细胞培养

3、看护培养法
• 3-1 看护培养的含义及用途
含义：指用一块活跃生长的愈伤组织来
看护单个细胞，并使其生长和增殖的方 法。 用途；诱导形成单细胞系。 • Muir(1954)首先用此法培养出烟草单细 胞株。Sharp(1972)成功将此法用于番茄 的花粉培养，诱导花粉形成单倍体细胞 系。 51
看护培养（Nurse culture）图示：
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培 养 细 胞 数 目
5 4
3 1 2
培养时间
1 滞后期
2 3 4 5 对数生长期 直线生长期 缓慢期 静止期
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讨论 （1）滞后期的长短主要取决于在继
代时原种培养细胞所处的生长期和转入细胞数 量的多少。 （2）加入条件培养基可以缩短滞后期。 条件培养基：曾培养过一段时间组织或细胞的 培养基。 （3）缩短两次继代时间间隔，则可使悬浮培 养的细胞一直保持对数生长期。 （4）如果使处在静止期的细胞悬浮液保持时 30 间太长，则会引起细胞的大量死亡和解体。
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One of the most widely used method for single cell cultrue
固体培养基
Think over what the advantages and disadvantages are for it.
2-2 特点 可以定点观察； 分离单细胞系比液体浅层培养容易； 培养细胞气体交换不畅。
加果胶酶
过滤、离心
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1-3、 机械法和酶解法比较
机械法
1. 细胞不受到酶的伤害； 2. 不用质壁分离； 3. 细胞产量低； 4. 细胞易破。 1. 细胞受到酶的伤害； 2. 要质壁分离； 3. 细胞产量高； 4. 细胞不易破。
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酶解法
2、由培养组织分离单细胞
茎段
步骤： 1 诱导产生愈伤组织； 2 愈伤组织反复继代， 使组织不断增殖，提 高愈伤组织的松散性；
研究材料： 花生成熟叶片
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撕去下表皮
具体方法
露出叶肉细胞
用解剖刀刮下细胞
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第二种方法：叶片研碎、离心
加研磨介质
研碎成粉 过滤、离心
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只有薄壁组织排列松散，细胞间结触点 很少时用机械法分离叶肉细胞才能取得 成功。
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1-2、 酶解法
Takebe等（1968）最早报道：用果胶酶处 理可以分离大量的叶肉细胞
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继代
悬浮
步骤：
3（Suspension culture) 将愈伤组织在液体培养 基中培养，建立悬浮培 养物
摇床用于振荡
优点：细胞团成小 细胞团或单细胞； 在培养基中均匀分 布；有空气交流。 15
注意：大麦，小麦和玉米，很难通过酶解
法使细胞分离。（叶肉细胞伸长，并在许 多地方收缩，细胞间链状互锁结构）
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FDA先用丙酮配成0.5%的母液，终浓度为0.01%
请思考
FDA
荧光素 死细胞 活细胞 死细胞
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活细胞
三、单细胞培养（Single cell culture）
液体浅层培养法 固体平板培养法
看护培养法
微室培养法
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1、液体浅层培养法
将悬浮在培养液中的细胞过滤，得到游离单细 胞和小细胞团 培养在浅层液体培养基中
液体培养基
用途：主要用来增殖细胞。
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特点：
有利于有毒物质的扩散； 有利于气体交换； 不利于定点观察； 单细胞生长、分裂后，难以得到单 细胞系。
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2、固体平板培养法
• 2-1 含义及用途： • 含义： 是将单个细胞与融化的琼脂 培养基均匀混合后平铺一薄层在培 养皿底上的培养方法。该方法是 Bergmann(1960年)首创。 • 用途：是为了分离单细胞无性系， 研究其生理、生化遗传上的差异而 设计的一种单细胞培养技术。广泛 应用于细胞、原生质体及融合产物 的培养。
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2-3 平板培养的基本技术
(1)、培养基配制 1.4%琼脂基本培养基+等
量细胞培养液=0.7 % 琼脂条件培养基。 （2）悬浮细胞密度的调制
平板培养要求最初细胞密度（即初始植板
密度）为1×10 ³ 100×10 ³ ~ 个/ml 。 初始植板密度：单细胞固体平板培养时，细 胞悬浮液接种到琼脂培养基上最初细胞密度。
Good Morning
