质粒提取步骤

煮沸法快速提取质粒以及DNA酶解和琼脂糖电泳

一．实验目的：

1、掌握质粒DNA 分离，纯化的原理

2、学习煮沸法快速提取质粒DNA 的方法

3、学习DNA的限制性酶切的基本技术

4 、学习利用琼脂糖电泳测定DNA片段的长度

二、实验原理

在基因工程中，DNA 分子的切割是由限制性内切酶来完成的。限制性内切酶能识别特定的DNA 序列，在一定的条件下切断双链DNA 。限制性内切酶的作用效率是受多方面因素影响的，如反应温度，缓冲体系，离子种类与浓度，DNA 的纯度和甲基化程度等。对DNA 进行酶切时，首先要选择适合的缓冲液。对于单酶切，应选用该酶的最适缓冲液；对于双酶切或三酶切，应选用一种能使所有酶都充分作用的缓冲液。DNA 的纯度对于酶切的效果的影响也很大，因为蛋白质。酚。氯仿。SDS 等杂质都会抑制限制性内切酶的活性。

琼脂糖凝胶电泳是分离，鉴定和纯化DNA 片段的常规方法。利用低浓度的荧光嵌入染料- 溴化乙锭进行染色，可确定DNA 在凝胶中的位置。如有必要，还可以从凝胶中回收DNA 条带，用于各种克隆操作。琼脂糖凝胶的分辨能力要比聚丙烯酰胺凝胶低，但其分离范围较广。用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp 至近50kbp 的DNA 。长度100kb 或更大的DNA ，可以通过电场方向呈周期性变化的脉冲电场凝胶电泳进行分离。

在基因工程的常规操作中，琼脂糖凝胶电泳应用最为广泛。它通常采用水平电泳装置，在强度和方向恒定的电场下进行电泳。DNA 分子在凝胶缓冲液（一般为碱性）中带负电荷，在电场中由负极向正极迁移。DNA 分子迁移的速率受分子大小，构象。电场强度和方向，碱基组成，温度和嵌入染料等因素的影响。

三．实验材料和试剂：

1．菌种：含pUC18 的大肠杆菌JM107 菌株。

2．化学试剂和溶液

（1）LB 培养基：

NaCl 10g/l 酵母提取物5g/l

胰蛋白胨10g/l 氨苄青霉素50 μ g/ml （培养基灭菌后加入）

pH7.0

（2）70% 乙醇（-20 ℃）及无水乙醇（-20 ℃）

（3）STET 缓冲液（pH8.0 ）（8% 蔗糖，0.5%Triton, 50mmol/L EDTA,,10mmol/L Tris ）

（4）5%CTAB （十六烷基三甲基溴化氨）

（5） 1.2M 氯化钠

（6）TE 缓冲液（10mmol/L Tris-HCl, 1mmol/L EDTA ）

（7）电泳缓冲液（50XTAE ）

Tris 242g，冰醋酸57.1ml，EDTA(0.5mol/LpH8.0) 100ml

使用时用蒸馏水稀释50 倍。

（8）样品缓冲液（6X ）

0.25% 溴酚蓝，0.25% 二甲苯青，40% （W/V ）蔗糖

（9）溴化乙锭10mg/ml

（10）琼脂糖（电泳级）

（11）限制性内切酶

（12）溶菌酶（50mg/ml ，溶于10mmol/L Tris-HCl ，pH 8.0 ）

3.仪器设备:

台式离心机、超净工作台、高压灭菌锅、恒温振荡培养箱、恒温水浴箱等。

Eppendorf 离心管，Tip 头，三角瓶等灭菌备用。

电泳仪，电泳槽，样品梳，微波炉，水浴锅，移液器（20ul, 200ul 和1000ul ），离心管，Tips(200ul,1000ul) 。

四．操作步骤：

1.质粒提取

（1）将2ml 含相应抗生素的LB 培养基加入到容量为15ml 的试管中，接种一单菌落，用棉塞封口，在37 ℃剧烈震荡（250rpm ）培养过夜。

（2）将1.5ml 培养物转入离心管中，用台式离心机在 4 ℃条件下离心30 秒（12,000 × g ）。

（3）弃上清液，用滤纸吸干离心管中的液体培养基，将细菌沉淀物悬浮于200 m l STET 缓冲液，用涡旋混合器充分混匀。

（4）加入4 m l 新鲜配制的溶菌酶液，混匀，置室温下5min 。

（5）用漂子架住离心管，置于沸水浴中，精确记时45 秒，取出后立刻离心10min 。

（6）用无菌牙签挑取离心管中的沉淀物弃去，离心管的上清液中加入8 m l 5%CTAB ，用混合器混匀后，高速离心5min ，弃上清液，用滤纸吸干离心管中的液体。

（7）加入1.2M 氯化钠300 m l ，充分溶解沉淀物，再加入750 m l 的冷乙醇，充分混匀后，离心15min ，弃上清液。

（8）取1ml 70% 冷乙醇，缓慢淋洗离心管内壁，离心5min 。弃上清液，用滤纸吸干管壁上的液体，置室温中使核酸沉淀自然干燥5-10min 。

（9 ）沉淀物溶于50 m l TE 缓冲液中，混合器混匀。

（9）即成质粒制备液，制备的质粒供下一步实验使用

2.DNA的酶解

设置DNA的酶切反应，按下列顺序加样（体积：m l ）：

反应管对照管

置备的质粒DNA 2 2

酶反应液（10 ′ ） 2 2

双蒸水15 16

限制性内切酶（5U）1 0

总体积20 20

加完反应液，混匀，离心1分钟，置于37 0 C水浴中，反应2小时。加入加样缓冲液（10 ′ ） 2 m l

3. 质粒DNA的琼脂糖电泳

1) 量取100毫升TAE电泳液，加入0.7克琼脂糖，混匀后，置于微波炉中，加热

3分钟，充分溶解琼脂糖。注意观察，当心煮沸的液体，溢出！

2) 用灭菌后的橡皮胶，封闭清洁干燥的电泳板，并用少量的琼脂糖液封边。安放梳子，调整梳子的底部边缘与电泳板之间的距离，一般以1-2毫米为宜。

3) 当溶解后的琼脂糖液冷却至50 0 C左右时，加入溴化乙锭5 m l ，溴化乙锭的最终浓度为1.0 m g/ml . 混匀后，将琼脂糖液倒入电泳板中，静止，切勿移动。