碧波Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒说明书
Annexin V-FITC PI细胞凋亡检测试剂盒
Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit一、试剂盒说明在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS ）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS ）由脂膜内侧翻向外侧。
Annexin V 是一种分子量为35~36kD 的Ca 2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。
因此Annexin V 被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。
将Annexin V 进行荧光素FITC 标记，以标记了的Annexin V 作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。
碘化丙啶（Propidium Iodide, PI ）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI 能够透过细胞膜而使细胞核染红。
因此将Annexin V 与PI 匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。
本试剂盒可应用于培养细胞凋亡检测（不推荐用于检测组织样本）。
二、试剂盒组份 组份(20 assays) (50 assays) (100 assays) 储存条件 AnnexinV-FITC100 μL 250μL 500 μL Propidium Iodide100 μL 250μL 500 μL Binding Buffer 10.0 mL 25 mL 50 mL 注：1、Annexin V-FITC 组份建议按需分装小份冻存于-20℃，避免反复冻融； 2、Propidium Iodide 和Binding Buffer 组份不用时可放置于4℃保存，Propidium Iodide 需要避光。
3、Store at -20℃ for 12 months三、试剂盒以外自备仪器和试剂流式细胞仪或荧光显微镜、低速离心机、微量移液器 1.5m L Microtube 、载玻片、盖玻片（荧光显微镜观察需用）、PBS 、不含EDTA 的胰酶消化液四、使用注意事项1.微量试剂取用前请离心集液。
AnnexinV-FITC细胞凋亡检测说明书
凯基Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒一、原理在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。
Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。
因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。
将Annexin V进行荧光素（FITC、FITC）标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。
与FITC 的绿色荧光信号相比，FITC的绿色荧光信号具有信号强，不易淬灭，稳定性高等优点，故本试剂盒采用FITC作为荧光标记探针。
碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。
因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。
二、试剂盒组份三、操作步骤1．用适当的方法诱导细胞凋亡，同时设立阴性对照组，并收集细胞；2．用PBS洗涤细胞二次（离心2000rpm，5min）收集1~5×105细胞；3．吸取250μL的2×Binding Buffer和250μL灭菌去离子水（用户自备），混匀；4．用上述500μL的1×Binding Buffer悬浮细胞；5．加入1μL Annexin V-FITC混匀后加入5 μL Propidium Iodide，然后混匀；6．避光室温反应5min；根据不同的分析方法选择步骤A或B。
A．荧光显微镜观察1．滴一滴经过步骤1~6处理过的细胞悬浮液于载玻片，并用盖玻片盖上细胞；2．对于贴壁细胞来说，也可直接用盖玻片来培养细胞并诱导细胞凋亡；（1）将细胞于盖玻片上生长，用适当的凋亡诱导剂诱导细胞凋亡，并设立阴性对照组；（2）用PBS洗涤细胞两次；（3）吸取250μL 的2×Binding Buffer和250μL灭菌去离子水（用户自备），混匀；（4）加入1μL Annexin V-FITC混匀后加入5 μL Propidium Iodide，然后混匀；（5）将（4）步骤的溶液滴加于盖玻片表面，使长有细胞的盖玻片表面均匀覆盖；（6）避光室温反应5 min。
Annexin-V-FITC细胞凋亡检测试剂盒
2. Yang L, Zhou X, Yang J, Yin X, Han L, Zhao D. Aspirin inhibits cytotoxicity of prion peptide PrP106-126 to neuronal cells associated with microglia activation in vitro. J Neuroimmunol. 2008 Aug 13;199(1-2):10-7.
分钟，收集细胞，用50-100μl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞，涂片后，荧光显微镜下观察。 2. 对于贴壁细胞：
A. 把细胞培养液吸出至一合适离心管内，PBS洗涤贴壁细胞一次，加入适量胰酶细胞消化液(可含有EDTA)消化细胞。 室温孵育至轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时，吸除胰酶细胞消化液。需避免胰酶的过度消化。
使用说明：
1. 对于悬浮细胞： A. 在进行完细胞凋亡刺激后，1000g (约1000-2000rpm)离心5分钟，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数。 注意：PBS重悬不能省略，PBS重悬的过程同时也起到了洗涤细胞的作用，可以保证后续Annexin V-FITC的结合。
B. 取5-10万重悬的细胞，1000g离心5分钟，弃上清，加入195μl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。 C. 加入5μl Annexin V-FITC，轻轻混匀。 D. 室温(20-25℃)避光孵育10分钟。可以使用铝箔进行避光。 E. 1000g离心5分钟，弃上清，加入190μl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。 F. 加入10μl碘化丙啶染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置。 G. 随即进行流式细胞仪检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。如果用于荧光显微镜下检测，1000g离心5
ViaStain No Wash Annexin V-FITC 产品说明书
ViaStain TM No Wash Annexin V – FITC Kit For Celigo Product Number: CSK-V0007-1Sample Kit: CSK-V0007-S (Not available for purchase)This product is for RESEARCH USE ONLY and is notapproved for diagnostic or therapeutic usePage left blank intentionally Nexcelom Bioscience LLC. | 360 Merrimack Street, Building 9 | Lawrence, MA 01843Table of Contents1. Introduction1.1 Assay Description Page 31.2 Materials and Reagents Page 31.3 Instrument and Software Page 32. Assay Protocol2.1 Preparation of Control Samples Page 42.2 Preparation of Adherent Cells for Staining Page 42.3 Staining Procedure Page 43. Celigo Assay Setup Options3.1 Celigo Setup for Cell Apoptosis: PS Ext + Dead + Total Page 53.2 Celigo Setup for Expression Analysis Target 1 + 2 + 3 + Mask Page 54. Celigo Software Settings for Cell Apoptosis: PSE + Dead + Total Page 64.1 HOME and SETUP Tabs Page 64.2 Scan Tab Page 64.3 Analyze Tab Page 74.4 Results Tab Page 95. Celigo Software Settings for Expression Analysis: Target 1+2+3+Mask Page 105.1 HOME and SETUP Tabs Page 105.2 Scan Tab Page 105.3 Analyze Tab Page 115.4 Gate Tab Page 125.4 Results Tab Page 146. Additional Resources6.1 Technical Support Page 156.2 Storage and Handling Page 156.3 Warranty Page 157. Ordering Information1.0Introduction1.1Assay DescriptionApoptosis, or programmed cell death, is a natural process of cellular self-destruction. Apoptosis is a part of routine cell turnover and tissue homeostasis, prevalent in epithelial cells, erythrocytes, and other cell types genetically programmed to have a limited life span. It is also important in embryogenesis, maintenance of