第五章 固定化酶

H+
+ + + + + H+ H+
OH+ OH-
OH-
+
OH-
5、米氏常数(Km)的变化
表观Km随载体的带电性能变化 电中性载体，Km ；载体与底物电荷性质相
反，Km ；相同，Km
S+ S+ S+ S+ S+
-- - - - -- - - -- ----- - - -
S+
三、固定化酶的评价指标
第三节提要
尽可能地保持自然酶的催化活性
固定化酶的制备原则
载体与酶结合牢固
空间位阻较小
成本尽可能低
一般方法及特点
固定化酶的制备方法
各种固定化方法的比较
及特点
固定化后酶的考察项目
思考题I
1. 什么是固定化酶？与游离酶相比，固定化酶有 哪些优缺点？ 2. 制备固定化酶，需遵循哪些原则？固定化后， 需考察哪些项目？ 3. 简述酶固定化后，其稳定性得以提高的原因。 4. 试述酶进行固定化之后，酶的性质将有何变化？ 5. 简述固定化酶制备的一般方法、基本原理以及 各自的优缺点。 6. 试述共价键结合法制备固定化酶的一般“通 式”，及共价结合法的优缺点。
1、固定化酶的活力
μmol · min-1 ·mg-1
单位面积（cm2）的反应初速度表示，μmol · min-1 · -2 cm
每（毫克）干重固定化酶每分钟转化底物(或生成产物)的量，
（酶膜、酶管、酶板）
须注明：温度、搅拌速度、固定化酶的干燥条件、固定化
的原酶含量或蛋白质含量、原酶的比活力
(4) 包埋法
① 网格型


将酶或含酶菌体包埋在凝胶细微网格中，制成一 定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也称为 凝胶包埋法
(4) 包埋法
② 微囊型

是将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小球内， 制成固定化酶。由于固定化形成的酶小球直径一 般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法
(4) 包埋法
三、固定化细胞的分类
四、细胞固定化方法及特点
一、固定化细胞的概念和目的
概念

细胞的固定化是利用物理、化学等因素将细胞约 束或限制在一定的空间界限内，但细胞仍能保留 其催化活性，并具有能被反复或连续使用的活力
目的

生产酶等各种代谢产物。可代替游离细胞进行酶 的发酵生产。具产酶率高、发酵周期短、可连续 发酵等优点
Enzyme Engineering 酶工程
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第五章 固定化酶

第一节 概述


第二节 固定化酶的特点、性质及其评价指标
第三节 固定化酶的制备原则、固定化方法及 特点 第四节 固定化细胞 第五节 固定化原生质体和辅酶 第六节 酶反应器 第七节 固定化酶（细胞）的应用

第一节 概述
1、为什么进行酶的固定化？
白酶等结合固定在聚苯乙烯树脂重氮化载体上， 在实验室实现了酶的固定化
1969 日本 固定化氨基酰化酶 国际上固定化酶
应用于连续工业化生产的开端
1973 日本 固定化微生物细胞
我国
1970 微生物所、上海生化所开始固定化酶研究
第二节 固定化酶的特点、性质及其 评价指标
一、固定化酶的优缺点 二、固定化酶的性质变化

常用载体
天然高分子衍生物(纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖等)
人工合成高聚物(聚丙烯酰胶、多聚氨基酸、乙烯、尼 龙、聚苯乙烯等) 无机载体(多孔玻璃、陶瓷等)

