第25章 临床酶法分析的原理与方法
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
公式25-5
第14页
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
公式25-5就是速率法测定代谢物浓度的原理，其 前提条件是测定酶促反应的初速度。随着酶促反 应的进行，[S]越来越小，v也越来越小。 平衡法与速率法这两种方法是相互联系的，平衡法 在开始的一段时间内有可能遵循一级反应规律。相 反，速率法只要给予足够的时间也会趋于平衡。对 于平衡法来说关键是确定达到平衡所需的时间。对 于速率法来说关键是如何使酶促反应成为一级反应。
主要内容
酶法分析方法的理论基础
酶反应前后光吸收变化测定的与原理与方法
脱氢酶指示系统测定的原理与方法 过氧化物酶指示系统测定的原理与方法 酶循环测定的原理与方法 酶激活与酶抑制测定的原理与方法
第 3页
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
第一节
酶法分析方法的理论基础
酶法分析是以酶为试剂测定酶促反应的底物、 辅酶、辅基、激活剂、抑制剂以及酶偶联法测 定酶活性等的一类方法。 临床酶法分析是指用酶法分析的方法来测定人 体內的代谢物或代谢产物的技术。
第 8页
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
将米氏方程改写为：
d [S] Vmax [S] = dt Km+ [S]
公式25-1
v=
-d[S] (Km + [S]) = dt V max[S]
-d[S] (
Km 1 + ) = dt V max[S] V max
积分得：
[S0 ] [S0 ] - [St ] Km t = 2.303 lg + [ ] V max St V max
O2
BOD
H2O
胆红素
胆绿素
第18页
第三节 脱氢酶指示系统测定的原理和方法
• 脱氢酶可以催化底物脱氢，脱氢酶催化 的反应如下：
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
• 以脱氢酶为指示酶系统测定的是氧化型辅酶Ⅰ （NAD+）或氧化型辅酶Ⅱ（NADP+）在340 nm处的 吸光度增加来计算待测物的浓度，也可利用脱氢酶的 逆反应，将还原型NAD(P)H变为氧化型NAD(P)+，测 定340 nm处吸光度的下降来计算待测物的浓度。
速率法测定的是酶促反应的速度（通常是指初速度）， 其依据是，当底物的消耗量较小时（<5%），酶促反 应呈一级反应，此时的酶促反应速度（v）与代测物的 浓度成正比例。 Vmax [S] v= 根据米氏方程： Km+ [S] ①当[S] <<Km，则[S]+ Km ≈ Km，②当酶量固定不变 时，酶促反应的最大速度Vmax也不变，此时, 酶促反 应符合一级反应。
• 代谢物在酶催化反应中如能够生成H2O2，则POD可催化 H2O2与4-氨基安替比林（4-AAP）和酚一起形成红色的 醌类化合物，该化合物最大吸收峰为500 nm，该反应即 被称为Trinder反应，
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
一、一步反应测定法
• 待测物经过一步酶促氧化反应即能有为H2O2生成， 这样的反应称之为一步反应。例如：血清葡萄糖 氧化酶法测定。
酶激活与酶 抑制测定法
酶法分析
脱氢酶指示 系统测定法 过氧化物 酶指示系 统测定法
酶循环 测定法
第 7页
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
一、平衡法测定的理论基础
平衡法是指标本中待测物的量有限，经过酶促 反应逐渐被消耗，当剩余的底物量很小 （<1%～5%）时，指示反应信号逐渐达到稳定， 即通常所说的终点，所以又称为终点法。
图25-1 产物循环-氧化酶-脱氢酶系统
第36页
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
二、底物循环脱氢酶辅酶系统
• 底物循环-脱氢酶-辅酶系统中底物（或衍生物） 及其氧化产物进入循环，反应循环中有一种脱 氢酶和两种辅酶：辅酶硫代氧化型辅酶Ⅰ （thio-NAD+）和还原性辅酶Ⅰ（NADH）。
第33页
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
• 酶循环测定法利用底物和辅酶之间的循环反复 反应，只需要有少量的底物和辅酶，就可使待 测物的酶促反应产物不断扩增，扩增量决定于 循环次数。反应产物增加，提高了检测灵敏度， 减少了共存物质的干扰，达到高灵敏度和高特 异性的要求。
第34页
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
第15页
