现代分子生物学-第三章

E. coli RNA polymerase :αsubunit
•是核心酶中的两个相同的亚单位 是核心酶中的两个相同的亚单位 •由rpoA 基因编码 由 •与核心酶的组装有关 与核心酶的组装有关 •参与 参与RNA聚合酶和部分调节因子的相互作用 参与 聚合酶和部分调节因子的相互作用 * T4噬菌体感染大肠杆菌后对 亚基的一个精 噬菌体感染大肠杆菌后对α亚基的一个精 噬菌体感染大肠杆菌后对 氨酸残基进行ADP糖基化修饰，造成 糖基化修饰， 氨酸残基进行 糖基化修饰 造成RNA聚合 聚合 酶全酶对启动子亲和力降低。 酶全酶对启动子亲和力降低。
第三讲 生物信息的传递 （上）从DNA到RNA 到
1、RNA的转录 、 的转录 2、转录机器的主要成分 、 3、启动子与转录起始 、 4、终止和抗终止 、 5 、原核生物和真核生物 原核生物和真核生物mRNA特征比较 特征比较 6、内含子的剪接、编辑、再编码及化学修饰 、内含子的剪接、编辑、
From DNA to Protein
前起始复合物 (preinitiation transcription complex, PIC) 真核生物RNA聚合酶不能直接识别基因的启 聚合酶不能直接识别基因的启 真核生物 动子区， 需要一些被称为转录调控因子的辅 动子区 ， 助蛋白质按特定顺序结合于启动子上， 助蛋白质按特定顺序结合于启动子上 ， RNA 聚合酶才能与之相结合并形成复杂的前起始 复合物(PIC)以保证有效地起始转录。 以保证有效地起始转录。 复合物 以保证有效地起始转录
E. coli RNA polymerase :β &β’ subunit
•β 和β’分别由 rpoB 和 rpoC 基因编码。 基因编码。 分别由 •由β和β’亚基组成了聚合酶的催化中心。 由 和 亚基组成了聚合酶的催化中心 亚基组成了聚合酶的催化中心。 •它们在序列上与真核生物 它们在序列上与真核生物RNA聚合酶的两个 它们在序列上与真核生物 聚合酶的两个 大亚基有同源性。 大亚基有同源性。 •β亚基能与模板 亚基能与模板DNA、新生 亚基能与模板 、新生RNA链及核苷酸底 链及核苷酸底 物相结合。 物相结合。 rpoB 和 rpoC 基因的突变会影响 转录所有的阶段。 转录所有的阶段。
DNA序列是遗传信息 序列是遗传信息 的贮存者， 的贮存者，它通过自 主复制得到永存， 主复制得到永存，并 通过转录生成信使 RNA，翻译生成蛋白 ， 质的过程来控制生命 现象。 现象。
3. 1 RNA的转录 (Transcription) 的转录 基因表达包括转录（ 基因表达包括转录（transcription）和 ） 翻译（ 翻译（translation）两个阶段。 ）两个阶段。 转录是指拷贝出一条与DNA链序列完全相同 除 链序列完全相同(除 转录是指拷贝出一条与 链序列完全相同 T→U之外 之外） RNA单链的过程 单链的过程， 了T→U之外）的RNA单链的过程，是基因表达 的核心步骤。 的核心步骤。 翻译是指以新生的mRNA为模板，把核苷酸三联 为模板， 翻译是指以新生的 为模板 遗传密码子翻译成氨基酸序列、 遗传密码子翻译成氨基酸序列、合成多肽链的过 是基因表达的最终目的。 程，是基因表达的最终目的。
转录的延伸 RNA 聚 合 酶 离 开 启 动 子 ， 沿 DNA链移动并使 链移动并使 新生RNA链不断伸长的 新生 链不断伸长的 过程就是转录的延伸。 过程就是转录的延伸。
• 共价地向生长 共价地向生长RNA链的 端添加核糖核苷酸 链的3’端添加核糖核苷酸 链的 • RNA聚合酶是以 → 3’ 方向来延长 聚合酶是以5’→ 方向来延长RNA链 聚合酶是以 链 • RNA聚合酶本身沿着反义链以 → 5’方向移动 聚合酶本身沿着反义链以3’ 聚合酶本身沿着反义链以 方向移动
Hale Waihona Puke 生物体内拥有三类RNA： ： 生物体内拥有三类
1、编码特定蛋白质序列的mRNA； 、编码特定蛋白质序列的 ； 2、能特异性解读mRNA 中的遗传信息并将其 、能特异性解读 转化成相应氨基酸后加入多肽链中的tRNA； 转化成相应氨基酸后加入多肽链中的 ； 3、直接参与核糖体中蛋白质合成的rRNA。 、直接参与核糖体中蛋白质合成的 。
转录的基本过程
1、模板识别 (Template Recognition) 、 2、转录起始 (Initiation) 、 3、转录的延伸 (Elongation) 、 4、转录的终止 (Termination) 、
模板识别
1、RNA聚合酶与启动子 、 聚合酶与启动子DNA双链相互作用 聚合酶与启动子 双链相互作用 并与之相结合的过程。 并与之相结合的过程。 2、转录起始前，启动子附近的DNA双链分 、转录起始前，启动子附近的 双链分 开形成转录泡以促使底物核糖核苷酸与模板 DNA的碱基配对。 的碱基配对。 的碱基配对
Core enzyme Holoenzyme
聚合酶全酶
相对分子量： 相对分子量：4.65×105 ×
