淋巴细胞表面抗原检测-20141113硕士班
淋巴细胞表面抗原检测20141113硕士班
T淋巴细胞
T淋巴细胞是机体免疫系统中的主要调节及效应细胞，在正常机体内 各淋巴细胞亚群相互作用，可通过对抗原识别、处理、递呈引起多种 细胞因子同多种细胞之间的网络联系，构成维持免疫功能的生理平衡 ，维持着机体正常免疫功能。当不同淋巴细胞亚群的数量和功能发生 异常时，可导致机体免疫功能紊乱并发生一系列病理变化。因此，Ｔ 淋巴细胞亚群的免疫分型能够提供有关患者免疫状态的重要信息。
1）根据细胞比重差异：自然沉降法、密度梯度离心法、改变细 胞密度法
2）根据细胞黏附特性：B细胞黏附于尼龙棉 3）根据细胞对渗透压变化的敏感度：红细胞对低渗敏感
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淋巴细胞
淋巴细胞是指在适应性免疫中起关键作用的白细胞，由淋巴器官产生， 机体免疫应答功能的重要细胞成分。主要指B淋巴细胞和T淋巴细胞，二 者表面抗原受体具有高度多样性，经抗原激发可分化为抗原特异性效应 细胞，分别介导体液免疫和细胞免疫。
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流式细胞术 – 在流动的状态中检测细胞或颗粒的各项特性 – 特异性强，灵敏度高，速度快，并能实现多参数分析 – 可检测的样本种类多样：外周血，骨髓，细胞穿刺液，洗脱液， 实体组织，培养细胞，微生物
2019/6/23
流式细胞术检测样本
0.4um
40um
流式细胞术检测指标
流式细胞术提供的信息： - 相对细胞大小 - 相对细胞颗粒密度和内部复杂度 - 染色过细胞的相对荧光强度
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NK细胞表面标志
人类NK细胞表面标志主要以CD16、CD56来认定，临床将 CD3-CD56+CD16+淋巴细胞认定为NK细胞。
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FACS
流式细胞仪由激光光源系统，气控单细胞层流系统，光检测及信 息处理系统和细胞分离纯化系统组成。
人B淋巴细胞表面抗原酶联免疫分析
人B淋巴细胞表面抗原酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。
检测范围： 96T5 pg/ml - 125pg/ml使用目的：本试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本中B淋巴细胞表面抗原含量。
实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人B淋巴细胞表面抗原水平。
用纯化的人B淋巴细胞表面抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入B淋巴细胞表面抗原，再与HRP标记的B淋巴细胞表面抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的B淋巴细胞表面抗原呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人B淋巴细胞表面抗原浓度。
标本要求1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。
若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。
2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。
在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。
加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
7.温育：操作同3。
8.洗涤：操作同5。
9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
淋巴细胞检测
淋巴细胞检测体检表格：淋巴细胞检测检测项目：1. 淋巴细胞计数：检测淋巴细胞在血液中的数量。
2. 淋巴细胞亚群分析：检测淋巴细胞的不同亚群比例。
3. 淋巴细胞功能测定：评估淋巴细胞的功能状态。
检测目的：通过淋巴细胞检测，评估患者的免疫功能、炎症反应和潜在疾病风险，帮助诊断、干预和监测疾病的进展。