immune tolerance, and development of the nervous system. Apoptosis can be induced either by a stimulus, such as irradiation or toxic drugs, or by removal of a repressor agent. The cells disintegrate into membrane-bound particles that are then eliminated by phagocytosis.Necrosis is the death of cells or tissues from severe injury or disease, especially in a localized area of the body. Causes of necrosis include inadequate blood supply (as in infarcted tissue), bacterial infection, traumatic injury, and hyperthermia.Annexin V and propidium iodide are used to measure apoptosis and necrosis. Annexin V is a member of the annexin family of intracellular proteins that binds to phosphatidylserine (PS) in a calcium dependent manner. PS is normally only found on the intracellular leaflet of the plasma membrane in healthy cells, but during early apoptosis, PS translocates to the external leaflet. Fluorochrome-labeled Annexin V can then be used to specifically target and identify the PS on the surface of apoptotic cells. Annexin V binding alone cannot differentiate between apoptotic and necrotic cells. Propidium Iodide (PI) solution is a membrane-exclusion dye that permeates cells with compromised cell membranes and binds to DNA. Early apoptotic and healthy cells with intact membranes will exclude PI, while late stage apoptotic and necrotic cells with compromised membranes are stained. Use of both Annexin V-FITC and PI allows researchers to characterize a cell population based on % normal, % apoptotic, and % necrotic /very late-stage apoptotic cells.Elmore S. (2007). Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death. Toxicol. Pathol. 35(4): 495-516. Rastogi RP, et al. (2009). Apoptosis: Molecular Mechanisms and Pathogenicity. EXCLI J. 8:155-1811.2Materials Included•ViaStain TM No Wash Annexin V – FITC Kit For CeligoCat. # CSK-V0007 (Stains 1, 96-well plate)o(Component A) Propidium iodide: 30 µL at 1 mg/mLo(Component B) Hoechst 33342: 6 µL at 20 mMo(Component C) Annexin V-FITC: 100 µLo(Component D) Annexin V Binding Buffer: 10 mL•ViaStain TM No Wash Annexin V – FITC Kit For Celigo Instruction Booklet1.3Additional Materials required, but not included•96-well flat bottom, clear bottom, black walled•Cells with appropriate media1.4Instrument and Software Requirement•Celigo® Imaging Cytometer InstrumentNexcelom Bioscience LLC. | 360 Merrimack Street, Building 9 | Lawrence, MA 018432.0 Assay Protocol for No-wash Annexin V Assay2.1Preparation of Control Samples1.A positive control may be generated by exposing cells to pharmacological agents such as α-TOS,Etoposide, or Staurosporine.2.A negative control (untreated cells) should be tested to determine baseline cell concentrationviability of the cells.2.2Preparation of Adherent Cells1.Adherent cells do not have to be trypsinized for this assay. Cell growth, treatment, staining andimaging may be done in the same plate.2.Plate cells and let adhere overnight in incubator.3.Treat cells with appropriate compounds that induce Apoptosis.2.3Staining Procedure for 96-well Plate Type2.3.1Create Stock SolutionFor a 96-well plate prepare a 1.5x master mix staining solution using the following reagents:1.Pipette 9864 mL of Annexin V Binding Buffer into a 15 mL centrifuge tube2.Add 100 µl of the Annexin V-FITC3.Add 30 µl of the Propidium Iodide4.Add 6 µl of the Hoechst 333425.Cap and vortex tube for 10 seconds to mix reagents2.3.2Staining Protocol for 96 well plate1.Remove liquid in wells so only 50 µl is remaining in wells2.Pipette 100 µl of 1.5x staining solution per well containing 50 µl of volume. Final volume perwell will now be 150 µl3.Incubate for 30-45 minutes at 37°C 5% CO2 in the darkNexcelom Bioscience LLC. | 360 Merrimack Street, Building 9 | Lawrence, MA 018433.0 Celigo Assay Setup OptionsApoptosis assay can be analyzed in two different ways (3.1 and 3.2): 3.1Cell Apoptosis: PSE + Dead + Total (see section 4.0)➢3-channel application Green, Red, Blue➢pre-labelled channels➢Simple analysis – no gating required➢Bright-field images are not acquired➢Phosphatidylserine Externalization (PS Ext)3.2Expression Analysis: Target 1+2+3+Mask (see section 5.0)➢4-channel application Green, Red, Brightfield, and Blue➢Customizable channel names➢Data analysis via population gating is required➢Obtain Brightfield image for observation onlyNexcelom Bioscience LLC. | 360 Merrimack Street, Building 9 | Lawrence, MA 01843Nexcelom Bioscience LLC. | 360 Merrimack Street, Building 9 | Lawrence, MA 018434.0 Celigo Software Settings for Cell Apoptosis: PSE + Dead + Total4.1 HOME and SETUP Tabs:1. Create a new scan and name file appropriately.2. If experimental settings had been previously optimized then select these to be used.4.2 SCAN Tab:Setup image acquisition settings for each channel as described below. Ensure signal of objects is well separated from background. Ideal object signal 100-150 pixel