绿色荧光蛋白
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Osamu Shimomura
Martin Chalfie
Roger Y. Tsien （钱永健） 钱永健）
2008年10月8日，美Woods Hole海洋生物 年 月 日 海洋生物 学实验室的下村修、哥伦比亚大学的马丁-沙 学实验室的下村修、哥伦比亚大学的马丁 沙 尔菲和加州大学圣地亚哥分校的钱永健三位 美国科学家， 美国科学家，因为在水母中发现和研究绿色 荧光蛋白而获得2008年诺贝尔化学奖。 年诺贝尔化学奖。 荧光蛋白而获得 年诺贝尔化学奖
潘多拉的魔盒 ——绿色荧光蛋白 ——绿色荧光蛋白
一、GPF的发现 GPF的发现 二、GPF的优点 GPF的优点 三、GPF的应用 GPF的应用
一、GPF的发现 GPF的发现
GFP发现之旅 GFP发现之旅
1962年，下村修首次从维多利亚多管水母 年 Aequorea victoria 中分离出 中分离出GFP。他发现该蛋白 。 在紫外线下会发出明亮的绿光。 在紫外线下会发出明亮的绿光。 1992年，道格拉斯 普瑞舍克隆并测定了水 年 道格拉斯·普瑞舍克隆并测定了水 母中绿色荧光蛋白的基因。 母中绿色荧光蛋白的基因。 1993年 1993年， Martin Chalfie证明了GFP作为多种 Chalfie证明了 证明了GFP作为多种 生物学现象的发光遗传标记的价值。 生物学现象的发光遗传标记的价值。在最初的一 项实验中，他用GFP使秀丽隐杆线虫的 个单独细 使秀丽隐杆线虫的6个单独细 项实验中，他用 使秀丽隐杆线虫的 胞有了颜色。 胞有了颜色。 1994年，钱永健开始改造荧光蛋白，培育出 年 钱永健开始改造荧光蛋白， 黄色、蓝色、绿色、红色等多种颜色的荧光蛋白， 黄色、蓝色、绿色、红色等多种颜色的荧光蛋白， 理解了GFP发出荧光的机制。世界上目前使用的 发出荧光的机制。 理解了 发出荧光的机制 荧光蛋白大多是钱永健实验室改造后的变种。 荧光蛋白大多是钱永健实验室改造后的变种。令 在同一时间跟踪多个不同的生物学过程成为现实。 在同一时间跟踪多个不同的生物学过程成为现实。 钱永健还开发了检测荧光蛋白的荧光探针技术。 钱永健还开发了检测荧光蛋白的荧光探针技术。
科学使用绿色荧光蛋白跟踪大 脑神经细胞的发育过程。 脑神经细胞的发育过程。
3. 筛选新的药物 同时使用不同颜色的GFP 衍生物标记 相关的蛋白质,来观察单细胞内相互作用的 靶蛋白,再借助于荧光激活细胞分离器,等焦 显微镜分离出目的细胞,从而可方便地用于 大规模筛选新的药物。
4. 跟踪观察病原菌 由于病原菌表达GFP ,可用荧光法定量 地检测病原菌的增殖情况
5. 用于临床检验 可采用基因工程的方法生产GFP 标记的 抗原或抗体,以取代传统的免疫学标记方法, 建立一种简便、快速的免疫诊断新技术
应用GFP研究成果 应用GFP研究成果 GFP
美新奥尔良科学家培育出世界首只能在“黑暗处发光” 美新奥尔良科学家培育出世界首只能在“黑暗处发光”的猫
1997年在大阪大学降生的第 年在大阪大学降生的第 一种发光哺乳动物小老鼠
3. 使用方便可行活细胞实时定位观察 通过GFP 可实时观察到外界信号刺激下, 目的蛋白的变化过程。用普通荧光显微镜 就能观察,借助于近年来广泛使用的激光扫 描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope) ,使研究更为方便。
4. 突变蛋白可显著改善荧光特性 用PCR 和羟胺突变的方法,可以得到发 不同荧光的突变型GFP ,可方便地对不同的 蛋白进行双标记。
Aequorea victoria的水母 的水母
绿色荧光蛋白
当7-香豆素这 香豆素这 种蓝色荧光探 针进入细胞后， 针进入细胞后， 连接酶将它与 目的蛋白上的 短标签相连。 短标签相连。 这便使融合荧 光蛋白发出可 见荧光
原 理 ：