患者信息：1. 姓名：_________________2. 性别：_________________3. 年龄：_________________4. 就诊日期：_________________5. 临床诊断：_________________（填写具体病症或疾病）检测结果：1. 淋巴细胞计数（单位：10^9/L）：_________________（正常参考范围：1.0-3.5）注释：根据淋巴细胞的数量，评估免疫功能状态。
数量偏低可能表示免疫功能低下，数量偏高可能表示潜在感染或免疫系统异常。
2. 淋巴细胞亚群分析（单位：%）：- CD3+淋巴细胞：_________________（正常参考范围：55-85）- CD4+淋巴细胞：_________________（正常参考范围：30-60）- CD8+淋巴细胞：_________________（正常参考范围：20-40）- CD4+/CD8+比值：_________________（正常参考范围：0.6-2.5）注释：根据淋巴细胞的亚群比例，评估免疫功能的特定方面。
亚群比例异常可能与自身免疫性疾病、感染性疾病或肿瘤相关。
3. 淋巴细胞功能测定：- 淋巴细胞转化试验（单位：SI或cpm）：_________________（正常参考范围：>1000）- 淋巴细胞制造干扰素γ试验（单位：pg/mL）：_________________（正常参考范围：>100）注释：通过淋巴细胞的功能测定，评估免疫反应和细胞介导的免疫应答。
功能异常可能与感染、癌症或免疫系统疾病有关。
细胞表面抗原检测FACS
流式细胞仪
流式细胞仪
全自动双激光四色流式细胞分析分选系统
个人型双激光四色流式细胞仪
流式细胞仪的特点
单个细胞分析 同时多参数分析 速度快：10000个细胞/秒 统计学意义：提供细胞群体的均值和分布情况 分选感兴趣的细胞
流式细胞仪系统流程： 标本→激光系统→流动系统→信号处理系统→放大系统→计算机系统→结果打印
淋巴细胞表面标志的检测
—— FACS法
免疫胞检测
淋巴细胞的采集和分离 总数检测 T亚群检测
淋巴细胞表面抗原检测—免疫荧光法
原理
荧光素标记的特异性抗体与淋巴细胞表面相应抗 原结合，使淋巴细胞带有荧光素，在一定波长的 激发光作用下产生荧光，可用流式细胞仪或荧光 显微镜进行检测。
流式细胞仪的基本原理：将细胞形成高速细流而 从喷嘴逐个流出，经激发光照射后产生的荧光信 号等由感光元件探测，通过计算机自动处理各种 数据，可以测得每个细胞的荧光强度、细胞大小 等物理特征。
是真正意思上的阴性对照，它可以用来设定流式细胞仪的 电压。
一般选择与一抗的成分完全相同种属来源、相同亚型和亚 链、相同荧光标记的抗体。
混匀，室温避光孵育20分钟。 加溶血素1ml，混匀，室温避光裂解红细胞10分钟。 离心1500rpm，5分钟，弃上清； 加PBS缓冲液1ml， 1500rpm，5分钟，弃上清。 加PBS缓冲液400ul悬起细胞，移入FACS专用管。 流式细胞仪检测。
注意事项：
对照设置： 其好坏、齐全，决定对结果的解释和结论的可信性。
阴性对照、同型对照（Isotype control）、单染色对照
单细胞悬液：（不允许上机样品含有胎牛血清）
优化实验条件：（细胞数+抗体量）
同型对照(Isotype Control)
淋巴细胞表面标志和功能检测(“细胞”相关文档)共72张
SmIg的检测
常用方法： 间接荧光免疫法（IIF） 酶免疫组化法
选择高效价、高特异性和高亲和力的 酶或荧光标记的多价抗人Ig抗体（IgG、A、 M、E等），检测各种类型B细胞，人外周 血中SmIgM-B细胞最多。
IIF结果观察
B细胞经荧光标记的抗体染色，细胞膜 表面呈现的荧光着色形式可有多种：
①呈环状均匀分布； ②集中在某些部位呈斑点状；
淋巴细胞与其它细胞、分子之间的相互作用以及淋 巴细胞发挥生物学作用（识别抗原、活化、辅助、抑制、 杀伤等）均与其表面标志有关。
淋巴细胞表面标志可用于： 1. 淋巴细胞及其亚群的鉴别 2. 研究淋巴细胞分化过程和功能
3. 临床上研究某些疾病的发病机 制和诊断方法。
T 淋巴细胞表面标志
1. 簇分化抗原(cluster of differentiation, CD)
T细胞 B细胞 NK细胞
－
＋
－
＋
－
－
极少数 ＋
－
＋
－
＋
＋
－
－
－
＋
－
－
－
＋
－
＋
部分
－
＋
＋
第三节 淋巴细胞功能检测技术
体内实验：进行迟发型超敏反应，借此间
接了解淋巴细胞对抗原、半抗原或有丝分 裂原的应答反应。
体外实验：主要包括淋巴细胞对抗原或有