intensity to ideal background 1-25 pixel intensity.4.2.1 Select an Application1. Select Celigo Application: PS Externalization (PS Ext + Dead + Total).4.2.2 Setup Total Channel1. Select Blue illumination for Hoechst stain.2. Set Exposure time should be around 80,000-100,000 μs (Gain 0).3. In Focus Setup, Register Auto for Hardware Auto Focus for Total Channel.4.2.3 PS Ext Channel Setup1. Select Green illumination for Annexin V-FITC stain.2. Exposure time should be around 60,000-80,000 μs (Gain 0).3. Click “Find focus” and “Set Offset”.4.2.4 Dead Channel Setup1. Select Red illumination for Propidium Iodide stain.2. Exposure time should be around 20,000-30,000 μs (Gain 0).3. Click “Find focus” and “Set Offset”.4.Select wells to acquire and “Start Scan”.PS ExtDeadTotalAnnexinVPropidium IodideHoechstNexcelom Bioscience LLC. | 360 Merrimack Street, Building 9 | Lawrence, MA 018434.3 ANALYZE Tab:The Celigo Cell Apoptosis application segments all three fluorescent channels. Fluorescent objects will be identified in each channel. Green and Red objects (for apoptotic and dead cells) will be counted only if they are super-imposed with a blue fluorescent object (for nuclear stain). Therefore, segmented green and red objects (such as fluorescent debris) not associated with a blue nucleus will be rejected from the analysis.4.3.1 General Section Analysis Setup1. Select “Well Mask” and “Automatic” to exclude the outerpart of the well. 2. Shrink to 98%4.3.2 PS Ext (+) Analysis Setup1. Intensity Threshold: select 2-32. Cell Diameter: select 133. Minimum Area: type 304.3.3 “Dead ” Analysis Setup1. Intensity Threshold: select 3-42. Cell Diameter: select 103. Minimum Area: type 304.3.4 “Total ” Analysis Setup1. Intensity Threshold: select 42. Cell Diameter: select 103. Separating Touching Objects: Checked4. Minimum Area: type 304.3.5 Well Selection and Start Analysis1. On Plate Map, click “Selection” and s elect wells to analyze2. Click “Start Analyze”PS Ext SettingDead SettingsTotal SettingsNexcelom Bioscience LLC. | 360 Merrimack Street, Building 9 | Lawrence, MA 01843Expected Segmentation:Use the “Image Display” and “Graphic Overlay” controls to visualize segmentation.Typical images and fluorescent objects identification should look as follow:AnnexinV DeadTotalI m a g e sS e g m e n t a t i o nNexcelom Bioscience LLC. | 360 Merrimack Street, Building 9 | Lawrence, MA 018434.4 RESULTS Tab:Image analysis uses a method that first identifies the nuclei in the image, then evaluateswhether objects from the Live and Dead channels overlap. If they do overlap, they are reported as Live +, Dead, Live+ and Dead. Live + objects and Dead objects not associated or overlapping a nuclear area (i.e. debris or detached cell membrane) are not included in analysis.Table of Data Reported NamePS Ext (+) correctedPS Ext (+)DeadTotalPercent (relative to Total) • • • Counts• • • • Mean Intensity (AVE, SD) • • • • Integrated Intensity (AVE, SD) •• • •PS Ext + Dead + TotalSegmentation OverlaysAnnexin V cell with green overlay super-imposing a blue nucleus overlayDead cell with red overlay super-imposing a blue nucleus overlay Annexin PS Ext overlay dismissed from analysis because not super-imposing a blue nucleus overlayBlue Nuclei with Yellow Graphic Overlay identifies all cellsNexcelom Bioscience LLC. | 360 Merrimack Street, Building 9 | Lawrence, MA 018435.0 Celigo Software Settings for Expression Analysis: Target 1+2+3+Mask5.1 HOME and SETUP Tabs:1. Create a new scan and name file appropriately.2. If experimental settings had been previously optimized then select these to be used.5.2 SCAN Tab:5.2.1 Select an Application1. Select Celigo Application: Expression Analysis Target 1+2+3+Mask2. Rename Channel, Graphic Overlay, & Class label5.2.2 Mask “Hoechst ” Channel Setup1. Select Mask (HO) Channel2. Select Blue Illumination3. Exposure time should be around 80,000-100,000 µs4. Click Focus Setup, then click Auto Register to register hardware focus position.5. Adjust Illumination exposure. Ideal object pixel intensity should be between 100-150 with background signal no higher than 25 pixel intensity5.2.3 “Annexin V ” Channel Setup1. Select Annexin V (AV) Channel2. Select Green Illumination3. Exposure time should be around 50,000-90,000 µs4. Click Find Focus, or adjust manually.5. Click Set Offset6.Adjust Illumination exposure. Ideal object pixel intensity should be between 100-150 with background signal no higher than 25 pixel intensity5.2.4 “Dead ” Channel Setup1. Select Red Illumination2. Exposure time should be around 30,000-60,000 µs3. Click Find Focus, or adjust manually.4. Click Set Offset5. Adjust Illumination exposure. Ideal object pixel intensity should be between 100-150 with background signal no higher than 25 pixel intensityPropidium IodideHoechst5.2.5“Brightfield” Channel Setup1.Select Brightfield (BF) Channel2.Select Brightfield