第二节 酶反应前后光吸收变化测定的原理和方法
有些待测物本身在一定波长下就具有特异性的光 吸收，但经过酶促反应以后生成的产物在相同的 波长处则无特异性的光吸收。通过直接测定待测 物或产物本身信号的改变即可进行定量，这种分 析方法即是酶反应前后光吸收变化测定法。
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
一、产物循环氧化酶脱氢酶系统
• 产物循环-氧化酶-脱氢酶系统使用两种酶，即一种 氧化酶作用后使底物发生氧化，氧化产物经一种脱 氢酶催化其回到还原状态，促使底物和底物的氧化 产物进入循环。在底物和产物循环的同时伴有H2O2 的生成和NADH向NAD+的转变 （图25-1） 。
第35页
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
第二十五章 临床酶法分析的原理与方法
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
教学目标与要求
` 掌握
临床酶法分析的概念，脱氢酶和过氧化 物酶指示系统的应用原理。 临床酶法分析的理论基础，酶循环法以 及其它酶法分析的设计原理。 临床酶法分析的发展前景。
熟悉 `
` 了解
第 2页
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
如尿酸在293 nm处有特异性的光吸收，但经过尿 酸氧化酶（UAO）催化生成的尿囊素则在293 nm 处无特异性光吸收，可以通过尿酸在293 nm处的 吸光度下降来计算尿酸的浓度。
第17页
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
胆红素在450 nm处有特异性的光吸收，经胆红 素氧化酶（BOD）作用生成胆绿素，导致胆红 素在450 nm处的吸光度下降，以此来测定胆红 素的浓度。
测定管 [S0 ] 标准管 [S0 ] lg =lg [ ] 测定管 [St ] 标准管 St
标准管 [S0 ] 测定管 [S0 ] = 标准管 [St ] 测定管 [St ]
第11页
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
标准管[S0 ]
标准管[St ] 标准管[S0 - St ] = = 测定管[S0 ] 测定管[St ] 测定管[S0 - St ]
第23页
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
• 血清尿素测定：
尿素酶 尿素 + H 2O ¾¾ ¾ ¾® 2NH3 + CO 2
谷氨酸脱氢酶 NH 3 + a - 酮戊二酸 + NADH + H + ¾¾ ¾ ¾ ¾ ¾¾® 谷氨酸 + H 2O + NAD+
• 测定340 nm吸光度下降的速度与尿素的含量成正 比，可以用速率法测定，如果带标准品一起测定 也可以用平衡法测定。
第13页
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
Vmax [S] v= = K [S] Km
如同时检测标准管，则有：
标准管v 标准管[S] = 定管 v 测 测 定管[S]
公式25-4
标准管的[S0]与测定管的[S0]分别表示为Cs和Cu，速 度用△ A/min来表示。上式改写为：
标准管ΔΑ / min Cs = 定管 ΔΑ / min Cu 测
第27页
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
二、两步反应测定法
• 待测物经过两步酶促反应才能被氧化为H2O2，这 样的反应称之为两步反应。例如：血清总胆固醇 氧化酶法测定。
第28页
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
三、多步反应测定法
• 待测物需要三步或三步以上的酶促反应才能被氧化为 H2O2，这样的反应称之为多步反应。例如：血清三 酰甘油的测定。
第32页
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
第五节 酶循环测定的原理与方法
• 酶循环测定法是酶法分析的发展和延伸。酶循环 测定法的关键技术是利用酶促反应中的酶在反应 前后质和量都不改变的特性，只要有足够的底物， 即可一直催化反应下去，底物靠其生成的非信号 产物循环提供，使可测信号越来越大，提高了检 测的灵敏度。
第 4页
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
wenku.baidu.com
酶法分析的优点 优
1
点
由于酶作用的特异性高，成份复杂的血清等体液 样品不需进行预处理就能测定，简化了实验程序
