病毒性传染病实验室诊断技术进展
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
10
分子诊断的功能及扩展
病毒载量与治疗
例3. HIV病毒载量与传播
15127人 30个月
流行病学调查415对伴侣 HIV阳转22%（90/415） 51人RNA<1500copies/mL 全阴
11
分子诊断的功能及扩展
病毒载量与治疗
例4. 血浆EBV载量与鼻咽癌复发
15个二年持续缓解： 0 copy/mL
10个复发：
32250 copies/mL
17个随访：临床恶化前半年病毒载量升高
12
耐药病原的分子诊断
WHO：人类死亡1/3是长期用药的毒副作用 HBV的YMDD变异 HIV耐药
13
血制品筛查
300余万的血清阴性样品，分子生物学复测：
HBV：47 HCV：10 HIV-1：2
-2001年剑桥资料
第1个PCR循环完成后
21
30次循环后靶序列扩增的数量
1 cycle = 2 Amplicon
2 cycle = 4 Amplicon
3 cycle = 8 Amplicon
4 cycle = 16 Amplicon
5 cycle = 32 Amplicon
6 cycle = 64 Amplicon
靶序列
Mg2+
dCTP dGTP dUTP dATP
Primer
Taq DNA聚合酶
加热变性95 °C
AmpErase
靶序列引物退火55 °C 引物延伸72 °C
17
PCR 循环 第一步 – 加热变性
靶序列
靶序列
从外周血白细胞或绒毛、羊水细胞提取的DNA约1ug，在含有 适当缓冲液、引物、dNTPs（dATP、dCTP、dGTP及dTTP）等 的反应混合物中，在94℃下热变性1-4分钟，使之解为单链。
7 cycle = 128 Amplicon
No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target
1
2
2
4
3
8
4
16
5
32
6
64
20
1,048,576
30
1,073,741,824
22
荧光PCR原理 – TaqManTM技术
λ
R 5’
Q 3’
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收， 所以检测不到荧光，此种现象称为荧光共振能量转移。
18
PCR 循环 第二步–引物与靶序列退火
引物与解为单链的DNA上互补序列杂交在一起，称之为退火。55℃左右19
PCR 循环 第三步 - 引物延伸
在DNA聚合酶催化作用下，以dNTPs为原料（底物），从引物的3’端A开 始, 沿着5’→3’的方向，合成每条模板的互补链，此称引物延伸。72℃20左 右
4
分子诊断技术方法简介
2、多标靶同时检测
多重PCR 毛细管电泳 以测序分析为基础的检测技术
5
分子诊断技术方法简介
3、核酸杂交
DNA荧光原位杂交（FISH） 将标记的探针直接原位杂交到染色体或DNA纤维切片上，再 用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来 检测DNA序列在染色体或DNA纤维上的定位。
23
荧光PCR原理 – TaqManTM技术
Q 3’ 5’
Q 3’ 5’
Q 3’ 5’
Taq
3’ 5’
Taq
3’ 5’
R 5’
R
R
Taq
R
Taq
R
l
R
3’
Extension Step
3’ 1. Strand Displacement
5’
2. Cleavage
3’
5’
3. Polymerization
线性探针分析法（LiPA） 杂交保护分析法（HPA）
4、质谱
利用色、质谱结合PCR技术
6
分子诊断的功能及扩展
病原的诊断和鉴别诊断 病原分型 病毒载量监测---个体化治疗的依据 疗效及预后标志 其他：病原感染中发生、发展各阶段
7
分子诊断的功能及扩展
疾病分型及意义 例如：HPV （30/100）
分子生物学诊断技术
3
分子生物学诊断技术方法简介
1、主体技术
循环扩增
恒温
具体方法举例
PCR （聚合酶链反应） Real-time PCR, RT-PCR，巢式PCR，复合PCR PCR-ELISA，微孔板杂交，荧光探针标记法
