实验六 甘草中总黄酮的提取和检测
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实验六
一、实验目的和要求
甘草中总黄酮的提取和检测
1．熟悉甘草中总黄酮的提取方法和工艺； 2．掌握分光光度法测定物质含量的方法。 二、实验原理 甘草黄酮是从特定品种甘草中提取的天然美白剂，它能抑制酪氨酸酶的活 性，又能抑制多巴色素互变和 DHICA 氧化酶的活性，是一种快速、高效、绿色 的美白祛斑化妆品添加剂。 甘草黄酮易溶于有机溶剂， 根据活性成分的特性，本实验主要采用了简单
准确移取 1.0mL 提取液，分别置于两支 10mL 具塞比色管中，一支加 30% 乙醇溶液为空白， 另一支按标准曲线方法操作， 并用 30%乙醇定容， 测定吸光度。 由提取液的吸光度值在标准曲线上查出其中总黄酮的含量， 最后计算出甘草中总 黄酮的含量。 四、注意事项
1．由于甘草总黄酮的含量较低，所以在提取中过滤离心定容的移液过程都需要 用乙醇洗三次，否则会造成含量偏低。
或悬浮物不均匀而造成测量结果不准确。 五、实验结果与讨论（见表 1） 表1 样液编号 1 2 3 4 5 标准曲线的绘制与甘草中总黄酮含量的测定 标准溶液的量/ mL 0 1.0 2.0 3.0 4.0 总黄酮含量 0 0.2 0.4 0.6 0.8 吸光度 A
内
2．分析过程中，标准液及未知液的配制要充分摇匀和放置，防止因反应不充分
内
分光光度法测定原理
蒙
图 1 甘草中总黄酮的提取工艺流程图
古
分光光度法既能进行定性又能进行定量测定， 它是根
科
技 大
学
易行、比较常用的溶剂提取法来进行有效成分的提取。溶剂提取法按其实现方式
量。本实验选用为芦丁标准品（纯度大于95%） 。
图 2 铝离子与黄酮形成的络合物结构 Fig.2 Structures of Al3+-flavone complexes
回流提取装置图
如图 3 所示。
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图 3 索氏提取装置图 Fig.3 Apparatus of Soxhlet extraction
1-铁架台 2-电热套 3-圆底烧瓶 4-冷凝管 5-萃取物料 6-索氏萃取管
三、实验步骤 1.甘草总黄酮的提取 准确称取烘干过 60 目筛子的甘草粉末 3.0g，用精密
滤纸包好， 置于 500mL 索氏提取器中， 加入 400mL 无水乙醇提取至流出液无色， 大约 4h 后取出提取液，自然冷却备用。 2．甘草中总黄酮的测定 (1)标准溶液的配制 将芦丁标准品于 120℃下干燥至恒重，精确称取芦丁标准品 10.00mg 置于
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50mL 容量瓶中， 加入适量 60%乙醇溶液， 在 50℃的水浴中加热溶解， 自然冷却， 用 60%乙醇溶液定容至刻度，即得浓度为 0.20mg/mL 的芦丁标准溶液。 (2)标准曲线的制作 取 10 mL 具塞比色管 6 支，分别准确吸取芦丁标准溶液 0.0mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL 于 10 mL 具塞比色管中。然后各加入 30%乙醇补 充至 5.0 mL，加入 5%的 NaNO2 溶液 0.6mL，摇匀，放置 6min 后加入 10%的 Al （NO3） 摇匀， 再放置 6min， 加入 1mol/LNaOH 溶液 4mL， 用 30% 3 溶液 0.6mL， 乙醇定容，摇匀，放置 15min。在紫外-可见光分光光度计上，先取两个 1cm 比 色皿加空白溶液，在 510nm 波长处调零。取出一个比色皿，加入不同浓度的溶 液，再在 510nm 波长处测定吸光度 A。以黄酮含量为横坐标，吸光度 A 为纵坐 标，绘制标准曲线。 (3)甘草提取液中总黄酮含量的测定
据物质对紫外区域的光或可见光的选择吸收性，进行物质定性、定量分析的一种 方法。显色反应的条件有显色剂用量、介质的酸度、显色时溶液的浓度、显色时 间等；测量吸光度的条件包括应选择的入射光波长、吸光度范围和参比溶液等。 用分光光度法测定甘草提取液和提取物中总黄酮含量是目前国内普遍采用方法。 该方法采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法，以芦丁为标准品，在510nm波长处测定。 其基本原理是：黄酮母核上3和(或)5位上的H或OH取代时能与铝离子形成络合 物；此外B环上有任何相邻的双羟基时，也能产生络合作用(其形成的络合物结构 如图2所示)，从而在吸收光谱上发生明显变化，可作为定量测定的依据：不同结 构的黄酮类化合物，显色情况不同，因此要选用标准品，可用本法测定总黄酮含
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6 提取液 甘草中总黄酮的含量
5.0 —— 总黄酮的重量 100% 银杏叶的干重
1.0 ——
思 考 题
1．所示回流提取法的原理是什么? 2．分光光度法测定的原理是什么? 3．造成实验测得总黄酮含量偏低的原因有哪些?
