2种方法检测非小细胞肺癌EGFR基因突变的比较

万方数据 作者简介 ： 罗凯 ， 男， 主管检验ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ ， 主要从事肿瘤靶向治疗与耐药研究 。 △ 通讯作者 ， ： Ｅ ｍ ａ ｉ ｌ ｈ ｅ ｚ ｈ ｉ ｍ ｉ ｎ ２ ０ ０ ５＠ｙ ａ ｈ ｏ ｏ ． ｃ ｏ ｍ。
国际检验医学杂志２ ， ， ， ０ １ ３年１月第３ ４卷第２期 Ｉ ｎ ｔ ＪＬ ａ ｂＭ ｅ ｄ Ｊ ａ ｎ ｕ ａ ｒ ０ １ ３ Ｖ ｏ ｌ ． ３ ４ Ｎ ｏ ． ２ ｙ２
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国际检验医学杂志２ ， ， ， ０ １ ３年１月第３ ４卷第２期 Ｉ ｎ ｔ ＪＬ ａ ｂＭ ｅ ｄ Ｊ ａ ｎ ｕ ａ ｒ ０ １ ３ Ｖ ｏ ｌ ． ３ ４ Ｎ ｏ ． ２ ｙ２
· 临床检验研究论著 ·
２ 种方法检测非小细胞肺癌 Ｅ Ｇ Ｆ Ｒ 基因突变的比较
罗 凯１， 王 倩２， 刘季芳１， 潘东晓１， 薛兴阳１， 傅文凡１， 贺智敏１△ （ 广州医学院肿瘤研究所／广州医学院附属肿瘤医院 ， 广东广州 ５ １． １ ０ ０ ９ ５； 广州市中医医院病理科 ， 广东广州 ５ ） ２． １ ０ １ ３ ０
酪氨酸 激 酶 抑 制 剂 （ ） 类小分子靶向药物已进入 Ｅ Ｇ Ｆ Ｒ Ｔ Ｋ Ｉ Ｎ Ｓ Ｃ Ｌ Ｃ患 者 的 临 床 治 疗 并 取 得 良 好 的 疗 效。 许 多 研 究 表
２ ４］ ， 明［ Ｅ Ｇ Ｆ Ｒ基因 酪 氨 酸 激 酶 功 能 区 的 体 细 胞 基 因 突 变 与
其中约 Ｎ Ｓ Ｃ Ｌ Ｃ患者 Ｅ Ｇ Ｆ Ｒ Ｔ Ｋ Ｉ靶 向 治 疗 敏 感 性 密 切 相 关 ， ９ ０％ 的突变发生于 １ ９、 ２ １ 外显子上 ， Ｅ Ｇ Ｆ Ｒ Ｔ Ｋ Ｉ在突变患 者 中 的有效率可达 ７ 而在非突变患者中有效率仅１ ０％ 以 上 ， ０％ 左 右 。 因此检 测 Ｅ Ｇ Ｆ Ｒ 基因１ ９、 ２ １外显子突变对于指导临床 对 患者的靶向治疗具有重要意义 。 Ｅ Ｇ Ｆ Ｒ Ｔ Ｋ Ｉ Ｎ Ｓ Ｃ Ｌ Ｃ 目前临床应用的检测 Ｅ Ｇ Ｆ Ｒ基因突变的方法主要为测序 法和实时荧光 Ｐ 其中实时荧光 Ｐ Ｃ Ｒ 法， Ｃ Ｒ 法又分为 Ｔ ａ ｍ ａ ｎ ｑ 实时荧光 Ｐ 特异引物双扩增荧光 Ｐ 上述 Ｃ Ｒ 法、 Ｃ Ｒ 法 等 亚 类， 方法各有 优 缺 点 。 本 研 究 选 择 临 床 常 用 的 测 序 法 和 Ｔ ａ ｍ ａ ｎ ｑ 实时荧光 Ｐ 法 检 测 例 患 者 肿 瘤 组 织 基 Ｃ Ｒ ６ ０ Ｎ Ｓ Ｃ Ｌ Ｃ Ｅ Ｇ Ｆ Ｒ 因１ 并 分 析 结 果 间 的 差 异， 旨在为临床 ９、 ２ １ 外显子突变 情 况 ， 选择合适的 Ｅ Ｇ Ｆ Ｒ 基因突变检测方法提供实验依据 。 １ 资料与方法 １． １ 一 般 资 料 收 集 ２ ０ １ １年广州医学院附属肿瘤医院 其中石蜡切片样品４ Ｎ Ｓ Ｃ Ｌ Ｃ患者肿瘤组织样品 ６ ０ 例， ２ 例， 男性３ 女性２ 年龄３ ７ ５％ 乙醇固定组织样 品 １ ８ 例； ７ 例， ３， ４～ 中位年龄 ５ ７ ８岁， ８岁。