LCR（连接酶链反应） NASBA（依赖核酸序列的扩增，主要用于RNA） SDA（链置换扩增术） CPT（环状探针技术 ） bDNA（枝链核酸信号放大系统 ） 杂交捕获 （如：检测HPV-DNA的试剂盒）
3’
Complete
5’ 4. Detection
24
3’
定量PCR与定性PCR测定的区别
定量PCR测定的是扩 增的指数扩增期;
定性PCR测定的是扩 增的终点（平台期）
25
市场上常见的实时荧光PCR仪
罗氏Lightcycler
MJ opticon2
伯乐icycler
ABI7000
分子生物学诊断技术进展
张正 北京大学人民医院
1
主要内容：
分子生物学诊断技术在病原学检测中的应用
简单介绍实验原理
以PCR、荧光实时定量PCR、NASBA来自百度文库例
分子诊断技术在以下病原研究的应用进展
乙型肝炎 丙型肝炎 结核分枝杆菌
2
病原学检测常用的实验室技术
细胞培养与鉴定（“金标准”）、动物实验 血清学、免疫学诊断技术 电镜技术
HIV-1血清阴性而RNA阳性 0.2-6.6%
-Am. J. Chin Athol. 2000
14
分子生物学技术在其它领域的应用
在基础研究领域中的应用； 遗传病的基因诊断和产前基因诊断：
如血友病、地中海贫血等 肿瘤基因和肿瘤标志物表达(mRNA)的检测； 骨髓移植、器官移植供体配型选择； 法医学、动植物学、古人类学、古生物学；
高危---16，18，31，45 低危--- 6，11
8
分子诊断的功能及扩展
病毒载量与治疗
例1.
---北京地坛医院谢尧提供
9
分子诊断的功能及扩展
病毒载量与治疗
例2. HBV---干扰素 HBV<100pg/mL 11/30 阴转 HBV>100pg/mL 1/30 阴转 (HBeAg HBeAb)
与疾病相关的各种蛋白（细胞因子、酶、激 素、受体）的基因表达的检测；
药物基因组学、耐药基因的检测，等等
15
简单介绍实验原理
PCR
(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)
荧光实时定量PCR （real time PCR） NASBA （依赖核酸序列的扩增）
16
PCR原理:实质就是体外基因复制技术
分子诊断的功能及扩展
病毒载量与治疗
例3. HIV病毒载量与传播
15127人 30个月
流行病学调查415对伴侣 HIV阳转22%（90/415） 51人RNA<1500copies/mL 全阴
11
分子诊断的功能及扩展
病毒载量与治疗
例4. 血浆EBV载量与鼻咽癌复发
15个二年持续缓解： 0 copy/mL
10个复发：
32250 copies/mL
17个随访：临床恶化前半年病毒载量升高
12
耐药病原的分子诊断
WHO：人类死亡1/3是长期用药的毒副作用 HBV的YMDD变异 HIV耐药
13
血制品筛查
300余万的血清阴性样品，分子生物学复测：
HBV：47 HCV：10 HIV-1：2
-2001年剑桥资料
第1个PCR循环完成后
21
30次循环后靶序列扩增的数量
1 cycle = 2 Amplicon
2 cycle = 4 Amplicon
3 cycle = 8 Amplicon
4 cycle = 16 Amplicon
5 cycle = 32 Amplicon
6 cycle = 64 Amplicon
靶序列
Mg2+
dCTP dGTP dUTP dATP
Primer
Taq DNA聚合酶
加热变性95 °C
AmpErase
靶序列引物退火55 °C 引物延伸72 °C
17
PCR 循环 第一步 – 加热变性
靶序列
靶序列
从外周血白细胞或绒毛、羊水细胞提取的DNA约1ug，在含有 适当缓冲液、引物、dNTPs（dATP、dCTP、dGTP及dTTP）等 的反应混合物中，在94℃下热变性1-4分钟，使之解为单链。
7 cycle = 128 Amplicon
No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target
1
2
2
4
3
8
4
16
5
32
6
64
20
1,048,576
30
1,073,741,824
22
荧光PCR原理 – TaqManTM技术
λ
R 5’
Q 3’