丝分裂原刺激后的增殖反应、细胞毒性试 验及淋巴细胞分泌产物的测定。
（3）CD4/CD8：
Tc/Ts细胞、部分NK细胞
活化Ｔ细胞 CD25（IL-2R） 原淋巴细胞、过渡型母细胞计为转化的淋巴细胞，共计数200个细胞，计算：
细胞因子受体
CD28
淋巴细胞亚群各项指标解读
淋巴细胞亚群各项指标解读淋巴细胞，也称为白细胞，是人体内一种非常重要的细胞。
它们可以提供免疫防御，识别病原体，消灭病毒和来源的易感性，并帮助保持人体较佳的健康状态。
因此，对淋巴细胞的检测成为了医学界对人体健康状况研究的重要一环。
淋巴细胞亚群各项指标是检测淋巴细胞形态学和功能的重要指标，它可以反映出人体免疫力的水平。
淋巴细胞亚群是指在人体血液循环中的淋巴细胞的不同种类。
它们的名字来源于它们具有的形态特征，包括淋巴细胞B，淋巴细胞T，单核细胞，嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞等。
它们的特征可以通过血液分析手段来进行检测，这些特征也是淋巴细胞亚群检测的主要内容。
淋巴细胞亚群中各种细胞数量的检测可以反映人体免疫力以及疾病的状况，其中最主要的有淋巴细胞B、淋巴细胞T和单核细胞三种指标。
淋巴细胞B，是一种由前体淋巴细胞分化出的细胞，它们在人体的免疫反应中起着核心作用，其数量正常值为5％－20％；淋巴细胞T，是由淋巴细胞分化出的一种细胞，它们可以分解病原体及其具有毒性的物质，正常值为20％－50％；单核细胞，是一种具有对抗病原体能力的淋巴细胞，正常值为2％－8％。
这三种指标以外，还有嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞两种指标。
嗜中性粒细胞是一种具有溶酶体的细胞，它们主要将病原体的外壳破坏，其数量正常值为48％-86％；嗜酸性粒细胞是对病原体的一种抗性，其数量正常值为1％-7％。
此外，淋巴细胞亚群的检测还可以检测出淋巴细胞的功能活性，它们包括趋化因子，趋化受体，转录因子，抗原受体，免疫球蛋白，慢性炎症因子和抗病毒因子等。
这些指标可以反映出人体对病原体的免疫活性，及时发现疾病，提高治疗效果。
淋巴细胞亚群各项指标是检测淋巴细胞形态学和功能的重要指标，它们可以反映出人体免疫力水平和抗菌病毒能力，为提高治疗效果提供参考。
因此，建议在诊断时应定期检测淋巴细胞亚群各项指标，及时发现疾病症状，提高治疗效果。
为了提高检测准确度，针对淋巴细胞亚群各项指标检测要实施一定的控制措施，并掌握正确的操作实践。
淋巴细胞免疫表型检测及其统计学分析
淋巴细胞免疫表型检测及其统计学分析崔巍;朱陵群;赵明镜;王硕仁【期刊名称】《中国免疫学杂志》【年(卷),期】2001(017)010【摘要】目的:以标准化质控及正确的统计学分析方法确定淋巴细胞免疫表型参考值.方法:用SimultestTM IMK-Lymphocyte Kit荧光抗体对93例健康中国成人血液进行双标染色,以FACS Calibur流式细胞仪进行分析,SimulSET获取数据并分析结果.符合质控标准的数据汇总后进行统计学分析.结果:CD+3、CD+3CD+4、CD+3CD+8细胞呈正态分布,CD-3CD+19、CD-3CD+16和/或CD+56细胞及CD+3CD+4/CD+3CD+8比值呈偏态分布.CD+3、CD+3CD+4、CD+3CD+8细胞以正态分布法确定95%可信区间参考值,分别为:49.28%～80.52%、25.29%～48.11%、11.93%～44.77%;CD-3CD+19、CD-3CD+16和/或CD+56细胞及CD+3CD+4/CD+3CD+8比值以百分位数法确定95%可信区间参考值,分别为:4.74%～19.84%、10.63%～42.86%、0.65～3.05.结论:建立正常参考值应综合考虑使用正态分布法与百分位数法.建议以标准化质控及正确的统计学分析方法确定参考值,使得同种族、不同地区的实验室应用相同试剂、相同仪器所获取的参考值具有良好的一致性.【总页数】3页(P538-540)【作者】崔巍;朱陵群;赵明镜;王硕仁【作者单位】北京中医药大学东直门医院中医临床重点学科实验室，北京100700;北京中医药大学东直门医院中医临床重点学科实【正文语种】中文【中图分类】R392-33【相关文献】1.恶性肿瘤患者外周血淋巴细胞免疫表型检测的临床意义 [J], 章梁君;钟锦莎;钟辉秀;刘伟平;殷明刚;杨新春2.不明复发性流产封闭抗体及淋巴细胞免疫表型检测对淋巴细胞主动免疫治疗效果的评估价值 [J], 伍萍芝;蒙瞻瞻;严提珍3.流式细胞仪检测缺铁性贫血患者淋巴细胞免疫表型的探讨 [J], 杨红;孟岩;王超4.外周血淋巴细胞免疫表型检验评价恶性肿瘤患者细胞免疫功能的价值分析 [J], 孙翔;拓红晓5.头颈部原发性淋巴结外非霍奇金氏淋巴瘤临床和细胞免疫学表型分析 [J], 徐志文;蒋一强;谭颂华因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