由于酶具有高催化效率，加快了反应速度，提髙 了工作效率 试剂酶的本质大多是蛋白质，酶促反应的条件温 和，没有毒性，避免了化学品对人体的危害和对 环境的污染 制成试剂盒即可以手工操作，又可以自动化分析
第29页
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
表25-1 常用的Trinder反应生色基团
化学名 酚 2,4-二氯酚 英文缩写 P 2,4-DCP 最大吸收峰（nm） 500 510 555 555
N- 乙 基 -N- （ 3- 甲 EMAE 苯-N-乙酰乙二胺 N- 乙 基 -N- （ 2- 羟 TOOS 基 -3- 丙 磺 酰 ） 间 甲苯胺 N- 乙 基 -N- （ 3- 丙 ESPDMA 磺酰）-3,5二甲氧 基苯胺
第24页
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
优点
缺点
试剂成本低，反应 速率快，灵敏度高
共同的问题就是容易 受到内源性脱氢酶的 干扰，此外，样本和 试剂本身也会给测定 带来影响
第25页
第四节 过氧化物酶指示系统测定的原理与方法
• 当待测物可以通过氧化酶的催化生成H2O2，然后用过氧 化物酶（POD）指示终点，此即为过氧化物酶指示系统 测定法。
enzyme NAD(P) ¬¾¾¾® NAD(P)H
+
第20页
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
一、单酶反应测定法
• 有一些待测物测定的时候不需要偶联另一个酶 促反应，经一步反应后就可以完成氧化型辅酶 和还原性辅酶之间的转换，称为单酶反应法。 • 由于该类反应通过辅酶在氧化型与还原型之间 的转换进行，所以很容易用紫外吸收分光光度 法测定340nm处吸光度的增减来进行定量。例 如乳酸、丙酮酸的测定等。
2
3
4
第 5页
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
酶法分析根据检测类型可分为平衡法（终点法） 和速率法（动力学法）。 根据方法设计的原理不同分为：酶反应前后光吸 收变化测定法、脱氢酶指示系统测定法、过氧化 物酶指示系统测定法、酶循环测定法和酶激活与 酶抑制测定法等。
第 6页
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法 酶反应前 后光吸收 变化测定 法
585
第30页
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
1
催化该反应的POD对底物专一性差，标本中其 它过氧化物也可一起被转化，使测定结果偏高。
缺点
2
反应过程中可受到数十种还原性物质的干扰。
第31页
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
• 常采用双试剂剂型排除干扰。 • 应用抗坏血酸氧化酶和胆红素氧化酶加入试剂 Ⅰ中，可排除样本中维生素C和胆红素干扰。
公式25-2
标准管的 [S0－St] 与待测管的 [S0－St] 分别代表消 耗量，也代表转化为产物的量，可以用产物的吸光 度来表示（As和Au）。标准管的[S0]与测定管的[S0] 分别表示为Cs和Cu。
Cs As = Cu Au
公式25-3
第12页
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
二、速率法测定的理论基础
第 9页
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
当反应达到平衡，假设 ，即 [S0]－[St] ≈ [S0]，则 可简化为：
[S0 ] Km t = 4.606 + V max V max
说明达到平衡所需的时间与Km、Vmax和[S0]有关， Km越小、Vmax越大、[S0]越小则达到平衡所需的时 间越短。
第21页
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
二、酶偶联测定法
• 若酶促反应的底物或产物没有可直接检测的 成分，则应将反应生成的某一产物偶联到另 一个酶促反应中，从而达到检测目的，此类 方法称酶偶联法。
第22页
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
• 例如血清葡萄糖己糖激酶法（HK法）测定，在 测定中，HK是辅助酶，G-6-PD为指示酶，指示 酶反应将NAD+转化为NADH，340 nm吸光度增 加的速度即与葡萄糖的含量成正比。反应式如下：
第10页
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
若 [S0] <<Km，公式25-1式简化为：
d [S] Km = dt V max [S]
[S0] Km 积分得： t = 2.303 lg V max [St ]