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收， 所以检测不到荧光，此种现象称为荧光共振能量转移。
18
PCR 循环 第二步–引物与靶序列退火
引物与解为单链的DNA上互补序列杂交在一起，称之为退火。55℃左右19
PCR 循环 第三步 - 引物延伸
在DNA聚合酶催化作用下，以dNTPs为原料（底物），从引物的3’端A开 始, 沿着5’→3’的方向，合成每条模板的互补链，此称引物延伸。72℃20左 右
4
分子诊断技术方法简介
2、多标靶同时检测
多重PCR 毛细管电泳 以测序分析为基础的检测技术
5
分子诊断技术方法简介
3、核酸杂交
DNA荧光原位杂交（FISH） 将标记的探针直接原位杂交到染色体或DNA纤维切片上，再 用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来 检测DNA序列在染色体或DNA纤维上的定位。
23
荧光PCR原理 – TaqManTM技术
Q 3’ 5’
Q 3’ 5’
Q 3’ 5’
Taq
3’ 5’
Taq
3’ 5’
R 5’
R
R
Taq
R
Taq
R
l
R
3’
Extension Step
3’ 1. Strand Displacement
5’
2. Cleavage
3’
5’
3. Polymerization
线性探针分析法（LiPA） 杂交保护分析法（HPA）
4、质谱
利用色、质谱结合PCR技术
6
分子诊断的功能及扩展
病原的诊断和鉴别诊断 病原分型 病毒载量监测---个体化治疗的依据 疗效及预后标志 其他：病原感染中发生、发展各阶段
7
分子诊断的功能及扩展
疾病分型及意义 例如：HPV （30/100）
分子生物学诊断技术
3
分子生物学诊断技术方法简介
1、主体技术
循环扩增
恒温
具体方法举例
PCR （聚合酶链反应） Real-time PCR, RT-PCR，巢式PCR，复合PCR PCR-ELISA，微孔板杂交，荧光探针标记法
LCR（连接酶链反应） NASBA（依赖核酸序列的扩增，主要用于RNA） SDA（链置换扩增术） CPT（环状探针技术 ） bDNA（枝链核酸信号放大系统 ） 杂交捕获 （如：检测HPV-DNA的试剂盒）
3’
Complete
5’ 4. Detection
24
3’
定量PCR与定性PCR测定的区别
定量PCR测定的是扩 增的指数扩增期;
定性PCR测定的是扩 增的终点（平台期）
25
市场上常见的实时荧光PCR仪
罗氏Lightcycler
MJ opticon2
伯乐icycler
ABI7000
分子生物学诊断技术进展
张正 北京大学人民医院
1
主要内容：
分子生物学诊断技术在病原学检测中的应用
简单介绍实验原理
以PCR、荧光实时定量PCR、NASBA来自百度文库例
分子诊断技术在以下病原研究的应用进展
乙型肝炎 丙型肝炎 结核分枝杆菌
2
病原学检测常用的实验室技术
细胞培养与鉴定（“金标准”）、动物实验 血清学、免疫学诊断技术 电镜技术
HIV-1血清阴性而RNA阳性 0.2-6.6%
-Am. J. Chin Athol. 2000
14
分子生物学技术在其它领域的应用
在基础研究领域中的应用； 遗传病的基因诊断和产前基因诊断：
如血友病、地中海贫血等 肿瘤基因和肿瘤标志物表达(mRNA)的检测； 骨髓移植、器官移植供体配型选择； 法医学、动植物学、古人类学、古生物学；
高危---16，18，31，45 低危--- 6，11
8
分子诊断的功能及扩展
病毒载量与治疗
例1.
---北京地坛医院谢尧提供
9
分子诊断的功能及扩展
病毒载量与治疗
例2. HBV---干扰素 HBV<100pg/mL 11/30 阴转 HBV>100pg/mL 1/30 阴转 (HBeAg HBeAb)
与疾病相关的各种蛋白（细胞因子、酶、激 素、受体）的基因表达的检测；
药物基因组学、耐药基因的检测，等等
15
简单介绍实验原理
PCR
(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)
荧光实时定量PCR （real time PCR） NASBA （依赖核酸序列的扩增）
16
PCR原理:实质就是体外基因复制技术