Illumination3.Set Exposure time to Auto-Exposure Auto-Gain4.Ideal background pixel intensity should be between 125-1305.Click Find Focus, or adjust manually.6.Click Set Offset7.Click Selection button on plate map8.Select wells to be imaged9.Click Start Scan to begin image acquisition5.3ANALYZE Tab:5.3.1General Section Analysis Setup1.Select “Well Mask” and “Automatic” to exclude theouter part of the well2.Shrink to 98%5.3.2Mask (HO) Analysis Setup1.Turn ON Blue image display and graphic overlay2.Turn OFF the other image displays and graphicoverlay3.Select a green well to view images4.Adjust Intensity Threshold to ensure properidentification of the nucleus. Default value of “4”with “high Precision” works well for nuclear stains.5.Set the “Cell Diameter” to “10”6.Increase “Dilation Radius” to “5”7.Select “Separate Touching Objects” to ensure proper separation of nuclei in close proximity.5.3.3Annexin V (AV) Analysis Setup1.Switch to Annexin V (Green) Channel2.Check Background Correction ON3.Click Gate TabNexcelom Bioscience LLC. | 360 Merrimack Street, Building 9 | Lawrence, MA 018435.4GATE Tab:Similar to flow cytometry, we use the Celigo gating interface to identify sub-populations of cells in various phases of apoptosis. Plotting the size of the identified objects and the intensities of the Annexin V and Propidium Iodide is required.5.5.1Histogram of Area Setup1.In the gating area, select “+” to c reate a plot2.Select “Histogram” plot type and choose“Area”3.Select “Range” gate4.Then draw ( ) over histogram area wheremajority of population is located in order tocreate “Pop 1” of objects. This excludes smalland large objects.5.Assign the gated cells to the “T otal” class.5.5.2Scatter Plot of Green vs Red Mean Intensity Setup1.Select “+” to create a plot2.Select Scatter plot and select3.Green: Mean Intensity for X-axis, and4.Red: Mean Intensity for Y-Axis.5.Select quadrant gateand click on scatterplot just above andleft of blue dots.6.Adjust xy-axis rangesto focus in on lowintensity area. Adjustlocation of quadrantto best sit left of livepopulationNexcelom Bioscience LLC. | 360 Merrimack Street, Building 9 | Lawrence, MA 01843Nexcelom Bioscience LLC. | 360 Merrimack Street, Building 9 | Lawrence, MA 018435.5.3 Check Populations for ReportingSubclasses1. Check appropriate boxes to label classes forAV, PI, AV PI, and Live2. Check control wells to verify quadrant is incorrect location. 3. Select Start AnalysisExample Segmentation, Plots and Gates:T R E A T E DC O N T R O L5.6RESULTS Tab:Image analysis and gating uses a method that first identifies the nuclei in the Mask image channel, then measures FL signature in the additional channels. Objects are then plotted according to their size and FL signature. Gates are used to create subpopulations. Check boxes identify what populations will be reported.Nexcelom Bioscience LLC. | 360 Merrimack Street, Building 9 | Lawrence, MA 018436.0 Additional Resources6.1Technical Support•Celigo Learning Center (online) at /celigo-learning•Nexcelom Technical Support is available from 9am to 5:00pm EST.E-mail: ********************Phone: 978-327-53406.2Storage and Handling•For storage conditions please see the product label on each individual component.6.3WarrantyThis product is for RESEARCH USE ONLY and is not approved for diagnostic or therapeutic use.Product is warranted to meet the specifications outlined in the Certificate of Analysis whenstored and used according to the manufacturer’s instructions. No other warranty, expressed or implied (such as merchantability, fitness for a particular purpose, or non-infringement) isgranted. Warranty is valid until the expiration date stated on the product label. If no expiration is listed, the warranty is valid for 6 months from the date of product receipt. Warranty will be void if product is stored incorrectly, the recommended protocol is not followed, or the product is used for a different application.7.0 Ordering Information7.1How to ReorderFor orders shipping to destinations in the United States:•When ordering with a Purchase ordero Fax a copy of your order to 978-327-5341o*****************************************•When ordering with a Credit Cardo Visit and place your orderFor orders shipping to destinations outside the United States:Contact your local distributor or Nexcelom Representative to place your orderNexcelom Bioscience LLC. | 360 Merrimack Street, Building 9 | Lawrence, MA 01843。
Annexin V-FITC细胞凋亡检测详细步骤及说明
Annexin V-FITC细胞凋亡检测详细步骤及说明1. 对于悬浮细胞：a. 在进行完细胞凋亡刺激后，1000g离心5分钟，弃上清，收集细胞，用PBS 轻轻重悬细胞并计数。
注意：PBS重悬不能省略，PBS重悬的过程同时也起到了洗涤细胞的作用，可以保证后续Annexin V-FITC的结合。
b. 取5-10万重悬的细胞，1000g离心5分钟，弃上清，加入195µl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。
c. 加入5µl Annexin V-FITC，轻轻混匀。
d. 加入10µl碘化丙啶染色液，轻轻混匀。
e. 室温(20-25ºC)避光孵育10-20分钟，随后置于冰浴中。
可以使用铝箔进行避光。
孵育过程中可以重悬细胞2-3次以改善染色效果。
f. 如果用于流式细胞仪检测，可立即上机检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，碘化丙啶(PI)为红色荧光，流式检测细胞凋亡的效果及其验证请参考图1和图2。
