pdf - 糖基化对卵白蛋白分子特性及乳化性的影响

中国农业科学 2009,42(7):2499-2504 Scientia Agricultura Sinica
doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2009.07.030
糖基化对卵白蛋白分子特性及乳化性的影响
于 滨，迟玉杰
（东北农业大学食品学院，哈尔滨 150030）
摘要：【目的】对糖基化卵白蛋白分子特性及乳化性进行研究，探讨二者之间内在联系。【方法】研究糖基化 进程中游离氨基含量、Zeta 电位、疏水性、乳化液滴平均粒径（d32）与乳化活性的变化情况。在此基础上对以上 因子进行相关性分析，并对糖基化卵白蛋白的乳化液进行显微镜观察。【结果】糖基化反应使游离氨基降低 41.56%、 Zeta 电位降低 20 mV、乳化液滴平均粒径（d32）减少 2.0μm，而疏水性和乳化活性分别提高 2.3 倍和 3.9 倍。各 因子间明显的相关性表明，所研究因子为影响乳化性的关键因子。显微镜观察结果表明，糖基化卵白蛋白易于形 成较小的乳化液滴。【结论】糖基化是通过改变蛋白质表面电荷和形成双亲结构来改善乳化性的。
1.3.4 褐变程度测定 将配制成 1%的蛋白质溶液， 3 000 r/min 离心 10 min，420 nm 进行比色，以 OD420nm 表征褐变程度。 1.3.5 Zeta 电位的测定 配制 pH 7.4 的 0.02 mol·L-1 Tris-HCl 缓冲液，加入适量 NaCl（0.01 mol·L-1），溶 液脱气后，再加入糖基化卵白蛋白充分溶解，0.45 µm 微滤膜过滤，用马尔文 Zeta 电位粒径测定仪分析 Zeta 电位，测定温度为 25℃，重复测定 3 次以上，取平均值。 1.3.6 糖 基 化 卵 白 蛋 白 疏 水 性 测 定 用 0.02 mol·L-1，pH 7.4 磷酸缓冲液稀释至蛋白浓度 1～5 mg·ml-1，取不同浓度的稀释样品 4 ml，加入 20 µl 的 ANS 溶液（采用 0.02 mol·L-1，pH 7.4 磷酸缓冲液）作 为荧光探针并于室温条件下保持 1 h。采用荧光分光光 度计在 370 nm 的激发波长和 470 nm 的发射波长下测 定样品的荧光强度，以荧光强度对蛋白质浓度作曲线， 曲线斜率即为蛋白质分子的表面疏水性。 1.3.7 乳化液平均粒径 d32 的测定 乳化液的平均粒 径 d32 采用马尔文 Zeta 电位粒径测定仪进行测定，采 用以下光学参数：玉米油和水的折射系数分别为 1.4673 和 1.33，吸收参数为 0.001。平均粒径 d32 用于 评估新制备的乳化液滴的表面积，按照以下公式由仪 器计算得出，其中 ni 表示乳化液液滴数目，di 表示液 滴直径。
所有试验至少重复 3 次，单因子方差分析通过 SPSS V13.0 的 One-way ANOVA 程序进行分析，均数 之间的两两比较采用 Tukey 程序分析（样本数 n=3，P ＜0.05）。
2 结果与分析
2.1 糖基化反应条件的确定 本试验选择乳糖作为糖基化用糖，是基于其反应
容易控制，而 6-磷酸葡萄糖结构较为复杂，且表面带
信作者迟玉杰（1963－），女，黑龙江哈尔滨人，教授，研究方向为食品化学及农产品加工。Tel：0451-55191793；E-mail：yjchi@
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的乳化性未作研究。【本研究切入点】目前，同时研 究乳化性与分子特性的研究较少，关于二者之间关系 的探讨未见报道。【拟解决的关键问题】卵白蛋白占 蛋清蛋白的 54%，它的特点决定了蛋清蛋白的功能性， 本文通过研究卵白蛋白糖基化过程中分子特性与乳化 性的变化情况，以期能够加深理解糖基化改善蛋白质 乳化性的机制。
卵白蛋白，Sigma 公司；乳糖，中国医药（集团） 上海试剂公司；玉米油，南海油脂工业有限公司；1苯胺基萘-8-磺酸（ANS），Sigma 公司；邻苯二甲醛 （OPA），Sigma 公司。 1.3 试验方法 1.3.1 糖基化卵白蛋白的制备 根据预试验的结果， 将卵白蛋白与乳糖按照一定比例（4%～6%）混合、 溶解，经冷冻干燥制得卵清蛋白-乳糖混合粉，然后将 混合粉置于含有饱和 KI 溶液（65%相对湿度）的封闭 容器中，在一定温度（50～60℃）条件下保温 3 d，即 得糖基化卵白蛋白。 1.3.2 乳化活性的测定 蛋白样品溶解于 pH 7.4， 0.1 mol·L-1 的磷酸盐缓冲溶液中（1 mg·ml-1），取 30 ml 样品加入 10 ml 玉米油于室温下 10 000 r/min 匀质 1 min 以形成乳化液，匀质后立即从乳化液底部吸取 100 µl，用 5 ml 0.1%的 SDS 稀释后在 500 nm 条件下测定 吸光值，以此吸光值表示乳化活性。 1.3.3 游离氨基含量的测定 游离氨基含量的测定 采用邻苯二甲醛（OPA）法。取 OPA 试剂 4 ml 于试 管中，注入 200 µl 样品液（10 mg·ml-1），混匀后于 35℃反应 2 min，以 OPA 试剂中加入 200 µl 水为空白， 在 340 nm 下测定其吸光值。反应的游离氨基相对含量 计算公式：游离氨基含量（%）=At/A0×100%。其中 At 表示不同反应时间样品的吸光值，A0 表示未反应样 品的吸光值。
∑ ∑ d 32 = i ni d i 3 / i ni d i 2
1.3.8 分子特性与乳化性相关性分析 选取本试验 中研究的指标，包括 Zeta 电位、游离氨基含量、疏水 性、平均粒径、乳化活性，采用 SPSS V13.0 统计分析 软件进行双变量相关分析，以此研究糖基化卵白蛋白 分子特性和乳化性之间的关系。 1.3.9 乳化液微观结构观察 乳化液按照 1.3.2 所述 方法进行制备，取 1 滴乳化液置于载玻片上，盖上盖 玻片，在显微成像系统下进行观察，放大倍数为 200。 1.4 数据分析
1 材料与方法
1.1 试验仪器、设备 DU 700 紫外/可见光分光光度计（美国贝克曼库
