常见生物相容性实验汇总

常见生物相容性实验汇总

细胞复苏

材料准备：

培养基、培养皿、70%酒精、一次性吸管、FBS、15ml&50ml离心管

实验步骤：

1.先将培养基配好并复温，在15ml离心管中加入5ml培养基；准备37℃的水浴，取

出冻存管后立即置于水浴中融化，确保细胞全部浸入液面，快速摇动，1min内使管内的细胞融化，注意不要让水没过管口，液氮会从口子喷出，小心。

2.把培养基融化后的管子用75%酒精擦拭消毒后，放入安全柜内操作。

3.小心打开冻存管，将细胞悬液转移到有培养基的15ml离心管中。

4.1200rpm离心3min，弃上清，加入6ml含10%FBS的完全培养基，转移至新培养

瓶（小瓶6ml培养基，大瓶10ml培养基）中，做好标记（细胞类型、传代数、培养基、复苏时间、复苏人），置于CO2培养箱中37℃培养，培养24h后视情况换液。

5.复苏后细胞生长状况正常后，进行常规培养，最好在第二次传代后冻存若干管细胞，

不可只取不存，在第三次传代后可用于细胞实验。

TIPS：

a.解冻细胞必须迅速，防止细胞低温损伤，慢冻速融。

b.细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。

细胞传代（TE消化法）

实验前准备事项：

1.预热培养用液：把已经配制好的装有培养基、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃

水浴锅内预热（可以省去）。

2.用75％酒精擦拭双手，生物安全柜经过紫外线照射超过30min，实验前通风至少开

启15分钟让空气循环起来，橱内不要使用火焰灯，它们会影响橱内空气的流动方式。

3.实验前把可能用到的试剂、吸管及离心管等全部拿到厨内，并正确摆放使用的器械，

保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。

材料准备：

TE消化液、FBS、对应培养基、50ml离心管若干、15ml离心管若干、一次性吸管若干、培养皿等

实验步骤：

1.观察细胞生长状况后，取出实验所需物品，可在50ml离心管中配制40ml培养基

（4ml FBS+36ml α-MEM）待用。

2.用一次性吸管从细胞单层吸出培养基，缓慢加入PBS或者不含血清的培养基没过

细胞，摇晃洗涤培养皿1~2次。

3.再吸出PBS或培养基，吸的越干净越好，6cm（10cm）培养皿中加入600μl（800 μl）

TE（胰蛋白酶），以刚刚没过细胞为宜。（视细胞种类也可不洗涤直接加入TE消化液）

4.稍加摇匀，使TE消化液均匀覆盖皿内所有细胞，置37℃条件下温育1~3分钟。消

化程度以用肉眼观察当培养皿晃动时飘起单层细胞为准，可在显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度，视细胞不同而调节。

5.消化适度后，加入适量培养基2~3ml于培养皿中终止消化，沿四个方向吹洗培养

皿，确保细胞均从板上消化下来，最后全部转移到15ml离心管中。

6.用吸管将已经消化的细胞轻轻吹打成细胞悬液。精确配平后放入台式离心机内

1200 rpm离心3分钟。

7.弃上清液，加入适量PBS，重悬后1200rpm离心3分钟。

8.弃上清液，先加入2~3ml含10%血清的培养基于15ml离心管中，将适量细胞重悬

液转移至含有培养基的6cm培养皿中进行培养，做好标记（细胞类型、传代数PxNy、培养基D-L-5、传代时间、传代比例1:5；操作人），置于CO2培养箱中37℃培养，清理操作台，处理垃圾，记录笔记。

TIPS：

a.消化适度：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素

的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。

b.胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散，细胞从平板上脱落可以

用枪头吹打实现，但必须观察到细胞间已经分离。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为

8.0、温度为37℃时，胰酶溶液的作用能力最强，针对不同细胞，建议初次消化时

均在显微镜下观察细胞形态以确定消化程度。使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质可降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks液。EDTA 可以螯合2价金属离子，故常用TE溶液。终止消化时，可用含有血清培养基或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用，利用培养基稀释也可以达到一定效果。

c.每次传代可以按1:3~1:10等比例进行，以ATCC数据建议和实际生长状况考虑，

请协商好细胞需要立即使用还是长期培养，合理保持培养箱中不同细胞的平板数量。

d.用一次性吸管吹匀细胞时，切勿产生大量气泡，在气泡破裂时产生的剪接力对活细

胞有致命威胁。建议吸管在吸取液体前尽量排空气体，缓慢松手以吸取更多液体，继而以合适的力度吹匀细胞。

细胞冻存

材料准备：

TE消化液、FBS、对应培养基、50ml离心管若干、15ml离心管若干、一次性吸管若干、专用冻存塑料管（1ml）等

实验步骤：

1、将细胞冻存液（10%DMSO+90%FBS)配好并放置冰箱预冷；

2、当10 cm培养皿中的RBMSC细胞汇合到80%-90%时，用胰蛋白酶将细胞消化下来，1200 rpm离心，去上清；

3、加入PBS重悬细胞，以洗去残留的胰蛋白酶，1200 rpm离心，去上清；

4、加入1ml细胞冻存液重悬后，将细胞重悬液放入冻存管中，冻存管必须将盖子盖紧，防止液氮侵入，并做好标记（细胞类型、培养代数、培养基、冻存时间、冻存人、编号）。按下列顺序梯度降温：室温→4℃（10~20min）→冰箱冷冻室-20℃（0.5~1.5h）→低温冰箱-80℃（过夜）→液氮罐-196℃（长期）（冰上转移）。

5、整理，做好冻存记录，在自己的笔记本和冻存记录本上均要记录（细胞信息、具体冻存位置、管数等）。