新型生物黏附性材料巯基壳聚糖的合成与表征(1)

取新鲜猪小肠，用水冲洗除去内容物，置于同温ｐＨ为６．８的磷酸缓冲液中浸泡２ ｈ后备用．用 ５０２胶水将平片的一面固定于１ ｃｍ×２ ｃｍ的背面带挂钩的硬塑料薄片ｂ上备用．将小肠组织剪成小 段，两端用线固定于同上规格的硬塑料薄片ａ上．滴少许磷酸缓冲液于平片表面润湿２ ｍｉｎ后，与固定 于薄片ａ的小肠接触，并给予０．９８ Ｎ的压力，施压时间３０ ｓ，将薄片ａ的挂钩垂直固定，在薄片ｂ挂 钩上系一塑料袋，通过贮液袋以８ ｍＬ／ｍｉｎ的速度向袋中加水，直至平片与小肠分离，记录贮液袋、水 及薄片ｂ的质量，即得体外最大黏附力¨川． １．７ ＣＳ－ＮＡＣ偶合物细胞毒性测试
ＲＧＲ＝（试验组吸光值／对照组吸光值）×１００％
万方数据
高等学校化学学报
按标准评价巯基壳聚糖的细胞毒性．
２结果与讨论
２．１ ＣＳ－ＮＡＣ的合成与结构分析 ＣＳ—ＮＡＣ的合成是由水溶性缩合剂ＥＤＡＣ与ＨＯＢｔ诱导壳聚糖的伯氨基与ＮＡＣ的羧基发生酰胺化
反应制得的．结果表明，加入适量的ＨＯＢｔ可明显提高巯基含量，但过多的ＨＯＢｔ对巯基含量影响不 大．由表１可见，当ｎ（ｃｓ）：ｎ（ＮＡＣ）：ｎ（ＨＯＢｔ）：ｒ／，（ＥＤＡＣ）＝１：１：１：２时，巯基含量为１５５．８ Ｉｘｍｏｌ／ｇ； 而当凡（ＣＳ）：ｎ（ＮＡＣ）：ｎ（ＨＯＢｔ）：ｎ（ＥＤＡＣ）＝１：１：２：２时，巯基含量降至１３０．２ ｐ。ｍｏｌ／ｇ．在后一种情况 下，多余的ＨＯＢｔ并不溶解而是悬浮在反应体系中，不能有效地参与反应．研究还发现，在一定范围内 同时增加ＮＡＣ和ＥＤＡＣ的量并保持其摩尔比为１：２，效果尤为显著．体系的ｐＨ值对反应也有影响， 当ｐＨ＜４时，反应进行较慢，而当ｐＨ＞６时，虽然反应速度加快，但巯基易氧化形成二硫键，因此ｐＨ 值为５时较为适宜．
将Ｌ－９２９层纤维细胞在含有质量分数为１０％的小牛血清、Ｌ－谷氨酸盐（０．０８ ｍｍｏｌ／Ｌ）和庆大霉素 （７５ ｍｍｏｌ／Ｌ）的ＲＰＭＩ．１６４０培养液中培养，将对数生长期生长旺盛的Ｌ－９２９细胞（活细胞数＞９９％以 上），用质量分数为０．２５％的胰酶消化后，配制成浓度为３×１０４／ｂ／ｍＬ的细胞悬液备用¨８｜．将配好的 细胞悬液加入到９６孔板中，每孔加１００ ＩｘＬ，置于ＣＯ：体积分数为５％的培养箱中培养２４ ｈ，待贴壁完 全后，加入含质量分数为０．０２５％的ＣＳ—ＮＡＣ样品的ＲＰＭＩ一１６４０培养液，空白对照孔仅加等量的 ＲＰＭＩ．１６４０培养液，分别于第２天和第４天向每孔加入５０ ｐ．Ｌ ＭＴｒ液（用ｐＨ为７．４的ＰＢＳ缓冲液配制 成１ ｍｇ／ｍＬ的四甲基偶氮唑盐（ＭＴＴ）液，过滤细菌后避光保存），继续培养４ ｈ后，每孔加入１００ ｔｘＬ ＤＭＳＯ并振荡１０ ｒａｉｎ，用酶标仪测吸光值（Ａ＝５７０ ａｍ），计算相对增殖率（ＲＧＲ）：
将新鲜猪小肠固定于可转动的圆柱体表面（直径４．４ ｃｍ，高５．１ ｃｍ），取上述偶合物和对照品平 片，并滴少许磷酸缓冲液于平片表面润湿２ ｍｉｎ后与小肠接触，并给予０．９８ Ｎ的压力，施压时间３０ ｓ． 于３７℃将整个圆柱体浸没于ｐＨ为６．８的１００ ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲液中并进行转动，转速为１２５ ｒ／ｍｉｎ， 观察平片的变化情况并记录脱落时间¨６｜． １．６黏附力测定