皮肤淋巴检验报告
皮肤淋巴检验报告引言皮肤淋巴检验是一种常见的检查方法，用于评估皮肤淋巴系统的功能和状况。
它通过观察皮肤上的淋巴结、淋巴管和淋巴细胞，可以提供关于淋巴系统是否正常工作的重要信息。
本报告旨在介绍皮肤淋巴检验的基本原理、检测方法以及结果的解读。
方法皮肤淋巴检验通常使用光学显微镜进行观察和分析。
以下是具体的检验步骤：1.准备样本：首先需要准备一个皮肤淋巴的标本。
这可以通过切除皮肤组织或者采集淋巴液样本来获得。
2.固定和染色：标本被固定在玻璃片上，并且被染色。
染色的目的是为了增强细胞和组织的对比度，便于观察。
3.显微镜观察：将标本放入显微镜下，使用不同倍数的镜头进行观察。
通过观察细胞数量、形态和排列方式等特征，评估淋巴系统的状态。
4.数据分析：根据观察到的细胞和组织情况，进行数据分析。
比较不同细胞类型的比例和数量，判断淋巴系统是否正常。
结果解读根据皮肤淋巴检验的结果，可以得出以下几个方面的评估：1.淋巴结状态：淋巴结是淋巴系统的重要组成部分，它们承担着过滤淋巴液中的有害物质和保护机体的功能。
通过观察淋巴结的大小、形态和细胞排列方式等特征，可以评估淋巴结的功能是否正常。
2.淋巴细胞分布：淋巴细胞是淋巴系统中的主要细胞类型，它们具有免疫功能。
通过观察淋巴细胞在皮肤中的分布情况，可以评估免疫功能是否正常。
正常情况下，淋巴细胞应该均匀分布在皮肤中。
3.淋巴细胞数量和比例：不同类型的淋巴细胞在皮肤中的数量和比例也是评估淋巴系统功能的重要指标。
比如，淋巴细胞的数量过多可能意味着免疫系统处于亢奋状态，而淋巴细胞比例的改变则可能暗示某些疾病的存在。
结论皮肤淋巴检验是一种无创、简单而有效的检查方法，可以提供关于淋巴系统功能和状况的重要信息。
通过观察淋巴结、淋巴细胞的形态和排列方式，以及分析淋巴细胞的数量和比例，可以评估免疫系统是否正常工作。
然而，需要注意的是，本检验只是一种辅助手段，结果应结合其他检查结果和临床症状来综合评估。
小鼠脾单个核细胞的分离-20141113硕士班
器 材
（1）水平式离心机
（2）显微镜
（3）血球计数板、血盖片
（4）一次性试管、滴管 （5）擦镜纸、卷筒纸、镊子
试 剂：
（1）小鼠脾脏细胞悬液
（2）淋巴细胞分离液（市售，比重：1.088±0.001）
（3）生理盐水
（4）白细胞稀释液 （5）0.4%锥兰生理盐水溶液
操作步骤
将1ml小鼠脾细胞悬液混匀，用滴管沿盛有2ml淋巴细胞分离液的 试管壁轻轻铺于分离液面上 ↓ 将该试管置水平式离心机中离心（2000rpm）15 min ↓ 用滴管小心地直接插入白色絮状的细胞层（含单个核细胞）， 吸出界面层细胞，移入另一离心管内 ↓ 加入足量生理盐水，用滴管轻轻上下冲洗混匀 ↓ 离心（1000rpm）10 min ↓ 弃去上清液，将沉淀细胞充分摇匀，加生理盐水，洗涤 1 次 ↓ 离心（1000rpm）10 min ↓ 弃去上清液，将沉淀细胞充分摇匀 ↓ 用生理盐水将沉淀细胞稀释至0.3ml(约6滴），摇匀 ↓ 取细胞悬液一滴加入等量白细胞稀释液于另一试管中充分混匀，用计数板在显微镜下计数， 计算出白细胞总数（/ml）
×10×2×103 个/ml
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1. 细胞数量明显增大时可适当加大稀释倍数。 2. 充池时要一次完成，不能产生满溢、气泡或充池不足的现象。
3. 大小方格内压线细胞的计数遵循数上不数下、数左不数右的原则，
避免多数或漏数。
1.
红细胞计数时，如果每个中方格之间相差超过20个以上，要重新充池
计数。正常数值范围内，两次红细胞计数相差不得超过5%
3. 加入脾细胞悬液时应十分小心，注意保护分离液的界面，勿使混淆
影响分离效果；
4. 每个吸取细胞悬液的步骤，均要混匀细胞； 5. 做细胞活力检查时，锥兰染色后应尽快计数完毕，时间过长则细胞
B淋巴细胞表面膜免疫球蛋白测定
B淋巴细胞表面膜免疫球蛋白测定【基本信息】[简要描述]·B淋巴细胞表面膜免疫球蛋白(surface membrane immunoglobulin, SmIg)是B淋巴细胞的特征性表面标志，其类别随B淋巴细胞发育阶段不同而变化。