目的 比较测序法和 Ｔ 基因１ ａ ｍ ａ ｎ 实时荧光 Ｐ Ｃ Ｒ 法检测 表 皮 生 长 因 子 受 体 （ Ｅ Ｇ Ｆ Ｒ） ９、 ２ １外显子基因突变的一致 摘 要 ： ｑ 为寻找适宜临床应用的 Ｅ 应用测序法 性， Ｇ Ｆ Ｒ 基因突变检测方法提供实验依据 。 方法 收集 ６ ０例非小细胞肺癌患者肿瘤组织， 和Ｔ 比较两种方法的有效性 。 结果 两法检测 Ｅ ａ ｍ ａ ｎ 实时荧光 Ｐ Ｃ Ｒ 法分别检测 Ｅ Ｇ Ｆ Ｒ 基因 １ ９、 ２ １ 外显子基因突变 ， Ｇ Ｆ Ｒ 基因 ｑ ／ ） 和９ ／ ） ， 差异无统计学意义 （ ） 。 结论 ２ 种方法均可用 于 １ ９、 ２ １ 外显子突变结果符合率分别为 ９ ６． ７％ （ ５ ８ ６ ０ ８． ３％ （ ５ ９ ６ ０ Ｐ＞０． ０ ５ 测序法更适合指导临床分子靶向治疗 。 Ｅ Ｇ Ｆ Ｒ 基因 １ ９、 ２ １ 外显子突变检测 ， 关键词 ： 受体 ，表皮生长因子 ； 基因测序 ； 聚合酶链反应 ： ／ Ｄ Ｏ Ｉ １ ０． ３ ９ ６ ９ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ６ ７ ３ ４ １ ３ ０． ２ ０ １ ３． ０ ２． ０ １ ６ ｊ 文献标识码 ： Ａ 文章编号 ： （ ） １ ６ ７ ３ ４ １ ３ ０ ２ ０ １ ３ ０ ２ ０ １ ６ ２ ０ ３
１］ 是肺癌晚期 ， 具有较 差 的 预 后 ［ 。近 年 来， 表皮生长因子受体
１． ２ 仪 器 与 试 剂 测 序 法 、 Ｔ ａ ｍ ａ ｎ实时荧光 Ｐ Ｃ Ｒ 法检测 ｑ Ｅ Ｇ Ｆ Ｒ 基因 １ ９、 ２ １ 外显子 基 因 突 变 试 剂 盒 分 别 购 自 北 京 鑫 诺 美迪 科 技 有 限 公 司 、 北京金菩嘉医疗科技有限公司， 两法对应 的检测仪器 分 别 为 美 国 Ａ Ｂ Ｉ３ １ ３ ０ ｘ ｌ基 因 测 序 仪 和 Ａ Ｂ Ｉ７ ５ ０ ０ ｆ ａ ｓ ｔ实时荧光定量 Ｐ Ｃ Ｒ 仪。 １． ３ 方法 取 １． １． ３． １ 样品前处理 石蜡切片样 品 ： ５ｍ ＬＥ ｅ ｎ ｄ ｏ ｒ ｆ管 ｐ ｐ 加入 １ｍ １支， Ｌ 二甲 苯 。 依 据 组 织 大 小 与 肿 瘤 细 胞 含 量 取 石 蜡切片 ６～１ 每片滴加 １～２ 滴二甲苯 ， 取洁净手术 刀 片 刮 ５片， 取玻片上组织放入 Ｅ 振荡混匀后静置１ ， ｅ ｎ ｄ ｏ ｒ ｆ管 中 ， ０ｍ ｉ ｎ ｐ ｐ ， 弃上清液 。 重复以上步骤 用 １ ｍ １ ２０ ０ ０×ｇ 离心 ５ｍ ｉ ｎ Ｌ 二甲 苯洗涤样品 １ 次 ， 加入 １ｍ ， Ｌ 无水乙醇 ， １ ２０ ０ ０×ｇ 离 心 ５ ｍ ｉ ｎ 弃上清液 。 再使用无 水 乙 醇 重 复 洗 涤 样 品 １ 次 。 室 温 开 盖 静 置， 待无水乙醇彻底 挥 干 。７ 用洁净手 ５％ 乙 醇 固 定 组 织 样 品 ： 术刀于 送 检 肿 瘤 组 织 中 做 ４～６ 点 取 样 放 入 Ｅ ｅ ｎ ｄ ｏ ｒ ｆ管 中 ， ｐ ｐ 弃 上 清 液。室 温 开 盖 静 置， 待乙醇彻 ７ ５％ 乙醇洗涤样品 １ 次 ， 底挥干 。 １． ３． ２ 基因 组 Ｄ ＮＡ 提 取 使 用 天 根 口 腔 拭 子 基 因 组 Ｄ ＮＡ 提取试剂盒 ， 按试剂盒说明书操作步骤提取基因 组 Ｄ ， 提 取 ＮＡ 后测 Ｏ ／ Ｄ ２ ６ ０、 Ｏ Ｄ ２ ６ ０ Ｏ Ｄ ２ ８ ０ 评估 Ｄ ＮＡ 含量与纯度 。 阳性对照。依 １． ３． ３ Ｄ ＮＡ 测序突变检测 实验全程设置 阴 、 据试剂盒说明书 ， 利用 Ｐ Ｃ Ｒ 仪扩增 Ｅ Ｇ Ｆ Ｒ 基因 １ ９、 ２ １ 外显子 。 扩增引物如下 ： １ ９ Ｆ５ ′ Ｃ Ｃ Ｔ ＴＡＧ Ｇ Ｔ ＧＣ Ｇ ＧＣ Ｔ ＣＣ Ａ Ｃ ＡＧ Ｃ
Ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎｏ ｆＥ Ｇ Ｆ Ｒｍ ｕ ｔ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ｉ ｎｎ ｏ ｎ ｓ ｍ ａ ｌ ｌ ｃ ｅ ｌ ｌ ｌ ｕ ｎ ａ ｎ ｃ ｅ ｒ ｔ ｉ ｓ ｓ ｕ ｅ ｓｂ ｔ ｗ ｏｍ ｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｓ ｇｃ ｙ １ １ １ ， Ｌ ｕ ｏＫ ａ ｉ Ｗ ａ ｎ ｉ ａ ｎ２ ， Ｌ ｉ ｕＪ ｉ ａ ｎ Ｐ ａ ｎＤ ｏ ｎ ｘ ｉ ａ ｏ１ ， Ｘ ｕ ｅＸ ｉ ｎ ａ ｎ Ｆ ｕＷ ｅ ｎ ａ ｎ１ ， Ｈ ｅＺ ｈ ｉ ｍ ｉ ｎ１△ ｇＱ ｆ ｇ ， ｇ ｇ ｙ ｇ ， ｆ （ １． Ｇ ｕ ａ ｎ ｚ ｈ ｏ ｕＭ ｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌＵ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ａ ｎ ｃ ｅ ｒＩ ｎ ｓ ｔ ｉ ｔ ｕ ｔ ｅａ ｎ ｄＨ ｏ ｓ ｉ ｔ ａ ｌ， Ｇ ｕ ａ ｎ ｚ ｈ ｏ ｕ， Ｇ ｕ ａ ｎ ｄ ｏ ｎ １ ０ ０ ９ ５， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ； ｇ ｙＣ ｐ ｇ ｇ ｇ５ ２． Ｄ ｅ ａ ｒ ｔ ｍ ｅ ｎ ｔ ｏ ａ ｔ ｈ ｏ ｌ ｏ Ｇ ｕ ａ ｎ ｚ ｈ ｏ ｕＨ ｏ ｓ ｉ ｔ ａ ｌ ｏ ｒ ａ ｄ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｌＣ ｈ ｉ ｎ ｅ ｓ ｅＭ ｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｎ ｅ， Ｇ ｕ ａ ｎ ｚ ｈ ｏ ｕ， Ｇ ｕ ａ ｎ ｄ ｏ ｎ １ ０ １ ３ ０， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ） ｐ ｆＰ ｇ ｙ， ｇ ｐ ｆＴ ｇ ｇ ｇ５ ： Ａ ｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ Ｏ ｂ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ ｏｃ ｏ ｍ ａ ｒ ｅＤ ＮＡｓ ｅ ｕ ｅ ｎ ｃ ｉ ｎ ｎ ｄＴ ａ ｍ ａ ｎｒ ｅ ａ ｌ ｔ ｉ ｍ ｅＰ Ｃ Ｒｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｉ ｎ Ｇ Ｆ Ｒｅ ｘ ｏ ｎ１ ９ａ ｎ ｄ２ １ｍ ｕ ｔ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ｉ ｎｏ ｒ Ｔ ｐ ｑ ｇａ ｑ ｇＥ ｊ ｄ ｅ ｒ ｔ ｏｆ ｉ ｎ ｄａｓ ｕ ｉ ｔ ａ ｂ ｌ ｅｃ ｌ ｉ ｎ ｉ ｃ ａ ｌ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎｍ ｅ ｔ ｈ ｏ ｄｏ ｆｇ ｅ ｎ ｅｍ ｕ ｔ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ． Ｍ ｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｓ ｏｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔＥ Ｇ Ｆ Ｒｅ ｘ ｏ ｎ１ ９ａ ｎ ｄ２ １ｍ ｕ ｔ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ｉ ｎ６ ０ｎ ｏ ｎ Ｔ ｓ ｍ ａ ｌ ｌ ｃ ｅ ｌ ｌ ｌ ｕ ｎ ａ ｎ ｃ ｅ ｒｐ ａ ｔ ｉ ｅ ｎ ｔ ｓｂ ＮＡｓ ｅ ｕ ｅ ｎ ｃ ｉ ｎ ｎ ｄＴ ａ ｍ ａ ｎｒ ｅ ａ ｌ ｔ ｉ ｍ ｅＰ Ｃ Ｒａ ｎ ｄｔ ｏａ ｎ ａ ｌ ｚ ｅｔ ｗ ｏｍ ｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｓ ′ｅ ｆ ｆ ｉ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ． Ｒ ｅ ｓ ｕ ｌ ｔ ｓ ｇｃ ｙＤ ｑ ｇａ ｑ ｙ ｙ （ ） Ｔ ｈ ｅ ｒ ｅｗ ａ ｓｎ ｏｓ ｉ ｎ ｉ ｆ ｉ ｃ ａ ｎ ｔ ｄ ｉ ｆ ｆ ｅ ｒ ｅ ｎ ｃ ｅｂ ｅ ｔ ｗ ｅ ｅ ｎ ｔ ｗ ｏｍ ｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｓ ｉ ｎｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｉ ｎ Ｇ Ｆ Ｒｅ ｘ ｏ ｎ１ ９ａ ｎ ｄ２ １ｍ ｕ ｔ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ Ｐ＞０． ０ ５ ａ ｎ ｄ ｔ ｈ ｅ ｒ ｅ ｓ ｕ ｌ ｔ ｃ ｏ ｇ ｇＥ ／ ） ／ ） ， ｉ ｎ ｃ ｉ ｄ ｅ ｎ ｃ ｅｒ ａ ｔ ｅ ｓｏ ｆ ｅ ｘ ｏ ｎ１ ９ａ ｎ ｄ２ １ｍ ｕ ｔ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎｗ ｅ ｒ ｅ９ ６． ７％ （ ５ ８ ６ ０ ａ ｎ ｄ９ ８． ３％ （ ５ ９ ６ ０ ｒ ｅ ｓ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ ｌ ． Ｃ ｏ ｎ ｃ ｌ ｕ ｓ ｉ ｏ ｎ ＮＡｓ ｅ Ｄ ｐ ｙ ｕ ｅ ｎ ｃ ｉ ｎ ｎ ｄＴ ａ ｍ ａ ｎＲ ｅ ａ ｌ ｔ ｉ ｍ ｅＰ Ｃ Ｒａ ｌ ｌ ｃ ｏ ｕ ｌ ｄｂ ｅｕ ｓ ｅ ｄｆ ｏ ｒｍ ｕ ｔ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎｏ ｆＥ Ｇ Ｆ Ｒｅ ｘ ｏ ｎ１ ９ａ ｎ ｄ２ １． Ｄ ＮＡｓ ｅ ｕ ｅ ｎ ｃ ｉ ｎ ｓｍ ｏ ｒ ｅ ｑ ｇａ ｑ ｑ ｇｉ ｓ ｕ ｉ ｔ ａ ｂ ｌ ｅ ｆ ｏ ｒｇ ｕ ｉ ｄ ｉ ｎ ｈ ｅｃ ｌ ｉ ｎ ｉ ｃ ａ ｌｍ ｏ ｌ ｅ ｃ ｕ ｌ ａ ｒ ｔ ａ ｒ ｅ ｔ ｅ ｄｔ ｈ ｅ ｒ ａ ． ｇｔ ｇ ｐ ｙ ： ， ； ｅ ｎ ｅｓ ｅ ｕ ｅ ｎ ｃ ｉ ｎ ｏ ｌ ｍ ｅ ｒ ａ ｓ ｅｃ ｈ ａ ｉ ｎｒ ｅ ａ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ Ｋ ｅ ｏ ｒ ｄ ｓｒ ｅ ｃ ｅ ｔ ｏ ｒｅ ｉ ｄ ｅ ｒ ｍ ａ ｌ ｒ ｏ ｗ ｔ ｈｆ ａ ｃ ｔ ｏ ｒ ｇ ｐ ｑ ｇ； ｙ ｐ ｐ ｇ ｙｗ 非小细胞肺癌 肺癌是威胁人类健康的主要恶性肿瘤之一 ， （ 约占肺癌的 ８ 很多 Ｎ Ｎ Ｓ Ｃ Ｌ Ｃ） ０％ 以上 ， Ｓ Ｃ Ｌ Ｃ 患者在确诊时已