医学生物化学(第十二章)

二、半不连续复制
DNA链合成 5‘3’ 前导链（leading strand） 随从链（lagging strand） 冈崎片段 半不连续复制
三、RNA 引物
DNA 聚合酶 不能催化两个游离的dNTP聚合 RNA聚合酶抑制剂 （-）DNA复制 冈崎片段 5‘ 端含有 4-12核苷酸的RNA 引物 RNA引物提高DNA复制的真实性
2 缺失（deletion）
3 插入（insertion）
4 倒位
三、修复机制
1 光修复机制
主要存在于低等生物
（1）不需要光复活酶 （2）需要光复活酶
光复活酶（photoreactivating enzyme） 或光修复酶（photolyase ） 解聚嘧啶二聚体
2 切除修复 （excision repair） 暗修复
2 蛋白质印迹 （Western blot）
3 DNA芯片或基因芯片 4 聚合酶链反应
（1）变性 （2）退火 （3）延伸 RT-PCR
5
DNA序列分析 双脱氧末端终止法 Sanger 化学修饰法 Gilbert- Maxam
二、重组DNA分子的构建
1 目的基因 （1）基因组DNA
（2）cDNA （3）人工合成的DNA片段 （4）聚合酶链反应（PCR）扩增DNA片段或cDNA
2 载体
（1）克隆载体 质粒 多克隆位点 筛选标记 高效复制 噬菌体 其他
2 表达载体
原核表达载体 真核表达载体
3 工具酶
限制性内切酶（restriction endonuclease , RE）
3
化学因素 （ 1）亚硝酸盐
C U （2）5-溴尿嘧啶（5-BU） 5-BU 异构体与G配对 （3）氮芥类 G 的N7烷基化而被去除 （4） 羟胺 C形成衍生物与A配对
二、DNA损伤的类型
1 点突变（point mutation） (1) 转换（transition）
（2）颠换(transversation)
三、重组DNA分子引入宿主细胞
1 原核细胞
转化 感染
2 动物细胞
转染
四、筛选
1 选择标志 2 菌落或噬菌体原位斑点杂交 3 蛋白质表达产物的测定
五、一些常用的分子生物学技术
1 核酸分子杂交
（1）DNA 印迹 （Southern blot） ( 2 ) RNA印迹 （Northern blot） （3）斑点杂交 DNA 或RNA斑点杂交 菌落或噬菌斑原位斑点杂交
第一节 DNA复制的几个基本原则
一、半保留复制
DNA生物合成时，亲代的DNA双链，每股链都可以作 为模板，按碱基互补配对原则指导DNA新链的合成， 这样合成的两个子代DNA分子，碱基序列与亲代分子 完全一样。但一条链是来自亲代的DNA链，另一条链 是新合成的链，此即为半保留复制（semiconservative replication） 1958年 M.Messelson and F.W.Stahl 同位素实验证实
2 端粒酶的作用机制
端粒酶与端粒DNA GT丰富链突出部分的3‘端结合，通 过模板RNA的碱基与GT丰富链突出部分的碱基形成若 干碱基对后，合成6个脱氧核糖核酸的串联重复序列 端粒DNA另一股CA丰富链由细胞DNA聚合酶随着 RNA引物合成
第四节 DNA的损伤与修复
DNA 损伤（DNA damage） DNA修复（DNA repair）
五、DNA连接酶
DNA ligase
催化两段DNA链之间磷酸二酯键的形成 3‘端 游离-OH 5’端 磷酸根 ATP供能
第三节 DNA复制过程
一、复制的起始
大肠埃希菌复制
特定起始位点 oriC 245bp 3个13nt 串联序列 GATCTNTTNTTTT 11次GATC 4个DnaA结合位点 TTATCCACA 反向重复
四、复制的真实性
多种酶类和蛋白质因子参与
第二节 参与 DNA 复制的一些酶类和蛋白质
一、大肠埃希菌的 DNA 聚合酶
5‘ 3’聚合
3‘，5’-磷酸二酯键
1. DNA 聚合酶 I
1958年 Kornberg / 68KD大片段（Klenow酶） 103 KD多肽 \ 36KD小片段 聚合 3‘5’外切酶活性 校读功能（proof reading） 5‘3’外切酶活性 切除5‘RNA引物 和 DNA 修复
双向复制（bi-directional replication）
复制从oriC开始，同时向两个方向进行 形式
复制叉（replication fork）
电子显微镜下DNA复制前进部位伸展成叉状
二、复制的延长
延长的方向
合成随从链的模板绕成环状，使DNA聚合酶 III 合成前 导链和随从链能够按同一方向