原理： 原理：在导入目 的基因的同时也 将编码这种酶的 基因导入细胞。 基因导入细胞。 还在目的基因上 加上了一个短的 标签（ 个氨基 标签（13个氨基 ），此标签让 酸），此标签让 连接酶识别蛋白 随后， 随后，目的蛋白质与 荧光基团蛋白质同时 产生
杰夫·利希曼利用荧光蛋白展 杰夫 利希曼利用荧光蛋白展 现了大脑内的连接， 现了大脑内的连接，图片中 美丽的“彩虹”就是神经系 美丽的“彩虹” 统网络
两只荧光猪诞生于中国 黑龙江省哈尔滨东北农 业大学的实验室
约克镇科技公司生产的荧光 鱼引入市场， 鱼引入市场，荧光蛋白便迅 速在商业上得到应用
用不同的“荧光蛋白” 用不同的“荧光蛋白”让未知世界显 作为报告基因,在转基因动物研 究中有广泛的用途。不用破碎组织或外 加底物,通过荧光显微镜就能显示目的 基因在动物中的表达情况。
报告基因(reporter gene) 一种编码可被检查的蛋白质或酶的基因，其表 达产物很容易被鉴定出来。
2. 发育分子机理研究 GFP 可以作为活体标记, 在原位观察细 胞的生长和运动。
绿色荧光蛋白
这种蛋白质最早是由下村脩等人在 这种蛋白质最早是由下村脩等人在1962年在一种学名 年在一种学名 Aequorea victoria的水母中发现。其基因所产生的蛋白质，在蓝 的水母中发现。 的水母中发现 其基因所产生的蛋白质， 色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。 色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。
二、GPF的优点 GPF的优点
1.不加任何底物 荧光性质稳定 不加任何底物, 不加任何底物 GFP 不象其它荧光素,荧光容易消失， 在50～490 nm 蓝光激发下,GFP 荧光至少 能保持10 min 以上。
2. 分子量小 对细胞无毒性 分子量小,对细胞无毒性 GFP 相对分子质量仅为27000，根据 目前所有研究结果,GFP 对目的基因的功 能没有影响,大量表达对细胞也没有毒性, 细胞仍可连续传代培养。
Martin Chalfie
Roger Y. Tsien （钱永健） 钱永健）
2008年10月8日，美Woods Hole海洋生物 年 月 日 海洋生物 学实验室的下村修、哥伦比亚大学的马丁-沙 学实验室的下村修、哥伦比亚大学的马丁 沙 尔菲和加州大学圣地亚哥分校的钱永健三位 美国科学家， 美国科学家，因为在水母中发现和研究绿色 荧光蛋白而获得2008年诺贝尔化学奖。 年诺贝尔化学奖。 荧光蛋白而获得 年诺贝尔化学奖
潘多拉的魔盒 ——绿色荧光蛋白 ——绿色荧光蛋白
一、GPF的发现 GPF的发现 二、GPF的优点 GPF的优点 三、GPF的应用 GPF的应用
一、GPF的发现 GPF的发现
GFP发现之旅 GFP发现之旅
1962年，下村修首次从维多利亚多管水母 年 Aequorea victoria 中分离出 中分离出GFP。他发现该蛋白 。 在紫外线下会发出明亮的绿光。 在紫外线下会发出明亮的绿光。 1992年，道格拉斯 普瑞舍克隆并测定了水 年 道格拉斯·普瑞舍克隆并测定了水 母中绿色荧光蛋白的基因。 母中绿色荧光蛋白的基因。 1993年 1993年， Martin Chalfie证明了GFP作为多种 Chalfie证明了 证明了GFP作为多种 生物学现象的发光遗传标记的价值。 生物学现象的发光遗传标记的价值。在最初的一 项实验中，他用GFP使秀丽隐杆线虫的 个单独细 使秀丽隐杆线虫的6个单独细 项实验中，他用 使秀丽隐杆线虫的 胞有了颜色。 胞有了颜色。 1994年，钱永健开始改造荧光蛋白，培育出 年 钱永健开始改造荧光蛋白， 黄色、蓝色、绿色、红色等多种颜色的荧光蛋白， 黄色、蓝色、绿色、红色等多种颜色的荧光蛋白， 理解了GFP发出荧光的机制。世界上目前使用的 发出荧光的机制。 理解了 发出荧光的机制 荧光蛋白大多是钱永健实验室改造后的变种。 荧光蛋白大多是钱永健实验室改造后的变种。令 在同一时间跟踪多个不同的生物学过程成为现实。 在同一时间跟踪多个不同的生物学过程成为现实。 钱永健还开发了检测荧光蛋白的荧光探针技术。 钱永健还开发了检测荧光蛋白的荧光探针技术。