·SmIg测定主要用于检测外周血B淋巴细胞的百分率，有助于免疫缺陷病、淋巴细胞增生性疾病的病因诊断及疗效观察，还可判断B淋巴细胞的发育程度。
[其他名称]B细胞抗原受体、BCR、SmIg【测定方法及参考值范围】免疫荧光法(以携带该标志的细胞百分数表示)：参考值范围见下表分类参考值范围SmIg☆+☆细胞总数均值21%(16%-28%)SmIgG☆+☆细胞均值7.1%(4%-13%)SmIgM☆+☆细胞均值8.9%(7%-13%)SmIgA☆+☆细胞均值2.2%(1%-4%)SmIgD☆+☆细胞均值6.2%(5%-8%)SmIgE☆+☆细胞均值0.9%(0-1.5%)【结果及临床意义】[增高]◇疾病因素·慢性淋巴细胞性白血病·多毛细胞白血病·巨球蛋白血症注释：以SmIgM+细胞增高明显。
[减低]◇疾病因素·性联丙球蛋白血症·严重联合免疫缺陷病·恶性肿瘤【样本准备与采集】[样本类型]血液[容器]绿帽真空管、浅绿帽真空管[准备与采集]肝素抗凝静脉血2ml，或绿帽或浅绿帽真空管静脉采血。
【注意事项】·B淋巴细胞简称B细胞，由骨髓中淋巴样前体细胞分化而来，是体内唯一能产生抗体的细胞。
B淋巴细胞表面有表面抗原与表面受体两大类。
表面抗原包括CD19、CD20、CD21、CD22和CD40等；表面受体包括B细胞抗原受体(BCR)、细胞因子受体(CKR)、补体受体(CR)与Fc受体等。
·将荧光标记的抗不同类型Ig的单克隆抗体进行检测，可将B淋巴细胞分为SmIgG、SmIgM、SmIgA、SmIgD、SmIgE五种类型，若B淋巴细胞膜表面仅表达IgM则为未成熟的B细胞，而同时表达IgM和IgD则为成熟B淋巴细胞。
细胞表面抗原的定量测定方法
细胞表面抗原的定量测定方法
周春喜
【期刊名称】《标记免疫分析与临床》
【年(卷),期】2002(009)004
【摘要】介绍了用流式细胞仪定量测定细胞表面抗原的方法, 测定了淋巴细胞表面CD4分子的数量. 该法操作简单, 结果可靠.
【总页数】2页(P217-218)
【作者】周春喜
【作者单位】解放军总医院医学实验测试中心,北京,100853
【正文语种】中文
【中图分类】R318.6
【相关文献】
1.几种体细胞定量测定方法的应用（测定方法综述） [J], 刘左仪
2.高中化学定量实验能力培养的教学策略——以"学习几种定量测定方法"为例 [J], 唐红珍
3.定量皮带秤自动定量误差测定方法研究 [J], 胡强
4.婴幼儿配方奶粉中1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯的定量测定方法 [J], 何香婷;
刘玲君;陈亮;翟红梅;白素琴
5.解淀粉芽孢杆菌实时荧光定量PCR测定方法的建立及其在豆粕发酵中的应用 [J], 杨湘黔;崔京春;曾诗娴;成丽;张珂彬;胡晓红;鲍雅静
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血细胞凝集法测定细胞表面抗原
血细胞凝集法测定细胞表面抗原
Kokki.,D;缪西
【期刊名称】《国外医学：临床生物化学与检验学分册》
【年(卷),期】1991(012)002
【摘要】单克隆抗体技术问世以来,应用免疫学技术测定细胞表面蛋白的方法就显得更加重要了。
本文介绍一种新型、简易、准确,并能快速地对细胞表面标记物进
行半定量的间接血细胞凝集法。
并可进行淋巴细胞亚群签别和筛选杂交瘤的细胞株。
方法:一、制备被检测的细胞。
T 淋巴细胞系Molt 3和Jurkat 在含2mML-谷氨酰胺,10%小牛血清(FCS)50/μg/ml 庆大霉素的RPMI 1640培养基中在37℃,湿压为95%,含5% CO_2的情况下悬浮培养。
【总页数】2页(P73-74)
【作者】Kokki.,D;缪西
【作者单位】不详;不详
【正文语种】中文
【中图分类】R446.62
【相关文献】
1.淋巴结结核患者外周血细胞表面抗原的测定及其亚群研究 [J], 朱慧芬;洪淑云
2.红细胞冷凝集对全自动血细胞分析仪检测血细胞参数的影响 [J], 张茹;王志娟;杨靖娴
3.小鼠造血细胞表面抗原的表达 [J], Holm.,kL;张重辉
4.红细胞冷凝集对全自动血细胞分析仪检测血细胞参数的影响 [J], 张龙桃
5.血细胞表面抗原与遗传 [J], 白润江
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荧光素标记检测乙型肝炎病毒表面抗原特异性杀伤性T淋巴细胞方法的探讨