如同时检测标准管，则不管反应进行至何种程度， 只要标准管与测定管的反应时间（t）一致，则有：
第14页
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
公式25-5就是速率法测定代谢物浓度的原理，其 前提条件是测定酶促反应的初速度。随着酶促反 应的进行，[S]越来越小，v也越来越小。 平衡法与速率法这两种方法是相互联系的，平衡法 在开始的一段时间内有可能遵循一级反应规律。相 反，速率法只要给予足够的时间也会趋于平衡。对 于平衡法来说关键是确定达到平衡所需的时间。对 于速率法来说关键是如何使酶促反应成为一级反应。
主要内容
酶法分析方法的理论基础
酶反应前后光吸收变化测定的与原理与方法
脱氢酶指示系统测定的原理与方法 过氧化物酶指示系统测定的原理与方法 酶循环测定的原理与方法 酶激活与酶抑制测定的原理与方法
第 3页
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
第一节
酶法分析方法的理论基础
酶法分析是以酶为试剂测定酶促反应的底物、 辅酶、辅基、激活剂、抑制剂以及酶偶联法测 定酶活性等的一类方法。 临床酶法分析是指用酶法分析的方法来测定人 体內的代谢物或代谢产物的技术。
第 8页
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
将米氏方程改写为：
d [S] Vmax [S] = dt Km+ [S]
公式25-1
v=
-d[S] (Km + [S]) = dt V max[S]
-d[S] (
Km 1 + ) = dt V max[S] V max
积分得：
[S0 ] [S0 ] - [St ] Km t = 2.303 lg + [ ] V max St V max
O2
BOD
H2O
胆红素
胆绿素
第18页
第三节 脱氢酶指示系统测定的原理和方法
• 脱氢酶可以催化底物脱氢，脱氢酶催化 的反应如下：
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
• 以脱氢酶为指示酶系统测定的是氧化型辅酶Ⅰ （NAD+）或氧化型辅酶Ⅱ（NADP+）在340 nm处的 吸光度增加来计算待测物的浓度，也可利用脱氢酶的 逆反应，将还原型NAD(P)H变为氧化型NAD(P)+，测 定340 nm处吸光度的下降来计算待测物的浓度。
速率法测定的是酶促反应的速度（通常是指初速度）， 其依据是，当底物的消耗量较小时（<5%），酶促反 应呈一级反应，此时的酶促反应速度（v）与代测物的 浓度成正比例。 Vmax [S] v= 根据米氏方程： Km+ [S] ①当[S] <<Km，则[S]+ Km ≈ Km，②当酶量固定不变 时，酶促反应的最大速度Vmax也不变，此时, 酶促反 应符合一级反应。
• 代谢物在酶催化反应中如能够生成H2O2，则POD可催化 H2O2与4-氨基安替比林（4-AAP）和酚一起形成红色的 醌类化合物，该化合物最大吸收峰为500 nm，该反应即 被称为Trinder反应，
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
一、一步反应测定法
• 待测物经过一步酶促氧化反应即能有为H2O2生成， 这样的反应称之为一步反应。例如：血清葡萄糖 氧化酶法测定。
酶激活与酶 抑制测定法
酶法分析
脱氢酶指示 系统测定法 过氧化物 酶指示系 统测定法
酶循环 测定法
第 7页
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
一、平衡法测定的理论基础
平衡法是指标本中待测物的量有限，经过酶促 反应逐渐被消耗，当剩余的底物量很小 （<1%～5%）时，指示反应信号逐渐达到稳定， 即通常所说的终点，所以又称为终点法。
图25-1 产物循环-氧化酶-脱氢酶系统
第36页
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
二、底物循环脱氢酶辅酶系统
• 底物循环-脱氢酶-辅酶系统中底物（或衍生物） 及其氧化产物进入循环，反应循环中有一种脱 氢酶和两种辅酶：辅酶硫代氧化型辅酶Ⅰ （thio-NAD+）和还原性辅酶Ⅰ（NADH）。
第33页
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
• 酶循环测定法利用底物和辅酶之间的循环反复 反应，只需要有少量的底物和辅酶，就可使待 测物的酶促反应产物不断扩增，扩增量决定于 循环次数。反应产物增加，提高了检测灵敏度， 减少了共存物质的干扰，达到高灵敏度和高特 异性的要求。
第34页
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
第15页
第二节 酶反应前后光吸收变化测定的原理和方法
