05 噬菌体与杂菌污染与防治

气带入少量杂菌，发酵罐有隐患，消沫剂或补料灭菌不彻底 以及有关管路存在杂菌
染菌隐患的检查和处理
此外，如果污染的杂菌是芽孢杆菌，则应先考虑染菌可能来
自培养基或设备灭菌不彻底，净化空气带菌，设备渗漏
如果污染的杂菌是无芽孢的细菌或其它不耐热的杂菌，则应
考虑污染来自净化空气带菌、设备渗漏
如果污染的杂菌与种子罐的污染菌一致，则可以肯定污染来
染菌隐患的检查和处理
• 中期染菌染菌处理
降低发酵温度 适当降低通风量 停止搅拌 少量补糖
提前放罐
染菌隐患的检查和处理
• 发酵后期轻度染菌染菌处理
加强发酵管理，让其发酵完毕，适当提前放罐 向已染菌的发酵液中补充一定量的菌种扩培液，增强生产菌的
生长优势，抑制杂菌繁殖，以争取较好的发酵成绩
泡沫大、粘度大、过滤困难，收率低
氨基酸发酵中噬菌体的污染
• 发酵后期污染噬菌体
发酵后期污染噬菌体常对产酸影响不大，甚至有时竟有提高产
酸的趋势
提取困难， 后期污染前移，造成更严重的危害
氨基酸发酵中噬菌体的污染
• 噬菌体严重污染的早期预报
当空气中的噬菌体浓度上升到每个平板达10~20PFU/mL（噬菌
体复制周期，又称溶菌周期或裂解周期
什么是噬菌体？
氨基酸发酵中噬菌体的污染
• 噬菌体污染的异常现象
氨基酸发酵中污染噬菌体，由于污染时间和感染量的不同，以
及噬菌体“毒力”和菌株敏感性的差异，表现症状是不一样的， 一般会出现“二高三低”
pH高、残糖高 OD低、温度低、产酸低
氨基酸发酵中噬菌体的污染
侵染宿主细胞后使细胞裂解的，称为烈性噬菌体，又叫毒性噬
菌体（virulence phage）
不裂解寄主细胞，并随寄主细胞分裂而传递其DNA的，称温和
噬菌体（temperate phage），又称为溶原性噬菌体（lysogenic phage）
什么是噬菌体？
从噬菌体吸附到细菌裂解释放出子代噬菌体的过程称为噬菌
对以前出现过的噬菌体都具有抗性 不是溶原性菌株 具有与原菌株相当或更高的生产能力 不易发生回复突变
防治噬菌体对发酵的污染
• 利用药物防治噬菌体
阻止噬菌体吸附的药物，多系螯合剂（所污染的噬菌体在吸
附时需要二价阳离子或其它物质作为辅助因子）
抑制噬菌体蛋白质合成或阻断其复制的药物，多系抗生素
材。
保持一定的气流速度
染菌的预防措施
• 培养基和设备的灭菌
合理调配培养基 保证灭菌温度和时间 保证设备无积污和渗漏 保证流动蒸汽质量 尽量减少泡沫 正确进行空气保压
空气净化工艺流程
谢谢
• 发酵后期严重染菌染菌处理
若发酵液中残余糖分已经不多, 则应立即放罐, 以免进一步恶化,
造成更大的损失, 并对空罐进行彻底的清洗、灭菌
倒罐时应将发酵液于120℃灭菌30min方可放弃
染菌的预防措施
• 空气的净化
减少滤前空气的尘粒 减少滤前空气的油水含量 保证压缩空气的温度 妥善装填过滤介质 为了确保除菌效果，过滤介质应选用除菌率99.999%的高效滤
（抗生素成本高，不可能大罐使用，仅限于种子罐使用。在 具体应用时，首先应选出耐药的生产菌，同时确定所污染的 噬菌体在耐药生产菌正常生长的药物浓度内能受到抑制）
也可利用染料、抗坏血酸、杂蒽类等药物进行防治
氨基酸发酵中噬菌体的污染
• 采取以环境净化为中心的综合防治措施
定期检查噬菌体 严禁活菌体任意排放 杀灭环境中噬菌体 杀灭压缩空气中噬菌体 避免噬菌体侵袭菌种 避免噬菌体侵入设备
染菌隐患的检查和处理
• 发酵前期出现严重染菌且发酵液中糖分较高染菌处理
若发酵液中糖分较高，先进行实罐灭菌，于100 ℃维持
15min ，待发酵液温度降至发酵温度时重新接种（或分割主 发酵液）发酵
若发酵液中糖分较低，则补加培养液，进行实罐灭菌，重新
接种（或分割主发酵液) 发酵
若发酵液中糖分很低，无法补救则倒罐
• 什么是噬菌体？ • 氨基酸发酵中噬菌体的污染 • 防治噬菌体对氨基酸发酵的污染 • 氨基酸发酵污染噬菌体后的挽救