2. DNA 聚合酶 II
至少 4 亚基构成 聚合 3‘5’外切酶活性 参与DNA损伤修复
3. DNA 聚合酶 III
DNA复制的主要酶 10种亚基组成 ,不对称二聚体，称 DNA 聚合酶 III全酶 MW 900KD （1）非常高的续进性（processivity) >500,000 nt （2）催化活性高 >1000 nt /秒 （3）3‘5’外切酶活性
最关键的修复途径 原核生物 大肠杆菌 UV特异切割酶（excinuclease）( UVr ABC enzyme) 5’ 8 nt 损伤 4 nt 3’ 真核生物 着色性干皮病（xeroderma pigmentosum）
3
碱基切除修复
特异性DNA糖苷酶（DNA glycosylase） 1) DNA糖苷酶识别损伤碱基，切除 2）AP核酸内切酶切除磷酸二酯键 3）DNA聚合酶 I 切除损伤链，合成新链 4）连接酶封口
三、复制的终止
四、真核生物端粒DNA的复制
端粒（telomere）
真核生物线性染色体的两个末端
1 端粒DNA的结构和端粒酶
端粒DNA的3‘端有数百个串联重复GT丰富的短的寡核苷酸序列 四膜虫 GGGGTT 人 AGGGTT 端粒酶（telomerase) 蛋白质和 RNA 两部分，RNA作为合成端粒DNA的模板 唯一携带RNA模板的逆转录酶，种属特异性 临界长度（crisis length） 衰老(senescence) 凋亡(apoptosis)
第五节 重组DNA技术
概念
DNA重组（recombination） 两个DNA分子之间或一个DNA分子的两个不同部位之间 通过链断裂和片段的交换重接，改变了基因的组合序列
DNA重组技术 1970年 Boyer、Cohen、Bery 基因工程 遗传工程 分子克隆
一、基因工程的基本步骤
1 重组DNA分子的构建 2 引入宿主细胞 3 筛选
若一条链有损伤，可被修复酶切除，并以未损伤的信息 重新合成与原来相同的序列
突变（mutation）
能通过复制传递给子代的DNA序列永久的变化
一、造成DNA损伤的因素
1 自发的因素
周围环境随机热碰撞 5000嘌呤碱基/天 /人 100 CU /天
2
物理因素
（1）紫外线损伤 形成嘧啶二聚体 （2）电离辐射损伤 射线 射线
微生物的一种自我保护的酶，识别双链DNA分子中特 异碱基序列并切开 命名原则 第一个字母大写 第二、三字母小写 第四个字母大写 罗马字大写
细菌属名的第一个字母 细菌种名的头二个字母 株系的字母或数字 编号
识别序列为4-6碱基 或更多，回文Βιβλιοθήκη Baidu称 切口为粘端或平端
拼接
（1）黏性末端 （2）均聚体尾部 （3）化学合成的接头
3. DNA拓扑异构酶（topoisomerase）
拓扑 物体作弹性移位而又保持原有的性质
DNA拓扑异构酶 I 切断DNA双链中的一股，解除张力后切口封闭 DNA拓扑异构酶 II 亦称旋转酶（gyrase） 同时切断双链，随后切口封闭（ATP）
四、 引发体（primosome）
由多种蛋白质和酶组成，DNA复制起始所必需 最早大肠杆菌复制研究中 DnaA 辨认其始点 DnaB 解链酶 DnaC 运送和协同DnaB DnaG 引物酶（primase）合成RNA引物
聚合功能 校读功能 环绕DNA钳 35
+ 核心聚合酶 x 2 +2
+ 2 ' DNA 聚合酶 III* + 4 全酶
二、真核细胞的DNA聚合酶
5种真核生物的DNA聚合酶
随从链合成
D N A 聚 合 酶
DNA修复
线粒体DNA（mtDNA）合成 DNA修复 前导链合成 辅酶PCNA（proliferation cell nuclear antigen）
第十二章 DNA的复制、修复 与重组 DNA技术
教材 医学生物化学 陈诗书 主编 参考教材 生物化学 周爱儒 主编 讲授人 黄建
分子生物学的中心法则（ central dogｍa ）
1958 年 Crick 提出的遗传信息从 DNA 经 RNA 流向蛋白质 的过程
1970年Temin 提出“逆转录”
三、解旋、解链酶类和蛋白质
1. DNA 解链酶 (DNA helicase) ATP酶活性 2 ATP/ bp
2. 单链DNA结合蛋白
SSBP （single strand binding protein)
HDP (helix destabilizing protein)
维持模板单链状态 避免核酸酶水解