初次进行流式细胞仪检测时，建议选择一组适当的细胞参考图2设置未染色、PI单染和Annexin V-FITC单染这3个对照。
如果用于荧光显微镜检测，1000g 离心5分钟，收集细胞，用50-100µl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞，涂片后，荧光显微镜下观察。
注意：细胞在染色后须尽快完成检测，通常宜在1小时之内完成检测。
用于流式细胞仪检测时，如果发现Annexin V-FITC单独染色时出现了过多的PI假阳性细胞，并且通过调整相关设置和参数也无法改善，可以用PBS将Annexin V-FITC稀释3-10倍后再进行检测。
2. 对于贴壁细胞的消化后检测：a. 把细胞培养液吸出至一合适离心管内，PBS洗涤贴壁细胞一次，加入适量胰酶细胞消化液(可含有EDTA)消化细胞。
室温孵育至轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时，吸除胰酶细胞消化液。
需避免胰酶的过度消化。
碧云天生物技术活细胞Caspase-3活性与Annexin V细胞凋亡检测试剂盒说明书
碧云天生物技术/Beyotime Biotechnology订货热线: 400-1683301或800-8283301订货e-mail:******************技术咨询: *****************网址: 碧云天网站 微信公众号活细胞Caspase-3活性与Annexin V细胞凋亡检测试剂盒产品编号产品名称包装C1077S 活细胞Caspase-3活性与Annexin V细胞凋亡检测试剂盒20次C1077M 活细胞Caspase-3活性与Annexin V细胞凋亡检测试剂盒50次产品简介：碧云天生产的活细胞Caspase-3活性与Annexin V细胞凋亡检测试剂盒(Caspase-3 Activity and Apoptosis Detection Kit for Live Cell)是基于新型的具有细胞膜通透性的Caspase-3/7绿色荧光底物GreenNuc™Caspase-3 Substrate联合细胞凋亡红色荧光探针Annexin V-mCherry来检测培养细胞中Caspase-3活性和细胞凋亡的红绿荧光双染试剂盒，可用于实时监测活细胞中Caspase-3活性和凋亡情况。
本试剂盒适用于流式细胞仪、荧光显微镜或其它荧光检测系统进行检测。
细胞凋亡(Apoptosis)是生物体发育等生命过程中普遍存在的、由基因决定的细胞主动有序的死亡方式。
当细胞遇到内、外环境因子刺激时，启动基因调控的自杀保护措施，去除体内非必需细胞或即将发生特化的细胞。
在这一过程中，细胞脱落离体或裂解为若干凋亡小体，并迅速被巨噬细胞或邻近细胞清除，这是一种由基因控制、高度有序的细胞自主死亡，包含一系列信号事件组成的通路。
细胞凋亡失调与多种疾病有关，例如阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)和癌症等。
Caspase (cysteine-dependent aspartate-specific proteases)的全称为天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶，存在于蛋白质中，主要利用半胱氨酸(cysteine)侧链选择性地高效切割含有天冬氨酸(aspartate)的多肽底物，在介导细胞凋亡(apoptosis)过程中起重要作用，并参与细胞的炎症、生长和分化等过程。
AnnexinV凋亡试剂盒操作步骤
请在使用前仔细阅读说明书Annexin V,FITC 凋亡检测试剂盒(100次)产品名称货号规格储存条件运输条件Annexin V,FITC结合物AD01-10 100次×1 0-5℃，避光(切勿冻存) 室温PI Solution AD02-05 50次×2 0-5℃，避光(切勿冻存) 室温10×Annexin V Binding Buffer AD03-05 50次×2 0-5℃，避光(切勿冻存) 室温*注：规格中的每“次”是以细胞浓度1×106 cells/ml计算产品描述细胞凋亡是指为维持有机体内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。
正常情况下任何细胞在形成过程中发生的异常都会通过凋亡消除。
例如体内的癌细胞增长为肿瘤的过程会受细胞凋亡的引导而被抑制。
然而在抑癌基因p53出现问题时，凋亡就不会诱导发生，从而导致癌细胞的不断增长。
细胞凋亡可以通过细胞形态的变化或生物化学的变化来检测。
目前常用的指标有caspase活性变化、DNA碎片、磷脂酰丝氨酸的外翻等。
Annexin V染色的细胞可以用于检测细胞凋亡早期的细胞膜变化。
在细胞凋亡早期，膜磷脂酰丝氨酸由脂膜内侧翻向外侧。
Annexin V 是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜特异性结合，因此Annexin V 被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。
用绿色荧光FITC标记的Annexin V 通过流式细胞仪或荧光显微镜可以检测到细胞凋亡的发生。
碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一种核酸染料，PI只能透过凋亡晚期和死细胞的细胞膜，因此Annexin V和PI结合使用，可以区分凋亡早晚期的细胞及死细胞。
所需的设备和材料-合适量程的移液枪-样品和诱导剂-细胞培养用6，12，24，96孔板-PBS、去离子水-流式细胞仪或荧光显微镜。
Annexin V-FITC试剂说明书
E-mail: Website: Annexin V-FITC ReagentCat. No: E-CK-A111 Size: 50 Tests/100 Tests/200 Tests/500 Tests Rev. V1.4产品编号 产品名称50 Tests 100 Tests 200 Tests 500 Tests Storage E-CK-A111Annexin V-FITC Reagent 250 μL500 μL1 mL 1.25 mL ×22~8℃, shading light说明书一份保存条件2~8℃可保存1年。
Annexin V-FITC 禁止冷冻保存。
产品简介Elabscience ®自主研发的Annexin V-FITC Reagent 用于鉴定凋亡细胞。
Annexin V 是一种钙离子依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸 (PS) 有高度亲和力。
当细胞发生凋亡时，膜内侧的磷脂酰丝氨酸 (PS) 外翻到膜表面，而被荧光染料FITC 标记的Annexin V 结合，可通过流式细胞仪或荧光显微镜进行检测。
Annexin V 搭配PI 或7-AAD 、DAPI 等DNA 染色液使用，可区分处于不同凋亡时期的细胞。
本试剂搭配PI 检测喜树碱诱导的Jurkat 细胞凋亡效果如下图所示：实验操作1． 细胞按照实验方案进行凋亡诱导，300 ×g 离心5 min ，弃上清，收集细胞，PBS 洗涤一次，轻轻重悬细胞并计数。
2． 取1~5×105重悬的细胞，300 ×g 离心5 min ，弃上清。
用PBS 洗涤细胞一次，离心后弃上清，加入500 μL 稀释的1 × Annexin V Binding Buffer 重悬细胞。
3． 细胞悬液中加入5 μL 的Annexin V-FITC Reagent 和5 μL 的细胞核DNA 染色液。
4． 轻柔涡旋混匀后，室温避光孵育15~20 min 。
细胞凋亡实验详细步骤及说明
细胞凋亡实验详细步骤及说明实验概述本实验旨在研究细胞凋亡的过程和机制。
细胞凋亡是一种正常的细胞死亡方式，对于维持组织的稳态具有重要作用。
通过本实验，我们可以了解细胞凋亡的特征和调控通路，以及一些常用的检测方法。
实验材料- 培养皿- 细胞培养基- 不同处理条件下的细胞（例如药物处理、基因敲除等）- Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒- 显微镜实验步骤1. 培养细胞：将细胞按照常规方法培养至适当的细胞数目。
2. 细胞处理：根据实验设计，在细胞培养基中添加不同处理条件下所需的药物。
3. 收集细胞：根据实验设计决定收集细胞的时间点，使用适当的方法将细胞收集到离心管中。
4. 染色试剂处理：根据实验需求，使用 Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒中的染色试剂进行细胞染色，按照试剂盒说明书的操作步骤进行。
5. 检测细胞凋亡：将染色后的细胞标本放置在显微镜下观察，并使用适当的过滤器和荧光镜头进行观察。
6. 数据分析：根据观察结果，统计和分析不同处理条件下细胞凋亡的数量和特征。
实验注意事项- 操作过程中应严格遵守实验室安全规范，确保个人和实验室安全。
- 细胞培养过程中，注意细胞接种密度和培养基条件的控制，以维持细胞的正常生长状态。
- 在染色试剂处理过程中，按照试剂盒说明书的要求进行操作，避免试剂污染和误操作。
- 在显微镜观察过程中，注意调整适当的放大倍数和聚焦，以获得清晰的细胞图像。
实验结果与讨论根据实验结果可以获得不同处理条件下细胞凋亡数量和特征的数据。
结合相关文献和已有知识，可以对细胞凋亡的机制和调控通路进行深入的讨论。
实验结果可以为进一步研究细胞凋亡的相关领域提供有价值的数据基础。
以上是细胞凋亡实验的详细步骤及说明。
希望对你的研究有所帮助！。
ANNEXIN V-FITC PI 凋亡检测试剂盒说明书
第1页，共3页ANNEXIN V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒说明书注意：本产品试剂浓度发生变化，使用前请仔细阅读说明书。
货号：CA1020规格：20T/50T /100T保存：2-8°C ，避光保存，有效期1年。
产品说明：细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS 暴露在细胞膜外表面。
PS 是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS 暴露在细胞膜外。
Annexin V 具有易于结合到磷脂类如PS 的特性，对PS 有高度的亲和性。
因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS 。
PS 转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。
两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。
因此，可以采用Annexin V 与PI 双染的方法，通过流式检测细胞早期凋亡。
操作步骤:1.细胞样品的准备：a)对于贴壁细胞：小心收集细胞培养液到一离心管内备用。
用不含EDTA 的胰酶消化细胞，至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。