荧光素标记检测乙型肝炎病毒表面抗原特异性杀伤性T淋巴细胞方法的探讨吴婷;陈敏;欧山海;何水珍;程通;张军;夏宁邵【期刊名称】《病毒学报》【年(卷),期】2005(21)2【摘要】用绿色荧光前体化合物CalceinAM标记靶细胞,经过与杀伤性T淋巴细胞(CTL)效应细胞数小时的孵育,通过分析培养上清中的荧光强度检测CTL效应。
通过对一系列标记条件的研究:不同浓度CalceinAM标记靶细胞、不同洗涤缓冲液、不同标记细胞浓度、不同洗涤次数、不同裂解液配方,确定CalceinAM荧光素标记法的最佳条件。
用该方法检测乙型肝炎病毒表面抗原的DNA疫苗免疫Balb/c小鼠对P815S细胞的CTL效应,E/T比为10时,杀伤效率接近饱和,达到65%。
通过荧光显微镜直接观察杀伤后的P815S细胞,细胞破裂程度与计算出的杀伤效率有一定相关性。
【总页数】5页(P113-117)【关键词】CTL;乙型肝炎病毒表面抗原;T淋巴细胞;特异性杀伤;靶细胞;荧光素标记;培养上清;浓度;孵育;洗涤次数【作者】吴婷;陈敏;欧山海;何水珍;程通;张军;夏宁邵【作者单位】厦门大学福建省医学分子病毒学研究中心【正文语种】中文【中图分类】Q783.1;R735.7【相关文献】1.儿童急性淋巴细胞白血病特异性标记物的精准检测方法研究 [J], 刘丽晓;岳冬梅;杨贵生;赵辉;周晋;刘淑贤;贾昆;王宁2.对宫内乙型肝炎病毒感染婴儿特异性杀伤性T淋巴细胞功能的探讨 [J], 吕晴;朱启;熊恩东3.流式细胞术检测单核巨噬细胞吞噬荧光素标记结核分枝杆菌的方法学探讨 [J], 金齐力;姜丽娜;姚春艳;闵宏林;李柏青4.三种方法检测乙型肝炎病毒表面抗原比较探讨 [J], 刘学文5.低水平乙型肝炎病毒表面抗原检测的三种方法学探讨 [J], 谢小红;路瑞静;江凡;周喜友;周坤朋;王丰因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
正常人及肺癌患者淋巴结细胞六种标志抗原测定
正常人及肺癌患者淋巴结细胞六种标志抗原测定谈立松;王雄彪;高奇蓉;吴直江【期刊名称】《第二军医大学学报》【年(卷),期】1995(16)6【摘要】正常人及肺癌患者淋巴结细胞六种标志抗原测定谈立松，王雄彪，高奇蓉，吴直江关键词肺肿瘤；淋巴细胞；抗原测定；患者中国图书资料分类法分类号Ｒ７３４．２０３参与细胞免疫的淋巴细胞是由不同抗原标志、行使不同免疫功能的多种亚群组成。
本研究中，除应用ＣＤ３、ＣＤ...【总页数】3页(P586-588)【关键词】肺肿瘤;淋巴结细胞;标志抗原【作者】谈立松;王雄彪;高奇蓉;吴直江【作者单位】第二军医大学长海医院呼吸内科,上海市第一肺科医院,中国科学院细胞生物学研究所【正文语种】中文【中图分类】R734.2【相关文献】1.肿瘤标志物神经特异性烯醇化酶与糖链抗原125及血清细胞角蛋白19片段和癌胚抗原在肺癌诊断与分期中的价值 [J], 徐一凯;陈素珍;胡丹丹;王世强;章潜;楼黎明2.淋巴结结核患者外周血细胞表面抗原的测定及其亚群研究 [J], 朱慧芬;洪淑云3.肺癌患者血清细胞角蛋白19片段癌胚抗原及可溶性白细胞介素-2受体联合测定的临床意义 [J], 王跃华;吴波;姜宝艳;麦羡霞;马克蓉;陈景梅;王仙玲4.血清标志物（NSE、CEA、CA-125、CYFRA21-1）和分子标志物（MDR-1、LRP、RRM-1、EGFR、ERCC-1、BRCA-1）在非小细胞肺癌患者原发灶和转移淋巴结的表达 [J], 郭楠楠;李珊珊;张文;于长海;俞建琦;李少军5.联合检测肿瘤标志物癌胚抗原(CEA),糖类抗原125(CA125),神经元特异性烯醇化酶(NSE)和细胞角蛋白片段(CYFRA21-1)在肺癌诊断中的临床价值 [J], 刘晶晶因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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Th1/Th2 亚群及其相互之间的平衡在免疫应答的调节中起着关键的作用， Th1/Th2 平衡的失调与多种疾病的发生发展和预后有着密切的关系。目前 已发现许多感染性疾病、自身免疫性疾病、过敏性疾病以及移植排斥反应 等都与Th1/Th2 平衡有关。 建立稳定有效的细胞内因子检测方法对于准确说明Th1/Th2细胞的作用非 常重要。 目前检测的主要方法： 酶联免疫法、ELISPOT法、荧光定量法及原位杂交等方法。
光学系统
激发光学系统包括: - 激光器 - 透镜和反射镜，将激光引导到检测区域 收集光学系统包括: - 滤光片，将产生的光信号引导到对应的光学接收器
液流系统
悬浮状态的细胞 单个流过流动室 细胞被激发 产生散射光和荧光 信号
光学系统