1
第5章
细胞培养
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细胞培养内容包括两方面 悬浮培养 促进细胞生长和生物合成 单细胞培养 促进细胞生长和形成完整植株
获得单细胞的方法 悬浮培养 单细胞培养
3
植物组织培养探索阶段（1902-1929年）
Haberlandt：
观点： 高等植物的组织和器官可以分割成单个细胞
首次进行离体细胞培养
小野芝麻和凤眼兰的栅栏细胞和虎眼万年青属表皮细胞
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《关于单离植物细胞培养实验》
我愿意指出：在我的培养实验中，虽然经常 观察到细胞的明显生长，但从未观察到细胞分 裂。发现单细胞培养的条件，将是未来培养试 验的难题。
1. 取材问题－高度分化的细胞。 2. 培养基问题－过于简单，没有诱导成熟细胞 分裂所必须的生长激素
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连续培养意义：
植物细胞代谢调节的研究（某种生长限速 浓度－细胞生长的影响）； 次生物质的大量生产。
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3、悬浮培养中细胞生长量的计算
细胞计数 5％铬酸或0.25％果胶酶使悬浮细胞团分散 用血球计数板进行。 细胞密实体积（PCV）
将体积已知、均匀分散的悬浮液放入一 个 15ml 的离心管中，2000转下离心，用 每ml培养液中细胞总体积的ml数表示。
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2.1.2
•
特点
培养基体积固定 • 培养过程中，细胞生长，其数 目不断发生变化，呈S增长。 • 必须适当搅拌
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2.1.3 继代的方法和最佳时期
• 继代方法： 用注射器或移管吸取
一定量的含单细胞和小细胞团的悬 浮培养物，并移到含有新鲜培养基 的培养瓶里，继续进行培养。
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继代
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最佳继代时期：了解细胞数目增长
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• 3-4 特点：
（1）效果好，易于成功。 （2）简便易行。 （3）不能在显微镜下直接观察细胞的生 长过程。
• 注意：要得到单细胞系必须保证
• 接种材料是真正的单细胞。
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4、微室培养法
4-1 微室培养的含义及用途
含义：即将细胞培养在很少量的培养基
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二、悬浮培养Suspension culture
特点 1. 细胞可以不断增殖，形成高密度的细 胞群体，适于大规模培养； 2. 能够提供大量较为均匀的细胞，为研 究细胞的生长、分化创造方法和条件。
必须指出
悬浮培养中既有单细胞，也有细胞团。
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1、起始悬浮液的制备
转速30-150rpm 2-3cm冲程
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一、单细胞的分离
由完整的植物器官分离单细胞 由培养组织中分离单细胞
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1、由完整的植物器官分离单细胞
叶片是分离单细胞的最好材料
机械法 酶解法
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1-1、 机械法
第一种方法：用刀片刮叶片 研究者和时间：Ball&Joshi (1965)、 Noggle (1967)、Joshi &Ball (1968)
3-3 要求：
（1）看护愈伤组织处于活跃生长状态； （2）愈伤组织和所要培养的细胞可以是同 一个物种也可以不同。 离体单细胞在直接培养技术下不分裂，看 护培养下则分裂，为什么？
Nurse callus provides nutrition and other substances that enhances cell division. （营养物质和促进细胞分裂物质）
操作注意事项： 对悬浮培养细胞继代时，进液口的孔径 要小，只能通过单细胞或小细胞团（24细胞），使用吸管或注射器。
继代前，培养容器静置短时间，大细胞 团沉降，再吸上层悬浮液。
依此，多次，可建立良好的细胞悬浮培 养物。
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观察细胞染色体 • 在对数生长期
18 chromosomes
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2-2、连续培养（Continuous culture）
细胞鲜重 细胞干重
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细胞鲜重：细胞培养物过滤，洗去培养 基，真空抽虑，称重。
细胞干重：以每毫升培养物或106个细 胞的重量表示。 60℃干燥12小时，称重。