有些待测物本身在一定波长下就具有特异性的光 吸收，但经过酶促反应以后生成的产物在相同的 波长处则无特异性的光吸收。通过直接测定待测 物或产物本身信号的改变即可进行定量，这种分 析方法即是酶反应前后光吸收变化测定法。
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
一、产物循环氧化酶脱氢酶系统
• 产物循环-氧化酶-脱氢酶系统使用两种酶，即一种 氧化酶作用后使底物发生氧化，氧化产物经一种脱 氢酶催化其回到还原状态，促使底物和底物的氧化 产物进入循环。在底物和产物循环的同时伴有H2O2 的生成和NADH向NAD+的转变 （图25-1） 。
第35页
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
第二十五章 临床酶法分析的原理与方法
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
教学目标与要求
` 掌握
临床酶法分析的概念，脱氢酶和过氧化 物酶指示系统的应用原理。 临床酶法分析的理论基础，酶循环法以 及其它酶法分析的设计原理。 临床酶法分析的发展前景。
熟悉 `
` 了解
第 2页
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
如尿酸在293 nm处有特异性的光吸收，但经过尿 酸氧化酶（UAO）催化生成的尿囊素则在293 nm 处无特异性光吸收，可以通过尿酸在293 nm处的 吸光度下降来计算尿酸的浓度。
第17页
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
胆红素在450 nm处有特异性的光吸收，经胆红 素氧化酶（BOD）作用生成胆绿素，导致胆红 素在450 nm处的吸光度下降，以此来测定胆红 素的浓度。
测定管 [S0 ] 标准管 [S0 ] lg =lg [ ] 测定管 [St ] 标准管 St
标准管 [S0 ] 测定管 [S0 ] = 标准管 [St ] 测定管 [St ]
第11页
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
标准管[S0 ]
标准管[St ] 标准管[S0 - St ] = = 测定管[S0 ] 测定管[St ] 测定管[S0 - St ]
第23页
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
• 血清尿素测定：
尿素酶 尿素 + H 2O ¾¾ ¾ ¾® 2NH3 + CO 2
谷氨酸脱氢酶 NH 3 + a - 酮戊二酸 + NADH + H + ¾¾ ¾ ¾ ¾ ¾¾® 谷氨酸 + H 2O + NAD+
• 测定340 nm吸光度下降的速度与尿素的含量成正 比，可以用速率法测定，如果带标准品一起测定 也可以用平衡法测定。
第13页
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
Vmax [S] v= = K [S] Km
如同时检测标准管，则有：
标准管v 标准管[S] = 定管 v 测 测 定管[S]
公式25-4
标准管的[S0]与测定管的[S0]分别表示为Cs和Cu，速 度用△ A/min来表示。上式改写为：
标准管ΔΑ / min Cs = 定管 ΔΑ / min Cu 测
第27页
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
二、两步反应测定法
• 待测物经过两步酶促反应才能被氧化为H2O2，这 样的反应称之为两步反应。例如：血清总胆固醇 氧化酶法测定。
第28页
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
三、多步反应测定法
• 待测物需要三步或三步以上的酶促反应才能被氧化为 H2O2，这样的反应称之为多步反应。例如：血清三 酰甘油的测定。
第32页
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
第五节 酶循环测定的原理与方法
• 酶循环测定法是酶法分析的发展和延伸。酶循环 测定法的关键技术是利用酶促反应中的酶在反应 前后质和量都不改变的特性，只要有足够的底物， 即可一直催化反应下去，底物靠其生成的非信号 产物循环提供，使可测信号越来越大，提高了检 测的灵敏度。
第 4页
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
wenku.baidu.com
酶法分析的优点 优
1
点
由于酶作用的特异性高，成份复杂的血清等体液 样品不需进行预处理就能测定，简化了实验程序