再次收集到离心管内。
1000rpm 左右离心5min ，沉淀细胞。
对于特定的细胞，如果细胞无法完全离心至离心管底，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。
小心吸除上清，可以残留约50µl 左右的培养液，以避免吸走细胞。
加入约1ml 4℃预冷的PBS ，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。
b)对于悬浮细胞：1000rpm 左右离心5min ，沉淀细胞。
对于特定的细胞，如果细胞无法完全离心至离心管底，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。
小心吸除上清，可以残留约50µl 左右的培养液，以避免吸走细胞。
PH0536 Annexin V-PE细胞凋亡检测试剂盒操作手册
PH0536|Annexin V-PE细胞凋亡检测试剂盒（Annexin V-PE apoptosis detection kit）货号：PH0536规格：PH0536-20|20T存储：4℃保存，半年有效。
AnnexinV-PE需避光保存。
◆产品组分试剂组成规格保存Annexin V-PE100uL4℃Annexin V-PE结合液12mL4℃，避光说明书1份/◆产品简介Annexin V-PE细胞凋亡检测试剂盒(Annexin V-PE Apoptosis Detection Kit)是用PE(Phycoerythrin)标记的重组人Annexin V来检测细胞凋亡时出现在细胞膜表面的磷酯酰丝氨酸的一种细胞凋亡检测试剂盒。
可以使用流式细胞仪、荧光显微镜或其它荧光检测设备进行检测。
本试剂盒检测的是红色荧光，因此在待检测的细胞已经表达GFP等绿色荧光蛋白的情况下，特别适合使用本试剂盒检测细胞凋亡。
PE可以被495nm、545或564nm的激发光所激发，发出峰值为575nm的荧光。
(参考图1)Annexin是一类广泛分布于真核细胞细胞浆内钙离子依赖的磷酯结合蛋白，参与细胞内的信号转导。
但仅Annexin V被报道可以调控一些PKC的活性。
Annexin V选择性结合磷酯酰丝氨酸(phosphatidylserine，简称PS)。
磷酯酰丝氨酸主要分布在细胞膜内侧，即与细胞浆相邻的一侧。
在细胞发生凋亡的早期，不同类型的细胞都会把磷酯酰丝氨酸外翻到细胞表面，即细胞膜外侧。
磷酯酰丝氨酸暴露到细胞表面后会促进凝血和炎症反应。
而Annexin V和外翻到细胞表面的磷酯酰丝氨酸结合后可以阻断磷酯酰丝氨酸的促凝血和促炎症反应活性。
用带有红色荧光的荧光探针PE标记的Annexin V，即Annexin V-PE，就可以用流式细胞仪或荧光显微镜非常简单而直接地检测到磷酯酰丝氨酸的外翻这一细胞凋亡的重要特征。
正常细胞不会被Annexin V-PE所染色，凋亡细胞和坏死细胞都会被Annexin V-PE所染色。
Annexin V-FITCPI细胞凋亡检测试剂盒
Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒上海优宁维生物科技有限公司一、概述在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧，细胞发生凋亡最早期，膜磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧，这一变化早于细胞皱缩、染色质浓缩、DNA片断化和细胞膜的通透性增加等凋亡现象。
AnnexinV是一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。
因此AnnexinV被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。
碘化丙啶（Propidium Iodide,PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但凋亡中晚期的细胞和死细胞由于细胞膜通透性的增加，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。
因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。
因此，将Annexin V与PI联合使用时，PI 则被排除在活细胞（Annexin V-/PI-）和早期凋亡细胞（Annexin V+/PI-）之外，而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被FITC 和PI 结合染色呈现双阳性（Annexin V+/PI+）。
图Annexin V 检测细胞凋亡原理三、实验步骤贴壁细胞需用0.25%的胰酶消化。
注意过度消化可损伤细胞。
在消化时可加2％的BSA 可防止消化过度。
如果用含EDTA的胰酶消化时，注意必须彻底清除EDTA：在标记前用1×PBS或1×bindingbuffer洗涤，清除EDTA，以免残余的EDTA与Ca2＋螯合，影响Annexin V的结合。
（1）用去离子水将10×Binding Buffer稀释成1×Binding Buffer；（2）细胞收集。
悬浮细胞收集：离心5分钟；贴壁细胞：用不含EDTA的胰酶消化收集后（注：胰酶消化时间不宜过长，否则会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与Annexin V-FITC的结合），于室温2000rpm离心5～10分钟，收集细胞；（3）细胞洗涤：用预冷1×PBS（4℃）重悬细胞一次，2000rpm离心5～10分钟，洗涤细胞；（4）加入300μL 的1×Binding Buffer 悬浮细胞；（5）Annexin V-FITC标记：加入5μL的Annexin V-FITC混匀后，避光，室温孵育15分钟；（6）PI标记：上机前5分钟再加入5μL的PI染色。
AnnexinV-FITCPI双染法细胞凋亡检测试剂盒操作说明
AnnexinV-FITCPI双染法细胞凋亡检测试剂盒操作说明细胞凋亡是细胞的基本特征之一,它在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定等方面起着十分重要的作用。
在细胞凋亡过程中,细胞内膜的磷酯酰丝氨酸外翻到细胞外膜,而Annexin V(膜联蛋白V)对其有天然的高亲和能力,故可以用FITC标记(绿色荧光)的Annexin V来检测细胞凋亡,但本方法的缺点是不能区分早期和晚期的凋亡细胞。
早期和晚期的凋亡细胞的一个重要区别在于细胞膜的完整性(凋亡早期细胞没有丧失膜的完整性),故可以用碘化丙啶(PropidiumIodide,PI)来染色加以区分。
图源：网络Annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡检测试剂盒特点：1. 即开即用,不需要专门花时间准备各种成分。
2. 整合了Annexin V-FITC和PI检测法的优点,提高了凋亡细胞检测的灵敏度和特异性,本方法是目前极为灵敏的细胞凋亡检测方法。
3. 跟流式细胞仪、荧光显微镜或其它荧光检测兼容。
Annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡检测试剂盒操作步骤：(一)获得目的基因1、通过PCR方法:以含目的基因的克隆质粒为模板,按基因序列设计一对引物(在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点),PCR循环获得所需基因片段。
2、通过RT-PCR方法:用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA,以mRNA为模板,逆转录形成cDNA第一链,以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。
(二)构建重组表达载体1、Annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡检测试剂盒载体酶切:将表达质粒用限制性内切酶(同引物的酶切位点)进行双酶切,酶切产物行琼脂糖电泳后,用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。
2、PCR产物双酶切后回收,在T4DNA连接酶作用下连接入载体。
(三) 获得含重组表达质粒的表达菌种1、将连接产物转化大肠杆菌DH5α,根据重组载体的标志(抗Amp 或蓝白斑)作筛选,挑取单斑,碱裂解法小量抽提质粒,双酶切初步鉴定。
PH0539-Annexin V-FITCPI 凋亡检测试剂盒使用手册
PH0539|Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒（Annexin V-FITC/PI Apoptosis Assay Kit）货号：PH0539规格：PH0539-50|50T存储：Store at4℃，一年有效。
◆产品组分>>Annexin V-FITC--------------------250ul>>10×Binding Buffer-----------------2*13ml>>Propidium Iodide(PI)--------------500ul◆产品简介细胞凋亡（Apoptosis）是一种由基因控制的细胞自主死亡方式。
它与组织器官的发育，机体正常生理功能的维持，某些疾病的发生发展以及细胞癌变过程均有着密切的关系。
细胞凋亡已成为生命学科极为活跃的研究领域之一。
此外，介绍几种常用的细胞凋亡检测方式。
在细胞凋亡的早期，细胞膜表面的磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS）将会从细胞膜内侧转移到细胞膜外侧，使PS充分暴露在细胞膜外表面。
Annexin V是一种磷脂结合蛋白，对PS有高度的亲和力。
因此，Annexin V作为一个敏感的探针可以有效地检测暴露在细胞膜表面的PS。
目前普遍使用的检测方法是将荧光标记后的Annexin V-FITC作为探针，利用流式细胞仪来检测细胞凋亡。
值得注意的是，在细胞坏死的过程中也会发生PS的暴露。
但两者的差别在于细胞凋亡的初始阶段细胞膜结构是完好的，只有PS转移，而细胞坏死则在早期阶段细胞膜的完整性就破坏了，从而暴漏出PS。
因此，检测细胞凋亡时，通常会使用颜料碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）以确立细胞膜的完整性。
PI是一种核酸染料，它可以染色死细胞，但不能进入完整的活细胞，从而将凋亡性细胞和坏死性细胞区分开来。
◆使用说明1、细胞收集与Annexin V-FITC结合（1）在完成细胞凋亡诱导处理后，1500rpm，5分钟离心后弃上清，收集细胞。
碧云天 细胞凋亡试剂盒(C1062)
7. Ji YB, Qu ZY, Zou X. Juglone-induced apoptosis in human gastric cancer SGC-7901 cells via the mitochondrial pathway. Exp Toxicol Pathol. 2009 Oct 6.
Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒
产品编号 C1062
产品名称 Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒
包装 20次
产品简介：
Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit)是用FITC标记的重组人Annexin V来检测细 胞凋亡时出现在细胞膜表面的磷酯酰丝氨酸的一种细胞凋亡检测试剂盒。可以使用流式细胞仪、荧光显微镜或其它荧光 检测设备进行检测。
C. 取5-10万重悬的细胞，1000g离心5分钟，弃上清，加入195μl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。 D. 加入5μl Annexin V-FITC，轻轻混匀。 E. 室温(20-25℃)避光孵育10分钟。可以使用铝箔进行避光。 F. 1000g离心5分钟，弃上清，加入190μl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。 G. 加入10μl碘化丙啶染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置。 H. 随即进行流式细胞仪检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。如果用于荧光显微镜下检测，1000g离心5
Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒操作方法及步骤说明书
Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒说明：细胞凋亡是细胞的基本特征之一，它在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定等方面起着十分重要的作用。
Annexin Ⅴ是一种分子量为35-36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS）高亲和力特异性结合。
以标记了FITC的Annexin Ⅴ作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。
Propidium iodide（PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。
将Annexin Ⅴ与PI匹配使用，可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞区分开来。
产品组成（50／25次反应）：· Annexin V-FITC 500ul／250ul（20ug /ml）· Binding Buffer 40ml／20 ml· Propidium Iodide (PI) 250ul／125ul（50ug /ml）保存条件: 2-8℃储存，有效期一年。
注意事项：1.为保证得到理想的实验结果，在使用此试剂盒之前请认真阅读该注意事项；2.试剂（尤其是小瓶装的试剂）在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落；3.Propidium iodide（PI）能通过皮肤吸收，对眼睛有刺激作用；4.此试剂盒仅供科研使用，不宜用于临床诊断；5.本试剂盒中提供的PBS为随试剂赠送，并非试剂盒的真正组成成分；细胞的洗涤同常规方法。
操作注意要点：1.整个操作过程动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞，尽量在4℃下操作；2.反应完毕后请尽快检测，因为细胞凋亡是一个动态的过程，反应1小时后荧光强度就开始衰变；3.Annexin V-FITC和Propidium iodide是光敏物质，在操作时请注意避光；4.成功的检测凋亡受以下几种因素的影响，如细胞类型、细胞膜上PS的密度、发生凋亡时PS翻转的比例、诱导细胞凋亡的方法、所用试剂、诱导凋亡的时间等，把这些影响因素进行优化对实验成功是非常必要的；5.在细胞洗涤的最后一步，请尽量将上清弃净，以免PBS残留，有可能会影响实验结果；6.PI染色时间过长有可能造成检测的凋亡率偏高，建议首先进行Annexin V-FITC染色，上机前5分钟再加入PI染色。
Annexin V-FITC说明书
¾ 综上所述，参考右图，用Annexin V-FITC和碘化丙啶染色后，正常的活细胞不被 Annexin V-FITC和碘化丙啶染色(右图左下角)；凋亡早期的细胞仅被Annexin VFITC染色，碘化丙啶染色呈阴性(右图右下角)；坏死细胞和凋亡晚期的细胞可以同 时被Annexin V-FITC和碘化丙啶染色(右图右上角)。右图左上角出现的是许可范围 内的检测误差。
C. 取5-10万重悬的细胞，1000g离心5分钟，弃上清，加入195µl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。 D. 加入5µl Annexin V-FITC，轻轻混匀。 E. 室温(20-25℃)避光孵育10分钟。可以使用铝箔进行避光。 F. 1000g离心5分钟，弃上清，加入190µl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。 G. 加入10µl碘化丙啶染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置。 H. 随即进行流式细胞仪检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。如果用于荧光显微镜下检测，1000g离心5
注意事项：
¾ 如果有细菌或真菌污染，会严重影响检测效果。 ¾ 染色后宜尽快检测，时间过长可能会导致凋亡或坏死细胞的数量增加。 ¾ 如果细胞收集过程中使用了胰酶，需注意设法去除残留的胰酶。残留的胰酶会消化并降解Annexin V-FITC，最终导致染
细胞凋亡试剂盒使用说明书 - 专业提供基因,重组蛋白,抗体
细胞凋亡试剂盒使用说明书目录号：CSB-AP11921h本试剂盒仅供研究使用概述细胞凋亡是细胞的基本特征之一，在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定等方面都起到十分重要的作用。
在正常细胞中磷脂酰丝氨酸（PS）分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。
此磷脂酰丝氨酸可与Annexin V, 一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白以高度亲和力相结合。
凋亡后期死亡的细胞与其它因素死亡的细胞，虽都可与A nnexin V结合，但死亡的细胞其细胞膜通透，也可被碘化丙啶（Propidium Iodide, PI），一种核酸染料染成红色。
如将Annexin V标以荧光素（RPE、FITC等)作为荧光探针，结合PI, 利用荧光显微镜或流式细胞仪检测，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。
试剂盒组成及试剂配制1.Annexin V-FITC：保存在Tris-HCl (20mM), NaCl(50mM) 缓冲液中，含1mg/ml BSA和0.09% NaN3。
2.Binding Buffer：Hepes(10 mM) /NaOH (pH 7.4), NaCl (140 mM),CaCl2(2.5 mM). 经0.2μm孔径过滤器除菌。
2–8℃保存。
3.Propidium Iodida(PI)：50 ug/ml 溶于PBS (pH7.4)中。
操作步骤实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。
1.悬浮细胞离心（350g, 3 min）收集；贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化收集（胰酶消化时间不易过长，以防引起假阳性）；2.用PBS洗涤细胞二次（350g, 3 min），计数细胞，每样0.1ml 含1~5×105细胞；3.用400μL Binding Buffer悬浮细胞；4.加入5μL Annexin V-FITC, 混匀，加入5 μL Propidium Iodide，混匀；5.室温避光反应10 min；6.荧光显微镜下观察或用流式细胞仪检测。
Annexin V 凋亡检测试剂盒说明书_PF032
Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit目录货号PF032包装包装：：1 试剂盒组分组分：：100次检测形式形式：：流式细胞仪或荧光显微镜检测方法检测方法：：荧光测定种属特异性种属特异性：：可适用于许多种属储存储存：：Annexin V-FITC 试剂盒组分用干冰运输，4°C 储存。