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4、培养细胞活力的测定 相差显微术法
观察细胞质环流和细胞核存在与否，环流正 常、核存在表明有活力；
TTC法（2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑）
变化S形曲线后，选择对数生长期
和直线 生长期！
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2.1.4 细胞生长曲线
• 在整个培养过程中，细胞数目 不断发生变化，呈现出明显的由慢 到快，再到慢，最后增长停止的细 胞周期。细胞的生长呈S型曲线
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培 养 细 胞 数 目
S形曲线
5
4
3 1
2
培养时间
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细胞生长各个时期的特点：
细胞很少分裂，其长短与接种量大 滞后期（延迟期） 小和继代时原种细胞所处的生长期有关 对数生长期 细胞分裂活跃，细胞数目增加，增长 速率保持不变 直线生长期 细胞生长和发育最明显的时期 缓慢期 生长逐渐缓慢：培养液消耗将尽， 有毒代谢物质增多，氧气减少 静止期 生长几乎处于停止状态，细胞数目增加 极少，甚至开始死亡。
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若悬浮液与培养基以1:4混合， 则应把悬浮液的细胞密度调到 5×10 ³ 500×10 ³ ~ 个/ml。
调制方法：若悬浮液中细胞密度高，
则加培养液稀释；若悬浮液中细胞密 度过低，则通过离心使细胞沉淀后， 取一定量的上清液使其达到所要求 的密度。
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（3）制平板：细胞悬浮液与融化状态（35 ℃ ）条件培养基按一定比例均匀混合， 倒成平板，盖上培养皿盖。用封口膜封 严培养皿。 (4) 培养： 26℃置暗处培养21天。低倍显 微镜观察， 记数单细胞或小细胞团，计 算置板效率（也称植板率）。
恒温 培养1 个月
Single cell Filter paper
2~3月
Nurse callus
单细胞无性系
用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并使 其生长和增殖。这个愈伤组织称块为看护愈伤组织
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3-2 看护培养基本技术
（1）在一个培养瓶中加入一定量厚的固 体培养基，灭菌后备用。 （2）在无菌的条件下，先将一小块 （1cm）活跃生长的愈伤组织接种到培 养基上，再在愈伤组织块上放一片 （1cm² ）已灭菌的滤纸，然后放置一个 晚上。 （3）将分离出的单个细胞接种到培养基 的滤纸上。 （4）恒温培养。 53
防细胞破裂
愈伤组织
液体培养基
摇床振荡 悬浮培养
质地疏松，细胞分散程度大； 质地紧密，细胞分散程度小，不适于悬浮培养
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2、悬浮培养的基本形式
分批培养 连续培养
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2-1、分批培养/成批培养（Batch culture）
2.1.1 含义：将愈伤组织培养在一 定容积的密闭容器中进行培养。它 是进行细胞生 长和细胞分裂的生理 生化研究常用的培养方法。 但要进行下一批培养，则生长一定 时间后，需要继代转移。
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植板效率（或植板率）：已形成细胞团 的百分数（即每100个铺在平板上的细胞 中有多少个能长出细胞团）。 • 每个平板上形成的细胞团数 该平板上接种的细胞数
植板效率=
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2-4 平板培养必须注意的方面
（1）选用的培养基，无论是否条件培养 基，必须是能够在低的初始植板密度下 使细胞生长。 （2）不要选用处在静止期过久的细胞。 因为处在分裂旺盛时期的细胞才有最高 的植板率。 （3）在固体培养基中适宜的初始植板密 度因植物种类而不同。如：烟草细胞适 宜的为5~10 ×10 ³ 个/ml,若低于此数则植 板率显著下降。 （4）接种时培养基的温度要控制，一般 50 不超过35 ℃ 。
在活细胞中，TTC被还原成红色甲鐟，提取 分光光度计检测。
FDA法（荧光素双醋酸酯法） 伊凡蓝法
互补
活力受损的细胞能够摄取，完整的活细胞则 38 不能，凡染蓝色的细胞是不具有活力的细胞
FDA法的原理
FDA本身不具有极性，不能发出荧光，可以 自由出入细胞膜。 在活细胞中，FDA被酯酶裂解，释放出有极 性的荧光素。 荧光素不能自由穿越质膜，在活细胞中积累。 荧光素在死细胞中不能积累。 在UV照射下，活细胞中的荧光素发出绿色荧 光。
加入培养基
二者体积相等
排出培养基及其培养物
分：开放式连续培养（Open C.C）
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封闭式连续培养（Closed C.C）
开放式和封闭式区别
封闭式中：排出液中的细胞用机械方法 收集后，又放入原培养基，所以其培养细 胞数目不断增加；
开放式中：在注入新鲜培养基的同时， 培养细胞随同培养液一起流出，培养细胞 数目保持恒定；通过调节流入和流出的速 度，使培养物的生长速度永远保持接近最 高值的恒定水平上。