70 KD
36.5 KD 151 KD
只与转录的 起始有关
参与转录延伸
原核生物(E. 原核生物 coli)的RNA聚合酶 的 聚合酶
• E. coli 只有一个 DNA-directed RNA聚合酶 ， 聚合酶 来合成所有类型的RNA。 来合成所有类型的 。 • 是细胞中最大的酶之一。 是细胞中最大的酶之一。 • 由5种subunits 组成 聚合酶全酶(holoenzyme), 5种 聚合酶全酶(holoenzyme), 以及1 包括 2 α, 1 β, 1β’, 1 ω 以及 σ subunits 。 • 形状象一个圆筒状通道，可以直接与 bp 形状象一个圆筒状通道，可以直接与16 DNA结合。整个聚合酶可结合 bp DNA。 结合。 结合 整个聚合酶可结合60 。 • RNA 合成速率 合成速率: 40 nt /秒, 37oC 。 秒
3. 2 转录机器的主要成分
1. RNA聚合酶 (RNA polymerase) 聚合酶 2. 转录复合物
RNA聚合酶 (RNA polymerase) 聚合酶
RNA聚合酶是转录过程中最关键的酶。 聚合酶是转录过程中最关键的酶。 聚合酶是转录过程中最关键的酶 1. 主要以双链 主要以双链DNA为模板，以4种核苷三磷酸作 为模板， 种核苷三磷酸作 为模板 为活性前体。 为活性前体。 2. 需要 2+/Mn2+为辅助因子。 需要Mg 为辅助因子。 3. 它不需要任何引物。 它不需要任何引物。 4. 以5’ → 3’ 方向合成 方向合成RNA链。 链 5. 缺乏 → 5’ 外切酶活性。 缺乏3’ 外切酶活性。 6. 是一个含有多个亚单位 是一个含有多个亚单位(multi-subunit)的酶。 的酶。 的酶
大肠杆菌中的σ因子能识别并与 大肠杆菌中的 因子能识别并与 启动子区的特异性序列相结合
因子 σ70 σ32 基因 rpoD rpoH 功能 广泛 热休克 -35区 区 TTGACA TCTCNC CCTTGA A CTGGN A 间隔（ ） 间隔（bp） 16-18 13-15 -10区 区 TATAAT CCCCAT NTA TTGCA
E. coli RNA polymerase : σfactor
负责模板链的选择和转录的起始： 负责模板链的选择和转录的起始： •与σ因子的结合使 与 因子的结合使 因子的结合使RNA聚合酶从核心酶转变为聚合 聚合酶从核心酶转变为聚合 酶全酶。 酶全酶。 •是启动子识别的关键的酶，不仅增加聚合酶对启 是启动子识别的关键的酶， 是启动子识别的关键的酶 动子的亲和力(提高 提高10 动子的亲和力 提高 3倍)，还可降低它对非专一位 ， 点的亲和力(降低 降低10 点的亲和力 降低 4倍)，使酶底复合物的半衰期小 ， 于1s。 。 •在细胞中对 因子量的需求少于聚合酶中其它亚单 在细胞中对σ因子量的需求少于聚合酶中其它亚单 在细胞中对 位。
原核生物(E. 原核生物 coli)的RNA聚合酶 的 聚合酶
2 alpha (α) subunit, 1 beta (β) subunit, 1 beta prime (β’) subunit, 1 omega (ω) subunit, 1 sigma (σ) subunit
155 KD 11 KD 36.5 KD
DNA-mRNA-the encoded peptide
编码链（ 编码链（coding strand）: 与mRNA序 ） 序 列相同的那条DNA链, 或称有意义链 列相同的那条 链 （sense strand）. ） 模板链（template strand）: 根据碱基 模板链（ ） 互补原则指导mRNA合成的 合成的DNA链, 互补原则指导 合成的 链 或称反义链（ 或称反义链（antisense strand）。 ）。
转录的终止
• 合成的终止： 当RNA链延伸到转录终止位点时， 合成的终止： 链延伸到转录终止位点时， 链延伸到转录终止位点时 RNA polymerase 和RNA链均从DNA模板上释放出 RNA链均从 链均从DNA模板上释放出 来。 • Terminator: 通常含有自我互补区域 通常含有自我互补区域(selfcomplementary regions) ，在RNA产物中可以形成 产物中可以形成 stem-loop 或hairpin结构 。 结构
大肠杆菌RNA聚合酶的组成分析 表3-1 大肠杆菌 聚合酶的组成分析
亚基 α β β’ ω σ 基因 rpoA rpoB rpoC ？ rpoD 相对分 子量 3.65×1 × 04 1.51×1 × 05 1.55×1 × 05 11×104 × 7.0×104 × 亚基 数 2 1 1 1 1 组分 核心酶 核心酶 核心酶 核心酶 σ因子 因子 未知 存在多种σ因子 ， 存在多种 因子， 用于识别 因子 不同的启动子 功能 核心酶组装，启动子识别。 核心酶组装，启动子识别。 β和β’共同形成 和 共同形成RNA合成的 合成的 共同形成 活性中心。 活性中心。