什么是噬菌体？
噬菌体（phage）是侵染细菌、放线菌等微生物并使其细胞裂解
死亡的一类病毒
噬菌体个体微小，须用电子显微镜观察 噬菌体无细胞结构，但具有一定的形态结构。其基本形态为蝌
噬菌体与杂菌污染与防治
徐庆阳
中国氨基酸技术服务中心
目 录
• Chapter1 氨基酸发酵中噬菌体 污染与防治 • Chapter2 杂菌的污染与防治 • Chapter3 消毒与灭菌 • Chapter4 发酵设备、管件的渗漏 • Chapter5 发酵培养基灭菌与空气 净化
Chapter1 氨基酸发酵中 噬菌体污染与防治
• 发酵前期污染噬菌体
吸光度开始上升后下降、不升或回降
pH回升；
CO2迅速下降 耗糖慢
OD增长缓慢，发酵周期长，提取困难
泡沫大量产生； 发酵液粘度大，甚至呈现粘胶状，可拔丝； 发酵液发红、发灰； 有刺激气味
氨基酸发酵中噬菌体的污染
• 发酵前期污染噬菌体
产酸量甚少，或增长极为缓慢，或不产酸
镜检时可发现菌体数量显著减少，菌体不规则
细胞核染色，部分细胞核消失，完整菌体很少 平板检查有噬菌斑；摇瓶检查发酵液清稀
氨基酸发酵中噬菌体的污染
• 发酵前期污染噬菌体
二级种子营养要求逐渐加多，种龄延长；发酵周期逐罐延长，
产酸缓慢或下降；
送往提取车间的发酵液，发红、发灰、残糖高、有刺激性臭味，
使用抗性菌株 利用药物和净化环境等 其中采用菌株管理和环境净化为中心的综合防治措施，是根
本的防治方法
防治噬菌体对发酵的污染
• 合理使用抗性菌株
预防噬菌体危害，最简单的办法是使用噬菌体抗性菌种，即
对噬菌体不敏感的菌种，也可以轮换使用对噬菌体敏感性弱 的菌种
选育抗性菌株应注意以下标准
染菌隐患的检查和处理
如果各发酵罐都染菌，其原因可能是公用的种子、净化空气、
补料、消沫剂带菌，或者公共设备存在染菌
如果部分或个别发酵罐、种子罐染菌，可能是料液或设备灭
菌不彻底，净化空气带菌，移种管路或发酵罐密封部件（如 轴封）渗漏或存在死角
染菌如果发生在发酵中后期，原因可能是移种管路或净化空
Chapter2 杂菌的污染与防治
• 染菌隐患的检查和处理 • 染菌的预防措施
染菌隐患的检查和处理
发酵生产染菌的原因很多，以机械搅拌发酵罐生产为例，
如果灭菌蒸汽不带水且压力足够，又不存在菌种染菌或设备 安装问题，归结起来不外乎是 空气质量差
设备出现渗漏 灭菌操作失误
接种操作失误
移种操作失误
染菌隐患的检查和处理
• 前期出现轻度染菌染菌处理
降温培养 降低pH值 补加适量的菌种培养液或加入分割的主发酵液, 确立生产菌
的生长优势, 从而抑制杂菌的生长繁殖, 使发酵转入正常
补加培养液, 并进行实罐灭菌，于100 ℃维持15min , 待发酵
液温度降至发酵温度时重新接种（或分割主发酵液）发酵
斑生成单位，即每ml试样中所含有的具侵染性的噬菌体粒子数） 时，二级种子罐的噬菌体浓度为40~50PFU/mL；之后迅速增加， 达到102PFU/mL的程度，最终在主发酵罐发生溶菌
防治噬菌体对氨基酸发酵的污染
• 战胜噬菌体对发酵的危害，必须采取防治结合、以防 为主、防重于治的方针 • 具体措施主要有
蚪状、微球状和丝状，多数呈蝌蚪形，由头部和尾部两部分组 成
Байду номын сангаас 什么是噬菌体？
噬菌体对理化因素的抵抗力比一般细菌的繁殖体强，如能耐受
乙醚、氯仿、乙醇和低温、冷冻等，但对紫外线、X射线等敏 感，易受热变性（60～70℃，10～15min）
根据噬菌体与宿主细胞的关系，可将其分为烈性噬菌体和温和
噬菌体
自种子带菌
染菌隐患的检查和处理
• 染菌检查
根据分析而初步认定的污染原因，应针对性地加以检查和证 实，以便确定污染的真正原因。如果暂时分析不出污染原因， 则要全面检查污染隐患，找出污染的真正原因 检查净化空气
检查培养基和培养物
检查发酵罐
检查管道的污染隐患 检查无法直接观察的设备部件染菌隐患