信号被采集 转换成数字信号 存储于电脑上
电子系统
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早期将T细胞中的CD4+T细胞分为Thl和Th2两个亚群。 Thl细胞通过分泌IL-2、、IL-12、IFN-γ和TNF- α等细胞因子，介导与细 胞毒和局部炎症有关的免疫应答，参与细胞免疫及迟发型超敏反应。在抗感 染、抗肿瘤反应中发挥重要作用。 Th2细胞则通过分泌IL-4、IL-5、 IL-6、IL-10和IL13等细胞因子，其主要 功能为刺激B细胞增殖并产生抗体，促进机体的体液免疫应答。
2015-6-17
T 细胞亚群检测 采用三色标记单克隆荧光抗体标记单个核细胞悬液，用流式细胞 仪进 行检测分析，可对 T 细胞及亚群作出精确分类。
2015-6-17
T淋巴细胞检测
免疫细胞活性检测，如T淋巴细胞转化实验，根据淋巴细胞转化程度 测定免疫应答功能，但功能检测仍需结合细胞定量检测，结果更可
淋巴细胞表面抗原检测 --免疫荧光法
2014-11-13
硕士班
基本概念
所有参与免疫应答以及与免疫应答相关的细胞均被称为免疫细胞。 包括淋巴细胞、单核-巨噬细胞、DC、各种粒细胞、红细胞、肥 大细胞、干细胞。
2
免疫细胞分离方法：
1. 根据不同免疫细胞表面标志:FACS、MACS 2. 根据细胞理化性质： 1）根据细胞比重差异：自然沉降法、密度梯度离心法、改变细 胞密度法 2）根据细胞黏附特性：B细胞黏附于尼龙棉 3）根据细胞对渗透压变化的敏感度：红细胞对低渗敏感
2015-6-17
调节 T 细胞 (Treg 细胞 ) 也是近年来认识的一种重要的免疫调节细胞， CD4+ T细胞在 TGF-β单独的诱导下则而分化成 Treg细胞，分泌TGF-β并 表达Foxp3，参与免疫的调节。 Thl7 是一种能产生 IL-17 却不产生 IFN-γ 和 IL-4 的 CD4+T 细胞，目前的 研究证实了 TGF-β和 IL-6 在Thl7 细胞分化启动过程中的重要作用。同时 ，转录因子 STAT3 和 RORγt，在 Thl7 的分化过程中也起着重要的调节作 用。
CD4细胞，作为淋巴细胞的一种，是人体中调控免疫系统最重要的枢纽细 胞，其数量能够最直接的反应人体免疫功能的状态。CD4细胞检测广泛应 用于对人体免疫功能状况的评估，有助于肿瘤、糖尿病、冠心病、艾滋病 等疾病的早期发现及临床诊疗
2015-6-17
人体内的淋巴细胞在光学显微镜下的形态基本是一样的，但其功能各异 ，对 T 细胞、B 细胞和酝细胞及其有关的亚群的相应表面标志检测，藉 以判断机体的免疫水平。 一、T 淋巴细胞表面标志的检测 T 细胞表面标志 抗体致敏细胞花环法 免疫细胞化学法 免疫荧光法
T 细胞亚群检测
2015-6-17
T 细胞表面标志 T 细胞是参与机体细胞免疫反应和在免疫应答反应中起主导调节作用 的一组免疫细胞。所有的 T 细胞均有共同的标志性抗原，不同功能的 T细胞亚群又具有各自的标志性抗原。最常用单克隆抗睐鉴定和检测 计数 T 细胞及亚群的表面标志 抗体致敏细胞花环法 用相应的抗 CD3 单克隆抗体吸附于醛化的红细胞(致敏)，当其与受 检 的细胞混匀后，结合有兰细胞的单抗与待测细胞上的 CD3 抗原结 合形成桥 联，由于加入的红细胞多于受检细胞，阳性的受程细胞能 与致敏的红细胞 结合而形成玫瑰花样的花环，凡受检细胞周围黏附 3
3
淋巴细胞
淋巴细胞是指在适应性免疫中起关键作用的白细胞，由淋巴器官产生， 机体免疫应答功能的重要细胞成分。主要指B淋巴细胞和T淋巴细胞，二 者表面抗原受体具有高度多样性，经抗原激发可分化为抗原特异性效应 细胞，分别介导体液免疫和细胞免疫。 淋巴器官根据其发生和功能的差异可分为：
中枢淋巴器官（又名初级淋巴器官）：包括胸腺、腔上囊或其相当器官
2015-6-17
• 颜色补偿 coIor compensation
由于一种荧光素发射的荧光叠加到其他荧光素发射的波长范围内而造 成荧光信号重叠，通过在其他荧光信号中扣除已测定荧光信号的一部
分而纠正颜色重叠造成的计数错误。扣除的荧光量是用恰当的单染对
照来确定的。被校正的信号反映了单荧光信号的发射情况。
个和 3 个以上红细胞 牵为花环形成细胞，计算花环形成细胞与计数
淋巴细胞之比。
2015-6-17
免疫细胞化学法 通常以酶作为抗体标记物，采用细胞酶免疫组化技术完成，并常采用生 物素一链霉亲合素放大系统提高灵敏度。该类方法可用普通显微镜观察 ， 凡着色的细胞即为相应 CD 抗原阳性的细胞，计算阳性细胞占总计数 细胞的 百分率进行定量分析。