为了防止由于沾在管盖上造成的试剂损失，移除管盖前需要轻轻旋转使沾在管盖上的液体落入管内。
请参考注意事项和操作建议。
适用范围适用范围：：Calbiochem® Annexin V-FITC Apoptosis Detection 试剂盒是一种非同位素检测方法，可以检测伴随着细胞死亡发生的细胞膜的变化。
检测手段包括流式细胞仪或荧光显微镜。
背景背景：：凋亡是细胞死亡的一种基本形式，它在胚胎发育，组织分化和一些疾病发生过程中起着重要的调控作用。
在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS ）位于细胞膜内侧，一旦发生细胞凋亡，可以从细胞膜的内侧迅速翻转到细胞膜外侧，使得PS 暴露在细胞膜表面。
在体内，巨噬细胞可以识别翻转到细胞膜表面的PS 从而将这些程序性死亡的细胞清除，因此凋亡过程中并不伴随局部的炎症反应，而在细胞坏死的过程中则常常伴随着炎症反应。
在体外可以用PS 与抗凝血剂annexin V 的相互作用检测外翻的PS 。
在Ca2+存在的情况下，annexin V 与PS 有很高的亲和力，可以与之迅速结合。
PS 外翻发生在细胞核破裂，DNA 片段化以及凋亡相关蛋白出现之前，这使得annexin V 与PS 的结合成为凋亡早期的一种重要检测标志事件。
检测原理检测原理：：在该方法中，基于流式细胞仪和荧光显微镜，FITC 标记的annexin V 可以用来检测细胞凋亡。
由于细胞坏死的过程中也会发生细胞膜通透性增强，坏死的细胞同样也会结合annexin V-FITC 。
因此，propidium iodide （PI ）被用来区分存活的早期细胞和坏死或晚期凋亡细胞。
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For Research Use Only 碧波Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒
Cat Number：
Specification：
Store at: 4℃for one year
Expire date：
MADE BY BIOBOX
一、产品简介
Annexin是一类广泛分布于真核细胞细胞浆内钙离子依赖的磷酯结合蛋白，参与细胞内的信号转导。
Annexin V选择性结合磷酯酰丝氨酸(phosphatidylserine，简称PS)。
磷酯酰丝氨酸主要分布在细胞膜内侧，即与细胞浆相邻的一侧。
在细胞发生凋亡的早期，不同类型的细胞都会把磷酯酰丝氨酸外翻到细胞表面，即细胞膜外侧。
磷酯酰丝氨酸暴露到细胞表面后会促进凝血和炎症反应。
而Annexin V和外翻到细胞表面的磷酯酰丝氨酸结合后可以阻断磷酯酰丝氨酸的促凝血和促炎症反应活性。
因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。
用带有绿色荧光的荧光探针FITC标记的Annexin V，即Annexin V-FITC，就可以用流式细胞仪或荧光显微镜非常简单而直接地检测到磷酯酰丝氨酸的外翻这一细胞凋亡的重要特征。
Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit)是用FITC标记的重组人Annexin V来检测细胞凋亡时出现在细胞膜表面的磷酯酰丝氨酸的一种细胞凋亡检测试剂盒。
可以使用流式细胞仪、荧光显微镜或其它荧光检测设备进行检测。
本试剂盒还提供了碘化丙啶染色液，碘化丙啶可以染色坏死细胞或凋亡晚期丧失细胞膜完整性的细胞，呈现红色荧光。
对于坏死细胞，由于细胞膜的完整性已经丧失，Annexin V-FITC可以进入到细胞浆内，与位于细胞膜内侧的磷酯酰丝氨酸结合，从而也使坏死细胞呈现绿色荧光。
因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。
二、试剂盒组份
组份Cat:BA1110
10 assays Cat:BA1120
20 assays
Cat:BA1150
50 assays
Cat:BA11100
100 assays
储存条件
Annexin V-FITC 50μL 100μL 250μL 500μL 4℃避光结合液 5.0 mL 10 mL 25 mL 50 mL 4℃碘化丙啶（PI）50μL 100μL 250μL 500μL 4℃避光
三、试剂盒以外自备仪器和试剂
流式细胞仪或荧光显微镜、低速离心机、移液器
1.5m L离心管、载玻片、盖玻片、PBS、不含EDTA的胰酶消化液
四、保存条件：
4℃保存，Annexin V-FITC和碘化丙啶染色液需避光保存，一年有效。
为长期保存，可以把Annexin V-FITC和碘化丙啶染色液适当分装后-20℃保存，Annexin V-FITC结合液可以直接-20℃保存。
五、注意事项：
1、如果有细菌或真菌污染，会严重影响检测效果。
2、染色后宜尽快检测，时间过长可能会导致凋亡或坏死细胞的数量增加。
3、荧光物质均易发生淬灭，在进行荧光观察时，尽量缩短观察时间，同时在操作和存放过程中也尽量注意避光
保存。
4、需自备PBS。
5、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
6、本试剂盒适用于检测活细胞，流式细胞仪检测时，细胞数量不以应低于1×105，，不适用于检测组织样本。
7、因检测细胞的类型、凋亡诱导剂种类、使用的检测仪器不同，因而流式检测的荧光补偿也不同，因此建议每
次检测均需使用未经凋亡诱导处理的细胞作为对照，进行荧光补偿的调节。
8、用流式细胞仪检测，激发波长Ex=488 nm; 发射波长Em=530 nm。
Annexin V-FITC的绿色荧光通过FITC通
道（FL1）检测；PI红色荧光通过PI通道（FL2或FL3）检测，建议使用FL3。
荧光补偿调节：使用未经凋亡诱导处理的正常细胞，作为对照进行荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置。
六、操作规程
1、对于悬浮细胞：
A、在进行完细胞凋亡刺激后，1000g (约1000-2000rpm) 离心5分钟，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞
并计数。
（注意：PBS重悬不能省略，PBS重悬的过程同时也起到了洗涤细胞的作用，可以保证后续Annexin V-FITC的结合。
）
B、取1~5×105重悬的细胞，1000g离心5分钟，弃上清，加入500µl 结合液轻轻重悬细胞。
C、加入5µl Annexin V-FITC，轻轻混匀；再加入5 μL 碘化丙啶，轻轻混匀。
D、室温(20-25℃)避光孵育10分钟。
可以使用铝箔进行避光。
E、随即进行流式细胞仪检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。
如果用于荧光显微镜下检测，滴一
滴上述染色后的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞即可检测。
2、对于贴壁细胞：
A、把细胞培养液吸出至一合适离心管内，PBS洗涤贴壁细胞一次，用胰酶细胞消化液(最好不用含有EDTA)消
化细胞。
（注：胰酶消化时间不易过长，否则容易引起假阳性）
B、细胞消化下来后，加入步骤2A中收集的细胞培养液，稍混匀，转移到离心管内，1000g离心5分钟，弃上清，
收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数。
C、取1~5×105重悬的细胞，1000g离心5分钟，弃上清，加入500µl结合液轻轻重悬细胞。
D、加入5µl Annexin V-FITC，轻轻混匀；再加入5 μL 碘化丙啶，轻轻混匀。
E、室温(20-25℃)避光孵育10分钟。
可以使用铝箔进行避光。
F、随即进行流式细胞仪检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。
如果用于荧光显微镜下检测，滴一
滴上述染色后的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞即可检测。
3、对于贴壁细胞的原位荧光显微镜检测：
注：本方法的优点是可以原位观察细胞凋亡，缺点是部分凋亡由于不贴壁而检测不到。
A、(选做)如果条件许可，把细胞培养于24孔板、48孔板或96孔板内；或将细胞于盖玻片上生长，用适当的凋亡
诱导剂诱导细胞凋亡，并设立阴性对照组。
B、吸除细胞培养液，加入PBS洗涤两次；或将盖玻片用PBS洗涤两次。
C、在500μL 的结合液中加入5μL Annexin V-FITC，5 μL碘化丙啶，轻轻混匀。
D、将上述溶液滴加于培养板孔中，或滴加于盖玻片表面，使长有细胞的盖玻片表面均匀覆盖。
E、室温(20-25℃)避光孵育10分钟
F、随即在荧光显微镜下观察，Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。
七、应用举例
用凋亡诱导剂诱导K562细胞凋亡，在37o C，5%CO2培养箱培养4～6h后，参照说明书的操作方法进行检测，经流式细胞仪检测结果见下图：
阴性对照组诱导剂处理组。