科学使用绿色荧光蛋白跟踪大 脑神经细胞的发育过程。 脑神经细胞的发育过程。
3. 筛选新的药物 同时使用不同颜色的GFP 衍生物标记 相关的蛋白质,来观察单细胞内相互作用的 靶蛋白,再借助于荧光激活细胞分离器,等焦 显微镜分离出目的细胞,从而可方便地用于 大规模筛选新的药物。
4. 跟踪观察病原菌 由于病原菌表达GFP ,可用荧光法定量 地检测病原菌的增殖情况
5. 用于临床检验 可采用基因工程的方法生产GFP 标记的 抗原或抗体,以取代传统的免疫学标记方法, 建立一种简便、快速的免疫诊断新技术
应用GFP研究成果 应用GFP研究成果 GFP
美新奥尔良科学家培育出世界首只能在“黑暗处发光” 美新奥尔良科学家培育出世界首只能在“黑暗处发光”的猫
1997年在大阪大学降生的第 年在大阪大学降生的第 一种发光哺乳动物小老鼠
3. 使用方便可行活细胞实时定位观察 通过GFP 可实时观察到外界信号刺激下, 目的蛋白的变化过程。用普通荧光显微镜 就能观察,借助于近年来广泛使用的激光扫 描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope) ,使研究更为方便。
4. 突变蛋白可显著改善荧光特性 用PCR 和羟胺突变的方法,可以得到发 不同荧光的突变型GFP ,可方便地对不同的 蛋白进行双标记。
Aequorea victoria的水母 的水母
绿色荧光蛋白
当7-香豆素这 香豆素这 种蓝色荧光探 针进入细胞后， 针进入细胞后， 连接酶将它与 目的蛋白上的 短标签相连。 短标签相连。 这便使融合荧 光蛋白发出可 见荧光
原 理 ：
原理： 原理：在导入目 的基因的同时也 将编码这种酶的 基因导入细胞。 基因导入细胞。 还在目的基因上 加上了一个短的 标签（ 个氨基 标签（13个氨基 ），此标签让 酸），此标签让 连接酶识别蛋白 随后， 随后，目的蛋白质与 荧光基团蛋白质同时 产生
杰夫·利希曼利用荧光蛋白展 杰夫 利希曼利用荧光蛋白展 现了大脑内的连接， 现了大脑内的连接，图片中 美丽的“彩虹”就是神经系 美丽的“彩虹” 统网络
两只荧光猪诞生于中国 黑龙江省哈尔滨东北农 业大学的实验室
约克镇科技公司生产的荧光 鱼引入市场， 鱼引入市场，荧光蛋白便迅 速在商业上得到应用
用不同的“荧光蛋白” 用不同的“荧光蛋白”让未知世界显 作为报告基因,在转基因动物研 究中有广泛的用途。不用破碎组织或外 加底物,通过荧光显微镜就能显示目的 基因在动物中的表达情况。
报告基因(reporter gene) 一种编码可被检查的蛋白质或酶的基因，其表 达产物很容易被鉴定出来。
2. 发育分子机理研究 GFP 可以作为活体标记, 在原位观察细 胞的生长和运动。
绿色荧光蛋白
这种蛋白质最早是由下村脩等人在 这种蛋白质最早是由下村脩等人在1962年在一种学名 年在一种学名 Aequorea victoria的水母中发现。其基因所产生的蛋白质，在蓝 的水母中发现。 的水母中发现 其基因所产生的蛋白质， 色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。 色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。
二、GPF的优点 GPF的优点
1.不加任何底物 荧光性质稳定 不加任何底物, 不加任何底物 GFP 不象其它荧光素,荧光容易消失， 在50～490 nm 蓝光激发下,GFP 荧光至少 能保持10 min 以上。
2. 分子量小 对细胞无毒性 分子量小,对细胞无毒性 GFP 相对分子质量仅为27000，根据 目前所有研究结果,GFP 对目的基因的功 能没有影响,大量表达对细胞也没有毒性, 细胞仍可连续传代培养。