血清ALT含量升高。
实验六
血清ALT活性测定 血清ALT活性测定
---改良赖氏法 ---改良赖氏法
一、实验性质：分析性 实验性质： 二、目的及要求
1、掌握ALT测定的原理及临床意义 掌握ALT测定的原理及临床意义 2、熟习测定的操作方法。 熟习测定的操作方法。
三、原理 ：
在一定反应条件下 ( pH7.4，37℃ ) , pH7.4， ℃ min： 作用 30 min： ALT（ ALT（血清） 丙氨酸 +α-酮戊二酸 基质液 丙酮酸 + 谷氨酸
4．加入2,4-二硝基苯肼溶液后需充分 ．加入 二硝基苯肼溶液后需充分 振荡混匀，否则会影响重复性； 振荡混匀，否则会影响重复性；加氢氧化 钠溶液方法要一致 方法要一致， 钠溶液方法要一致，不同方法也会导致吸 光度读数的差异。 光度读数的差异。 5．基质缓冲液和 2,4-二硝基苯肼溶液 ． 二硝基苯肼溶液 配制必须准确， 配制必须准确，每次测定时空白管吸光度 上下波动不应超过0.015，如超出此范围应 上下波动不应超过 ， 检查试剂及仪器等方面的问题。 检查试剂及仪器等方面的问题。
3、标准曲线的绘制： 、标准曲线的绘制：
管号 磷酸盐缓冲液（ml） 磷酸盐缓冲液（ml） 丙酮酸标准液（ml） 丙酮酸标准液（ml） 基质缓冲液（ml） 基质缓冲液（ml） 0 0.10 — 0.50 相当于酶活性 （卡门氏单位） — 卡门氏单位） 1 0.10 0.05 0.45 28 2 0.10 0.10 0.40 57 3 4 0.10 0.10 0.15 0.20 0.35 0.30 97 150
六、结果分析： 结果分析：
正常参考值： ～ 卡门氏单位 正常参考值：5～25卡门氏单位
七、注意事项： 注意事项： 1．一般血清标本内源性酮酸很少，血 一般血清标本内源性酮酸很少， 清对照管吸光度读数接近试剂空白管 清对照管吸光度读数接近试剂空白管 ( 以 0.1ml蒸馏水或生理盐水代替血清 0.1ml蒸馏水或生理盐水代替血清，其它和对 蒸馏水或生理盐水代替血清， 照管同样操作) 所以大批标本测定时， 照管同样操作)，所以大批标本测定时，一般 不需要每一标本都作血清对照管， 不需要每一标本都作血清对照管，以试剂空 白管代替即可 代替即可。 白管代替即可。但建议对超过正常的标本进 行复查，复查时每份标本应作对照管。 行复查，复查时每份标本应作对照管。
2,4-二硝基苯肼溶液0.5 ml，混匀，37℃ 20min； 各管加 2,4-二硝基苯肼溶液0.5 ml，混匀，37℃水浴 20min； NaOH溶液 溶液5.0 ml，混匀，室温放置10min 10min。 各管加 0.4 mol/L NaOH溶液5.0 ml，混匀，室温放置10min。
波长505 nm处比色 处比色， 蒸馏水调零点 读取各管吸光度； 调零点， 波长505 nm处比色，以蒸馏水调零点，读取各管吸光度； 各管读数均减去0号管吸光度 吸光度， 各管读数均减去0号管吸光度，所得差值与对应的卡门氏酶活性 单位作图即成标准曲线。 单位作图即成标准曲线。