由于酶具有高催化效率，加快了反应速度，提髙 了工作效率 试剂酶的本质大多是蛋白质，酶促反应的条件温 和，没有毒性，避免了化学品对人体的危害和对 环境的污染 制成试剂盒即可以手工操作，又可以自动化分析
第29页
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
表25-1 常用的Trinder反应生色基团
化学名 酚 2,4-二氯酚 英文缩写 P 2,4-DCP 最大吸收峰（nm） 500 510 555 555
N- 乙 基 -N- （ 3- 甲 EMAE 苯-N-乙酰乙二胺 N- 乙 基 -N- （ 2- 羟 TOOS 基 -3- 丙 磺 酰 ） 间 甲苯胺 N- 乙 基 -N- （ 3- 丙 ESPDMA 磺酰）-3,5二甲氧 基苯胺
第24页
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
优点
缺点
试剂成本低，反应 速率快，灵敏度高
共同的问题就是容易 受到内源性脱氢酶的 干扰，此外，样本和 试剂本身也会给测定 带来影响
第25页
第四节 过氧化物酶指示系统测定的原理与方法
• 当待测物可以通过氧化酶的催化生成H2O2，然后用过氧 化物酶（POD）指示终点，此即为过氧化物酶指示系统 测定法。
enzyme NAD(P) ¬¾¾¾® NAD(P)H
+
第20页
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
一、单酶反应测定法
• 有一些待测物测定的时候不需要偶联另一个酶 促反应，经一步反应后就可以完成氧化型辅酶 和还原性辅酶之间的转换，称为单酶反应法。 • 由于该类反应通过辅酶在氧化型与还原型之间 的转换进行，所以很容易用紫外吸收分光光度 法测定340nm处吸光度的增减来进行定量。例 如乳酸、丙酮酸的测定等。
2
3
4
第 5页
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
酶法分析根据检测类型可分为平衡法（终点法） 和速率法（动力学法）。 根据方法设计的原理不同分为：酶反应前后光吸 收变化测定法、脱氢酶指示系统测定法、过氧化 物酶指示系统测定法、酶循环测定法和酶激活与 酶抑制测定法等。
第 6页
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法 酶反应前 后光吸收 变化测定 法
585
第30页
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
1
催化该反应的POD对底物专一性差，标本中其 它过氧化物也可一起被转化，使测定结果偏高。
缺点
2
反应过程中可受到数十种还原性物质的干扰。
第31页
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
• 常采用双试剂剂型排除干扰。 • 应用抗坏血酸氧化酶和胆红素氧化酶加入试剂 Ⅰ中，可排除样本中维生素C和胆红素干扰。
公式25-2
标准管的 [S0－St] 与待测管的 [S0－St] 分别代表消 耗量，也代表转化为产物的量，可以用产物的吸光 度来表示（As和Au）。标准管的[S0]与测定管的[S0] 分别表示为Cs和Cu。
Cs As = Cu Au
公式25-3
第12页
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
二、速率法测定的理论基础
第 9页
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
当反应达到平衡，假设 ，即 [S0]－[St] ≈ [S0]，则 可简化为：
[S0 ] Km t = 4.606 + V max V max
说明达到平衡所需的时间与Km、Vmax和[S0]有关， Km越小、Vmax越大、[S0]越小则达到平衡所需的时 间越短。
第21页
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
二、酶偶联测定法
• 若酶促反应的底物或产物没有可直接检测的 成分，则应将反应生成的某一产物偶联到另 一个酶促反应中，从而达到检测目的，此类 方法称酶偶联法。
第22页
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
• 例如血清葡萄糖己糖激酶法（HK法）测定，在 测定中，HK是辅助酶，G-6-PD为指示酶，指示 酶反应将NAD+转化为NADH，340 nm吸光度增 加的速度即与葡萄糖的含量成正比。反应式如下：
第10页
第二十五章 临床酶学分析的原理和方法
若 [S0] <<Km，公式25-1式简化为：
d [S] Km = dt V max [S]
[S0] Km 积分得： t = 2.303 lg V max [St ]
如同时检测标准管，则不管反应进行至何种程度， 只要标准管与测定管的反应时间（t）一致，则有：