目前引入的巯基基团多为巯基乙酸、￡．半胱氨酸和亚胺类巯基化合物等一】，但这些物质在体内并 不安全【ｌ¨１２ Ｊ．为此，我们将更为安全的ＡＬ乙酰基ｚ．半胱氨酸（ＮＡＣ）¨３’１４ ３直接引入到壳聚糖上，合成 了壳聚糖／Ⅳ＿乙酰基一己．半胱氨酸偶合物（ＣＳ—ＮＡＣ），并进行了表征，同时对材料的溶胀度、黏附性和细 胞毒性进行了探讨．
采用重量法测定溶胀度［１ ６｜．将３０ ｍｇ不同巯基含量的ＣＳ—ＮＡＣ偶合物和对照品分别压成直径为８ ｍｍ的平片．制备过程中保持压力不变．固定平片，于３７℃在ｐＨ为６．８的１００ ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲液中 吸水溶胀．在预定的时间间隔，从孵化介质中取出溶胀测试片称重，按下式计算溶胀度（ｓ）：
ｓ（％）＝［（职一职）／阢］×１００％ 式中，形，为测试平片的原始质量，职为在缓冲液中浸泡不同时问后的质量． １．５ ＣＳ－ＮＡＣ偶合物的黏附性测定
（Ｂ）
ＡｍｉｄｅⅡｂａｎｄ
８
７
６
５
４
３
２
ｌ
０
４０００
３０００
２０００
１０００
０
６
口／ｃｍ一１
Ｆｉｇ．１ １Ｈ ＮＭＲ（Ａ）ａｎｄ ｍ（Ｂ）ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ ＣＳ－ＮＡＣ
万方数据
王鑫等：新型生物黏附性材料巯基壳聚糖的合成与表征
２０９
聚糖的伯氨基． ２．２巯基的稳定性
巯基聚合物通过巯基氧化形成二硫键粘附于黏膜表面，因此聚合物上巯基的稳定性至关重要．考 察不同ｐＨ值对巯基稳定性的影响（见图２）．随着ｐＨ值的升高，巯基氧化速率加快．在ｐＨ＝６．８时， ６ ｈ内即有７５％的巯基被氧化，而在ｐＨ＝４．０时，只有不到１５％的巯基被氧化，即使经过２４ ｈ，也仅 有２０％的巯基被氧化．研究发现，在ｐＨ＞５．０时经过２４ ｈ，聚合物上的巯基基本氧化，这与Ｍａｒｓｃｈｕｔｚ 等¨引报道的结果不同．他们合成的巯基聚合物在相同ｐＨ条件下经过２４ ｈ仍有４０％一５０％的巯基未 被氧化，表明氧化（二硫键的形成）主要发生在邻近的巯基间，而很难与较远的巯基发生作用．在本实 验条件下，巯基的氧化除了形成二硫键外，还可能形成ｓｏ；一和ｓｏ；一等，这也是采用Ｅｌｌｍａｎ’ｓ试剂测 定巯基基本被氧化的原因．由于巯基聚合物作用于粘膜表面只需几分钟？ｏ，因此，巯基的这种氧化速 率影响不大．
Ｔａｂｌｅｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ＣＳ－ＮＡＣ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｗｉⅡｌ ａ ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｔｈｉｏｌ ｇｒｏｕｐｓ（ｍｅａｎ±Ｓ．Ｄ．，ｎ＝３）
口．ｐＨ＝４．０：ｂ．ｐＨ＝６．０．Ｏｔｈｅｒｓ ｗｅｒｅ ａｔ ｐＨ＝５．０．
为了准确判断巯基化合物是否已成功地引入壳聚糖中，我们对ＣＳ—ＮＡＣ偶合物进行了核磁共振和 红外光谱分析．从１ Ｈ ＮＭＲ谱图［图１（Ａ）］可知，与ｃｓ相比，ＣＳ－ＮＡＣ在６ ２．９处新增一明显的特征 峰，它是与巯基相连的亚甲基峰，而在６ ２．０～２．１处的甲基峰显著增强，也说明ＮＡＣ已与壳聚糖发生 偶合作用（ＮＡＣ中也含有甲基）．ＣＳ—ＮＡＣ的１Ｈ ＮＭＲ（Ｄ：Ｏ），艿：４．９０—５．２１（ｂｒ，Ｈ一１），４．４８—３．４７ （ｂｒ，Ｉｎ，Ｈ．３，Ｈ－４，Ｈ－５，Ｈ－６），３．２４（ｂｒ，ｓ，Ｈ－２），２．９８（８，一Ｓ—ＣＨ２一），２．１３（８，一ＣＯＣＨ３）． ＣＳ．ＮＡＣ的红外光谱［图１（Ｂ）］在２５００ ｃｍ。附近增加了一个一ＳＨ的伸缩振动峰，与有机硫化物红外 光谱图为一ｓＨ峰特征频率一致，说明新物质带有一ｓＨ基团，另外与冷干的ＣＳ谱图相比，在１６５２ ｃｍ。１处的峰（酰胺Ｉ带）明显增强，说明有更多的酰胺键形成，证明ＮＡＣ以酰胺键的形式引入到了壳