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NK细胞表面标志
人类NK细胞表面标志主要以CD16、CD56来认定，临床将
CD3-CD56+CD16+淋巴细胞认定为NK细胞。
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FACS
流式细胞仪由激光光源系统，气控单细胞层流系统，光检测及信 息处理系统和细胞分离纯化系统组成。 流式细胞术(FCM)是一种对处在液流中的单个细胞或其它生物微 粒（如细菌）等进行快速定量分析和分选的技术，它将免疫荧光与细 胞生物学、流体力学、光学和电子计算机等多种学科的高新技术融为 一体，进行细胞和分子水平的基础理论与临床应用研究。 将荧光标记的单克隆抗体加入PBMC悬液内，使二者特异性结合， 通过流式细胞仪自动检测，既可很快得到T、B细胞及其亚群百分率和 绝对值的有关数据，又能以每秒高达5000个细胞(18×106 细胞/h)的 速度分离和收集无菌的淋巴细胞，纯度可达90%～99%，细胞活性亦不 受影响，可用于淋巴细胞的各种免疫生物学功能测定。
• 设门 gate
在流式细胞仪显示的象限图上基于一组参数(如荧光对SSC、
FSC/SSC等)来确定的所要分析的目的细胞群。对限定区内的目的细胞 群通过其他参数(如荧光参数)进一步分析其表达情况。
2015-6-17
数据采集
2015-6-17
T细胞表面标志及其亚群
• CD3+CD4+CD8- 辅助性T细胞（help T cell,Th） • CD3+CD4-CD8+ 细胞毒性T细胞（cytotoxic T cell,Tc or CTL） • CD4+CD25+ 调节性T细胞（regulatory T cell,Tr or Treg）
免疫荧光法
本法是将分离得的外周血单个核细胞与相应的以荧光物质标记的 CD 单 克隆抗体作用(直扫法)，或与抗相应 CD 单克隆抗体作用后，洗去游离 的抗 体，继而加入荧光素标记的抗小鼠 IgG 抗皿清，经温育结合后， 洗去多余 的标记抗体(间接法)，制片后用荧光显微镜观察结果，计算阳 性细胞占总 计数细胞的百分率。如有条件，采用流式细胞仪计数，结果 客观准确。
流式细胞术的应用
细胞结构 细胞大小 细胞粒度 DNA含量与细胞周期 RNA含量 蛋白质含量 染色体分析
细胞功能 细胞表面/胞浆/核的特 异性抗原 细胞活性 细胞内细胞因子 酶活性 激素结合位点 细胞受体 细胞凋亡
在上述信号基础上的细胞分选
流式细胞仪组成
2015-6-17
B细胞表面标志
SmIg、Fc受体、补体受体、EB病毒受体，部分CD分子是B细胞的重要 表面标志，其中以SmIg为B细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指标。
CD19/CD5分子：可将B细胞区分为B1细胞和B2细胞，B1细胞为CD19和
CD5双阳性，而B2细胞仅为CD19阳性，B2细胞为通常所指的B细胞。
2015-6-17
分化抗原 cIuster of differentiation, CD
不同谱系细胞在分化、成熟、活化过程中,出现或消失的细胞表面标志。细 胞表面标志通常用单克隆抗体来识别。每个抗体都有指定的CD编号,能被
特定抗体识别的特定抗原通常具有相同的编号,例如,被“CD1抗体”识别的
抗原称为“CD1抗原”。
• 前向散射光
forward angle light scatter FALS、FSC、FS
光学检测器在入射光的正前方所收集的低角度光信号,与细胞或颗粒
的大小和体积有关。
• 侧向散射光 side scatter, SSC
光学检测器在入射光的直角处所收集的细胞散射的光信号,与细胞或
颗粒的内部和表面结构复杂程度有关,如细胞质颗粒性、膜不规则性
靠。
T淋巴细胞亚群检测
免疫细胞定量检测，如 T 淋巴细胞亚群（ CD3、CD4、CD8等）检测，能精确观察免 疫细胞数值变化，评估免疫状况。通常采 用流式细胞仪法，特别针对CD4细胞检测，
流式细胞仪
此方法已被称作“金标准”。
2015-6-17
T细胞表面标志及其亚群
T细胞有两大亚群：CD4+ CD8+ 根据具体功能有分不同亚群：Td Ti Th Tc Ts 受抗原或细胞因子激活就是活化的T细胞 不同的活化细胞功能不同： Tc活化后成CTL主要杀伤被病毒感染的细胞或癌细胞， Ts活化主要抑制B细胞产生抗体和其他T细胞的分化，起调 节免疫作用， Td活化则适当多种淋巴因子导致炎症，排除抗原， Th也主要协助其他免疫细胞发挥功能，是免疫应答必不可 少的。