通常情况下，载体上的功能基团和酶分子上的非必需侧 链基团间不具有直接反应的能力。 活化载体有关基因 载体接一个双功能试剂
② 共价键结合法

共价键结合法制备固定化酶的“通式”
自然酶
DEAE－纤维素 DEAE－葡聚糖
23%
33% 87%
48%
53% 88%
增强对pH的耐受范围
青霉素酰化酶
游离 固定化
37 ℃
16h
pH 7.0-9.0 pH 5.5-10.3
2、酶稳定性的变化
原因
酶分子与载体多点连接，防止酶分子伸展变形 酶活力缓慢释放 抑制酶的自降解 阻挡外界不利因素的侵袭
制备难易 固定化程度 活力回收率
载体再生
费用
可能
低
可能
低
不可能
高
不可能
中等
不可能
低
底物专一性 适用性
不变 酶源多
不变 广泛
可变 较广
可变 较广
不变
小分子底 物、药用 酶
3、固定化后酶的考察项目
（1） 测定固定化酶的活力，以确定固定化过 程的活力回收率
（2） 考察固定化酶稳定性
（3） 考察固定化酶最适反应条件
三、固定化酶的评价指标
4、
或称偶联效率，酶的固定化率。
5、活力回收率＝
活力保留百分数。
固定化酶总活力 100％ 加入酶的总活力
6、相对活力＝
固定化酶总活力 100％ 加入酶的总活力-上清液中未结合酶活力
第二节结束
固定化酶的优缺点
性固 质定 及化 其酶 评的 价特 指点 标、
优点 缺点
固定化酶的性质变化
微生物细胞、植物细胞和动物细胞都可以制成 固定化细胞
细胞特性比较
细胞种类 细胞大小/um 植物细胞 20-300 微生物细胞 1-10 动物细胞 10-100
倍增时间/h
营养要求 光照要求 对剪切力 主要产物
>12
简单 大多数要光照 敏感 色素、药物、香 精、酶等
0.3-6
简单 不要求 大多数不敏感
借助共价键将酶的活性非必需侧链基团和载体的功能基 团进行偶联的固定化方法 目前应用和报道最多的一类方法


参与共价结合的酶的氨基酸残基不应是酶催化活性所必 需的，否则往往会造成固定后的酶的活力完全丧失
可以形成共价键的基团

游离氨基、游离羧基、巯基、咪唑基、酚基、羟基、 甲硫基、吲哚基、二硫键
② 共价键结合法
载体
载体选择原则
a. 要有巨大的比表面积；b. 要有活泼的表面； c. 结合牢固；百度文库d. 便于装柱进行连续反应
酶活性中性不易被破坏，高级结构变化少，酶活损失少 酶与载体相互作用力弱，酶容易脱落
(2) 结合法
① 离子键结合法
② 共价键结合法
① 离子键结合法

通过离子键使酶与载体结合的固定化方法，也称离子交 换吸附法
2、酶稳定性的变化
表现
增加了酶的耐热性
氨基酰化酶
70℃ 15min
游离 DEAE－纤维素 DEAE－葡聚糖
活力丧失 60% 80%
增大了酶对有机试剂、抑制剂等的抵抗能力
脱乙酰酶
浆果赤霉素
DEAE－纤维素
提高51%
2、酶稳定性的变化
减轻了蛋白酶的破坏作用
氨 基 酰 化 酶 胰蛋白酶 (保存酶活力) 蛋白酶Pronase P (保存酶活力)
3、最适温度的变化
最适温度提高
例：壳聚糖固定胰蛋白酶，最适温度为80 ℃；
比固定化前提高30 ℃
4、最适pH的变化
最适pH、酶活力－pH曲线发生偏移
带负电荷载体(阴离子聚合物)，最适pH偏高，
向碱性偏移
+ - - - -- - - --- - - -- ---- -- --- - - -+ + H+ + -
缺点：
反应条件苛刻，操作复杂；可能引起酶蛋白高级结构 变化，破坏部分活性中心，往往得不到比活力高的固 定化酶。
(3) 交联法

借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制 成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。也可 用于含酶菌体或菌体碎片的固定化

常用试剂：戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双 偶氮苯等。应用最广泛的是戊二醛
一、固定化酶的制备原则
1. 尽可能地保持自然酶的催化活性和专一性
2. 载体与酶结合牢固；不能与底物、产物等 发生化学反应；且具有一定的机械强度 3. 空间位阻较小 4. 成本尽可能低
二、固定化酶的制备方法及特点
1、 一般方法及特点
2、 各种固定化方法的比较 3、 固定化后酶的考察项目
1、 一般方法及特点
测定方法：间歇测定；连续测定
三、固定化酶的评价指标
2、蛋白质含量 3、操作半衰期
衡量稳定性的指标
连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半所需
要的时间（t1/2） t1/2 ＝ 0.693 / KD
衰减常数： KD
E 2.303 E ， 是时间t后酶活力残留的百分数 lg( ) E0 t E0
3、最适温度的变化
4、最适pH的变化
5、米氏常数(Km)的变化
1、酶活力的变化
酶活力降低，专一性改变
例：羧甲基纤维素做载体固定的胰蛋白酶，对高分子底 物酪蛋白只显示原酶活力的30%；而对低分子底物苯酞
精氨酸－对硝基酰替苯胺的活力保持80%
原因 作用于低分子底物的酶，特异性没有明显变化
(1) 空间构象变化 既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶，特 (2) 空间位阻 异性往往会变化 (3) 内扩散阻力 (4) 半透膜阻挡
载体上引进活泼基团
关键 活化该活泼基团 此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共价键
② 共价键结合法