分别配制ｐＨ值为４．Ｏ，５．４，６．８的质量分数为０．５％的ＣＳ—ＮＡＣ溶液，于３７℃振荡．在预定的时 间间隔，取一定量溶液用Ｅｌｌｍａｎ ７ｓ试剂测定巯基含量ｕ ５１．巯基测定的标准曲线方程为
Ｙ＝３．５９９×１０—４＋０．４８６ｘ
式中，Ａ一＝４０２ ｎｍ，Ｒ２＝０．９９９９，Ｙ为巯基含量（Ｉｘｍｏｌ／ｇ），菇为吸光度． １．４溶胀性测定
的３０和３倍；无明显的细胞毒性．因此，ＣＳ－ＮＡＣ是一种很有应用前景的生物黏附性材料．
关键词巯基壳聚糖；Ｎ－乙酰基ｚ一半胱氨酸；溶胀度；黏附性；细胞毒性
中图分类号０６３１
文献标识码Ａ
文章编号０２５１－０７９０（２００８）Ｏｌ－０２０６－０６
对于具有肠肝反应和首过效应的蛋白质和多肽类生物大分子药物，传统采用注射给药方式．但注 射给药具有携带不便，易引起局部炎症及全身过敏反应等缺点。因此人们开始寻找一种更安全有效的 给药方法．在非注射给药途径中，黏膜给药具有比表面积大，药物吸收快，直接进入血液循环等特 点¨一，因而引起了人们的关注．
于药物分子的吸收．本文合成了一种新型巯基聚合物——『ｖ一乙酰基．￡一半胱氨酸．ｇ一壳聚糖（ＣＳ－ＮＡＣ），并进行
了表征，同时对材料的溶胀度、黏附性和细胞毒性进行了测试．结果表明，这种巯基聚合物具有较高的巯基
含量，最高可达到５８９．３ Ｉ．Ｌｍｏｌ／ｇ；具有快速的溶胀性能；黏附性显著增强，黏附时间和黏附力分别是壳聚糖
具有黏附性和促进吸收作用的载体材料是这类给药途径的关键．目前常用的黏附性材料有生物粘 附陛淀粉、壳聚糖、葡聚糖、口一环糊精、聚左旋乳酸、卡波姆９３４Ｐ、黄原胶等，具有吸收促进作用的材 料有壳聚糖、口．环糊精、磷脂和脂质等，其中壳聚糖具有明显的生物黏附性和促进吸收作用旧１，它通 过延长药物的黏附时间及瞬间打开黏膜中的紧密连接使大分子药物透过黏膜表面”’４ ｏ得以吸收．Ｓｏａｎｅ 等［５１发现壳聚糖制剂在鼻黏膜中停留的半衰期为８４ ｍｉｎ，而在相同条件下生物粘附性淀粉在鼻黏膜中 停留的半衰期为６８ ｍｉｎ．由于纤毛的清除作用，大大限制了这类药物制剂的有效吸收∞ｏ．壳聚糖经巯 基化修饰后能显著改善生物黏附性，有效地减缓了纤毛的清除作用，并能提高药物对细胞膜的透过 性［７】．Ｋｒａｕｌａｎｄ等【ｓ１将一种巯基壳聚糖用于胰岛素的鼻腔黏膜给药，药物的有效吸收是壳聚糖的７倍， 且对鼻腔无明显毒副作用．
１ห้องสมุดไป่ตู้实验部分
１．１试剂与仪器
壳聚糖（帆＝２００００，脱乙酰度８６％），浙江玉环县海洋生物有限公司；Ⅳ＿乙酰基一￡一半胱氨酸
（ＮＡＣ，纯度９９％），Ｓｉｇｍａ产品；Ｅｌｌｍａｎ ７ｓ试剂［质量分数为０．０９％的５，５’．二硫代双（２－硝基苯甲酸） 溶液］，Ａｌｄｒｉｃｈ产品；１一乙基一（３．二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（ＥＤＡＣ·ＨＣＩ，纯度９９％），Ｓｉｇｍａ 产品；ｌ一羟基一苯并一三氮唑（ＨＯＢｔ，纯度９９％），上海延长生化科技有限公司；新鲜猪小肠（天津食品二
Ｖ０１．２９ ２００８年１月
高等学校化学学报