尔特有限公司），Zetasizer Nano ZS 马尔文 Zeta 电位 粒径测定仪（英国马尔文公司），FS-1 可调高速匀浆 机（金坛市荣华仪器制造有限公司），F-4500 荧光分 光光度计（日本日立公司），FDU-1100 冷冻干燥机 （日本 EYELA），BX-60 显微镜（Olymous），DC-290 数字成像系统（Kodak）。 1.2 试验材料及试剂
关键词：糖基化；卵白蛋白；乳化性；表面电荷；双亲结构
Effect of Glycosylation on Molecular Characteristics and Emulsifying Properties of Ovalbumin
YU Bin, CHI Yu-jie
(Department of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030)
包 括 热 稳 定 性 [1-2] 、 乳 化 性 [3-5] 、 起 泡 性 [6-7] 、 抗 氧 化 性[8-9]和凝胶性[10-11]，其中乳化性的研究已成为热点。 Kato 等[12]利用 6-磷酸葡萄糖与卵白蛋白发生糖基化 反应可使卵白蛋白的乳化性提高 5 倍，推测其优越的 乳化性与 6-磷酸葡萄糖较为复杂的结构有关。Shu 等[13]研究了溶菌酶与半乳甘露聚糖之间的糖基化反 应，发现溶菌酶乳化性与所连接的半乳甘露聚糖数目 和碳链长度成正比。Choi 等[14]对卵白蛋白-葡聚糖糖 基化产物的分子特点进行了分析，但关于糖基化产物
7期
于 滨等：糖基化对卵白蛋白分子特性及乳化性的影响
2501卵白蛋白的乳化性高低确定 糖基化反应的条件（图 1）。从图 1 可以看出，当乳 糖添加量为 4%时，50℃加热处理的卵白蛋白的乳化 活性最低，仅为 0.463，而当乳糖添加量为 6%时，60℃ 加热处理的卵白蛋白的乳化活性高达 1.502。随着乳糖 比例的不断增加，糖基化卵白蛋白的乳化性不断提高， 但不同乳糖添加量对乳化活性影响不显著（P＞0.05）。 温度对乳化活性也有促进作用，且温度对卵白蛋白的 乳化活性影响更加明显，不同温度对乳化活性影响显 著（P＜0.05）。本试验选择乳化活性最大的样品，即 乳糖添加量为 6%，加热温度 60℃的样品为研究对象， 进一步研究糖基化过程中卵白蛋白分子特性和乳化性 的变化情况。此外本试验也对其它条件进行研究，较 高温度（＞60℃）和较高乳糖添加量（＞6%）条件下 褐变严重，不予考虑。低温（＜50℃）和低乳糖添加 量（＜4%）的条件下，反应需要较长时间或乳化性改 善不明显，也不予采用。
收稿日期：2008-10-14；接受日期：2009-04-07 基金项目：国家“十一五”科技支撑计划（2006Bad05a00）、国家自然科学基金项目（30871954） 作者简介：于 滨（1980－），男，黑龙江哈尔滨人，博士研究生，研究方向为农产品加工。Tel：0451-55191793；E-mail：yubin107@。通
Key words: glycosylation; emulsifying properties; ovalbumin; surface charge; amphiphilic structure
0 引言
【研究意义】通过研究糖基化过程中卵白蛋白的 分子特性和乳化性的变化情况，揭示二者之间的内在 联系，对糖基化在食品工业中的应用具有指导意义。 【前人研究进展】蛋清蛋白具有较好的功能性质使其 在一些食品加工中得到应用，但是其较差的乳化性， 使其应用受到限制。Maillard 反应的初始阶段又称为 糖基化反应，可以改善蛋白质的多种功能性质，主要
Abstract: 【Objective】 Molecular characteristics and emulsifying properties of glycosylated ovalbumin were studied to investigate the relationship between them. 【Method】 Content of free amino group, Zeta potential, hydrophobicity, emulsifying activity and average droplet size of emulsion (d32) during glycosylation process were investigated. Correlation analysis of referred factors and microscopic observation of emulsion of glycosylated ovalbumin were also conducted. 【Result】 Glycosylation reaction resulted in decrease of 41.56% of free amino group, 20 mV of Zeta potential, 2.0 µm of average droplet size of emulsion (d32) , and increase of 2.3 times of hydrophobicity and 3.9 times of emulsifying activity. Obvious correlation showed the investigated factors were key points of emulsifying properties. Microscopic observation indicated glycosylated ovalbumin was prone to form small droplet of emulsion. 【Conclusion】 Emulsify properties were improved by glycosylation through change of surface charge and formation of amphiphilic structure.