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Fra Baidu bibliotek
和操作工艺的不同，可分为以下几种：a. 浸渍法；b. 渗漉法；c. 煎煮法；d. 回 流提取法等。由于回流提取法是利用易挥发的有机溶剂进行加热提取，并采用冷 却装置使溶剂连续回流，使植物有效成分能充分提出，且此法简单易行，溶剂用 量少，提取较完全，故本实验中采用了索氏回流提取法。 采取索氏回流提取法从甘草中提取总黄酮的工艺流程如图 1 所示。
一、实验目的和要求
甘草中总黄酮的提取和检测
1．熟悉甘草中总黄酮的提取方法和工艺； 2．掌握分光光度法测定物质含量的方法。 二、实验原理 甘草黄酮是从特定品种甘草中提取的天然美白剂，它能抑制酪氨酸酶的活 性，又能抑制多巴色素互变和 DHICA 氧化酶的活性，是一种快速、高效、绿色 的美白祛斑化妆品添加剂。 甘草黄酮易溶于有机溶剂， 根据活性成分的特性，本实验主要采用了简单
准确移取 1.0mL 提取液，分别置于两支 10mL 具塞比色管中，一支加 30% 乙醇溶液为空白， 另一支按标准曲线方法操作， 并用 30%乙醇定容， 测定吸光度。 由提取液的吸光度值在标准曲线上查出其中总黄酮的含量， 最后计算出甘草中总 黄酮的含量。 四、注意事项
1．由于甘草总黄酮的含量较低，所以在提取中过滤离心定容的移液过程都需要 用乙醇洗三次，否则会造成含量偏低。
或悬浮物不均匀而造成测量结果不准确。 五、实验结果与讨论（见表 1） 表1 样液编号 1 2 3 4 5 标准曲线的绘制与甘草中总黄酮含量的测定 标准溶液的量/ mL 0 1.0 2.0 3.0 4.0 总黄酮含量 0 0.2 0.4 0.6 0.8 吸光度 A
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2．分析过程中，标准液及未知液的配制要充分摇匀和放置，防止因反应不充分
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分光光度法测定原理
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图 1 甘草中总黄酮的提取工艺流程图
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分光光度法既能进行定性又能进行定量测定， 它是根
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易行、比较常用的溶剂提取法来进行有效成分的提取。溶剂提取法按其实现方式
量。本实验选用为芦丁标准品（纯度大于95%） 。
图 2 铝离子与黄酮形成的络合物结构 Fig.2 Structures of Al3+-flavone complexes
回流提取装置图
如图 3 所示。
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图 3 索氏提取装置图 Fig.3 Apparatus of Soxhlet extraction
1-铁架台 2-电热套 3-圆底烧瓶 4-冷凝管 5-萃取物料 6-索氏萃取管
三、实验步骤 1.甘草总黄酮的提取 准确称取烘干过 60 目筛子的甘草粉末 3.0g，用精密
滤纸包好， 置于 500mL 索氏提取器中， 加入 400mL 无水乙醇提取至流出液无色， 大约 4h 后取出提取液，自然冷却备用。 2．甘草中总黄酮的测定 (1)标准溶液的配制 将芦丁标准品于 120℃下干燥至恒重，精确称取芦丁标准品 10.00mg 置于
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50mL 容量瓶中， 加入适量 60%乙醇溶液， 在 50℃的水浴中加热溶解， 自然冷却， 用 60%乙醇溶液定容至刻度，即得浓度为 0.20mg/mL 的芦丁标准溶液。 (2)标准曲线的制作 取 10 mL 具塞比色管 6 支，分别准确吸取芦丁标准溶液 0.0mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL 于 10 mL 具塞比色管中。然后各加入 30%乙醇补 充至 5.0 mL，加入 5%的 NaNO2 溶液 0.6mL，摇匀，放置 6min 后加入 10%的 Al （NO3） 摇匀， 再放置 6min， 加入 1mol/LNaOH 溶液 4mL， 用 30% 3 溶液 0.6mL， 乙醇定容，摇匀，放置 15min。在紫外-可见光分光光度计上，先取两个 1cm 比 色皿加空白溶液，在 510nm 波长处调零。取出一个比色皿，加入不同浓度的溶 液，再在 510nm 波长处测定吸光度 A。以黄酮含量为横坐标，吸光度 A 为纵坐 标，绘制标准曲线。 (3)甘草提取液中总黄酮含量的测定
据物质对紫外区域的光或可见光的选择吸收性，进行物质定性、定量分析的一种 方法。显色反应的条件有显色剂用量、介质的酸度、显色时溶液的浓度、显色时 间等；测量吸光度的条件包括应选择的入射光波长、吸光度范围和参比溶液等。 用分光光度法测定甘草提取液和提取物中总黄酮含量是目前国内普遍采用方法。 该方法采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法，以芦丁为标准品，在510nm波长处测定。 其基本原理是：黄酮母核上3和(或)5位上的H或OH取代时能与铝离子形成络合 物；此外B环上有任何相邻的双羟基时，也能产生络合作用(其形成的络合物结构 如图2所示)，从而在吸收光谱上发生明显变化，可作为定量测定的依据：不同结 构的黄酮类化合物，显色情况不同，因此要选用标准品，可用本法测定总黄酮含
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6 提取液 甘草中总黄酮的含量
5.0 —— 总黄酮的重量 100% 银杏叶的干重
1.0 ——
思 考 题
1．所示回流提取法的原理是什么? 2．分光光度法测定的原理是什么? 3．造成实验测得总黄酮含量偏低的原因有哪些?
内
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科
技 大
学
Fra Baidu bibliotek
和操作工艺的不同，可分为以下几种：a. 浸渍法；b. 渗漉法；c. 煎煮法；d. 回 流提取法等。由于回流提取法是利用易挥发的有机溶剂进行加热提取，并采用冷 却装置使溶剂连续回流，使植物有效成分能充分提出，且此法简单易行，溶剂用 量少，提取较完全，故本实验中采用了索氏回流提取法。 采取索氏回流提取法从甘草中提取总黄酮的工艺流程如图 1 所示。