ＣＨＥＭｌＣＡＬ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＣＨＩＮＥＳＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＩＥＳ
Ｎｏ．１
２０６—２１１
新型生物黏附性材料巯基壳聚糖的合成与表征
王 鑫，郑超，张新歌，王 填，李朝兴
（南开大学高分子化学研究所，天津３０００７１）
摘要巯基聚合物利用二硫键的形成，以共价键黏附于黏膜表面，可以延长药物在黏膜上的滞留时间，有利
收稿日期：２００７－０５—１０． 基金项目：南开大学青年教师科研基金（批准号：２００７０４１０７６６）资助． 联系人简介：李朝兴，男，博士，教授，博士生导师，从事生物医药高分子的研究 Ｅ—ｍａｉｌ：ｌｅｘ＠ｎａｎｋａｉ．ｅｄｕ．ｃｎ；ｘｉｎｓｈｕａｎｇ＠ｎａｎｋａｉ．ｅｄｕ．ｃｎ
万方数据
王鑫等：新型生物黏附性材料巯基壳聚糖的合成与表征
Ｆｉｇ．２ Ｄｅｃｒｅａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｉｏｌ ｇｒｏｕｐ ｃｏｎｔｅｎｔ稍ｔｌｌ ＣＳ—ＮＡＣ７ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐＨ ｖａｌｕｅｓ ａｎｄ ３７℃（Ａ）
２．３
ａｎｄ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｉｏｌ ｇｒｏｕｐ ｃｏｎｔｅｎｔ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ａｔ ｐＨ＝６．８ ａｎｄ ３７℃（Ｂ） （Ａ）ｐＨ＝４．Ｏ（一），ｐＨ＝５．４（·）ａｎｄ ｐＨ＝６．８（▲）；（Ｂ）ＣＳ·ＮＡＣｌ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（一），ＣＳ—ＮＡＣ２ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（·），ＣＳ·ＮＡＣ７ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ｖ）ａｎｄ ＣＳ—ＮＡＣ８ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（▲）（ｍｅａｎ±Ｓ．Ｄ．，ｎ＝３）． ＣＳ—ＮＡＣ的溶胀性
Ｊ赠送）． Ｖａｒｉａｎ ＵＮＩＴＹ—ｐｌｕｓ ４００型核磁共振氢谱仪；ＦＴＳ－６０００型傅里叶红外光谱仪；岛津ｕＶ．１７００紫外一可
见分光光度计． １．２ ＣＳ－ＮＡＣ偶合物的合成
将５００ ｍｇ壳聚糖与适量ＨＯＢｔ分散于４６ ｍＬ去离子水中，搅拌直至形成透明溶液．加入一定量的 ＮＡＣ，待完全溶解后，逐滴加入ＥＤＡＣ水溶液（４ ｍＬ），用１ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ调节ｐＨ至４～６并保持恒定， 于室温下搅拌３ ｈ．取出反应液，于１０℃避光条件下用质量分数为０．２％的乙二胺四乙酸二钠（ＥＤＴＡ） 的盐酸（５ ｍｍｏｌ／Ｌ）溶液透析１次，用质量分数为１％的ＮａＣｌ的盐酸（５ ｍｍｏｌ／Ｌ）溶液透析２次，再用ｌ ｍｍｏｌ／Ｌ盐酸溶液透析２次，每次透析时间均为１２ ｈ．冷冻干燥后得到淡黄色纤维状巯基聚合物，密封 后于４℃保存备用．用同样方法制备冷干壳聚糖（不加ＮＡＣ，ＨＯＢｔ和ＥＤＡＣ）和对照品（不加ＨＯＢｔ和 ＥＤＡＣ）． １．３巯基稳定性测定