载体活化方法
A．重氮法 B．叠氮法 C．烷基化反应法 D．硅烷化法 E．溴化氰法
② 共价键结合法
共价键结合法的特点
优点：
酶与载体结合牢固，稳定性好。一般不会因底物浓度 高或存在盐类等原因而轻易脱落，有利于连续使用。
酶活力的变化 酶稳定性的变化 最适温度的变化 最适pH的变化 米氏常数(Km)的变化
固定化酶的活力 蛋白质含量测定 操作半衰期 酶结合效率 活力回收率 相对活力
固定化酶的评价指标
第二节结束

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第三节 固定化酶的制备原则、固定化方 法及特点
一、 固定化酶的制备原则 二、 固定化酶的制备方法及特点
② 微囊型

微囊化法制备固定化酶的方法 界面沉淀法：物理方法，利用某些高聚物在水相和有机相 的界面上溶解度较低而形成的皮膜将酶包埋 界面聚合法：化学方法，利用油水界面上发生聚合反应形 成聚合体而将酶包裹起来
2、各类固定化方法的特点比较
载体结合法
比较项目 物理吸 附 易 弱 较高 交联法 离子键结合 共价键结合 易 中等 高 难 强 低 较难 强 中等 较难 强 高 包埋法
第三节结束

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第五章 固定化酶

第一节 概述


第二节 固定化酶的特点、性质及其评价指标
第三节 固定化酶的制备原则、固定化方法及 特点 第四节 固定化细胞 第五节 固定化原生质体和辅酶 第六节 酶反应器 第七节 固定化酶（细胞）的应用

第四节 固定化细胞
一、固定化细胞的概念和目的 二、固定化细胞的特点
三、固定化酶的评价指标
一、固定化酶的优缺点
多次使用 反应操作方式多样(分批、连续) 提高了酶的稳定性 纯化简单、提高产物质量 反应过程可以严格控制
较游离酶更适合于多酶反应 降低酶活力 大分子底物较困难 缺点： 首次投入成本高 多酶反应不及完整菌株
优点：
二、固定化酶的性质变化
1、酶活力的变化
2、酶稳定性的变化
(3) 交联法
方法
酶直接交联法：在酶液中加入适量多功能试剂，使其形
（无载体固定化）
成不溶性衍生物
依赖酶与试剂的浓度、溶液pH和离子强度、温度和反
应时间之间的平衡
酶辅助蛋白交联：使用辅助蛋白(白蛋白、明胶、血红蛋
（共交联法）
白等)来增加蛋白质浓度，使酶与惰 性蛋白质共交联
可避免分子内交联和在交联过程中因化学修饰而引起 酶失活
(3) 交联法
双重固定法

通过酶分子间交联形成的固定化酶颗粒一般很 小，而且机械性能不是很好 吸附交联法
交联包埋法
(4) 包埋法

将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定 化的方法 常用载体：琼脂、琼脂糖、海藻酸钠、角叉菜胶、 明胶、聚丙烯酰胺、火棉胶等 分类：网格型和微囊型


① 网格型
② 微囊型

关键在于选择适当的固定化方法和必要的 载体以及稳定性研究、改进

四大类方法
(1)吸附法（包括电吸附法） (2)结合法（无机多孔材料） (3)交联法（双功能试剂） (4)包埋法（微胶囊法）
(1) 吸附法

物理吸附法。利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附 在其表面上 无机：高岭土、皂土、硅胶、氧化铝、活性炭、微孔玻 璃、多孔玻璃等 有机：纤维素、胶原、火棉胶、树脂、陶瓷等
载体 DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、CMC-纤维素等

使用时注意pH、离子强度、温度等的控制 操作简单，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心不 易被破坏，酶活回收率高 载体和酶结合力弱，易受缓冲液种类和pH的影响，在离 子强度高的条件下进行反应时，酶往往从载体上脱落


② 共价键结合法

酶的缺陷
稳定性差
分离纯化困难 回收困难
2、什么是固定化酶？
水溶性酶 水不溶性载体
结合固定 水不溶性酶 固相酶
固定化酶：被局限在某一特定区域上的，
并且保留了它们的催化活力，可以反复、 连续使用的酶
E
S S
P
2、发展历程
1916 发现酶被吸附在骨炭粉上仍具有活性 1953 Grubohofer等将羧肽酶、淀粉酶、胃蛋