缓冲液及组织固定液的配制

缓冲液及组织固定液的配制

1、磷酸盐缓冲液的配制

关于缓冲溶液PB的配制，好多参考书如生物技术实验的后面均附有缓冲溶液的配制配方，可以根据需要配制pH5.7～8.0的磷酸盐缓冲。磷酸盐缓冲液称简PB，加NaCl（氯化钠）的称PBS，加KCl（氯化钾）、NaCl（氯化钠）的称KPBS。S就是指氯化钠的含量，一般为0.85％，即是100ml里面加0.85克，这个时候的PBS的浓度是0.1M的。一般在免疫组化洗涤中采用0.01M的PBS，pH7.0～7.4。我们在实验中直接将0.1M的稀释十倍，即可。最好能现配现用。母液4℃可以保持1～2周，影响不大。

成份

分子量

（MW）

浓度（g/1000mL）

0.01M PBS①0.1M PBS0.1M PB

Na2HPO4·12H2O 358.14 2.684 29.009 29.009

NaH2PO4·2H2O 156.01 0.39 2.964 2.964

NaCl 58.44 8.5 8.5~9 /

pH值/ 7.4 7.4 7.4

注：①配方来自网上。

2、组织固定液的配制

2.1、4%多聚甲醛-0.1M磷酸缓冲液[1]（pH=7.3）：多聚甲醛40g，置于三角烧瓶中，加入500~800mL 0.1M的磷酸缓冲液（PB），加热至60℃左右，持续搅拌（或磁力搅拌）至粉末完全溶解，通常需要滴加少许1N NaOH才能使溶液澄清，最后补足0.1M PB至1000mL，充分混匀。该固定试剂适用于光镜免疫细胞化学研究，因较温和，适用于组织标本的较长期保存。

2.2、10%中性缓冲福尔马林固定液[2]：甲醛溶液（37~40%）100mL，蒸馏水900mL，NaH2PO4（磷酸二氢钠）4g，Na2HPO4（磷酸氢二钠）6.5g，混合摇匀后调pH至7.2~7.4。

2.3、10%福尔马林固定液配制[2]：甲醛溶液（37~40%）100mL，自来水900mL，混合后在溶液中加入碳酸钙使溶液呈中性或偏碱性。

2.4、10%中性甲醛液[3]：甲醛原液100mL，0.01M PBS 1000mL（磷酸缓冲液pH 7.4）。

2.5、4%多聚甲醛液[3]：多聚甲醛40g，0.01M PBS 1000mL（磷酸缓冲液pH 7.4）。

3、骨组织脱钙

犬、山羊、兔股骨头、长骨及大鼠、小鼠长骨做切片染色观察前，必须先将骨组织中钙质脱尽、使骨组织变软后才可制成切片，这一过程称之为“脱钙”。常用的脱钙剂有：①强酸类，盐酸、硝酸与中性试剂尿素甲醛混合而成；②弱酸类，甲酸、醋酸；③螯合剂。脱钙前先将犬、山羊、兔股骨头先锯开成片状，片状锯面厚度不宜超过3mm，长骨锯成节段状，大鼠长骨可等脱钙后在切取。

螯合剂脱钙液10%中性甲醛EDTA饱和液配制：EDTA（乙二胺四乙酸二钠）50g，10%中性甲醛液500mL，每周更换一次新液并震动固定。脱钙液应是骨组织体积的30~50倍，脱钙时间视骨组织的大小、厚薄及脱钙液的种类等具体情况而定。螯合剂脱钙法的特点：脱钙时间较慢，对组织结构无损伤，适用于免疫组织化学和酶组织化学染色。骨组织脱钙终点的判断方法：用细针扎骨无阻力感或骨能用刀切割成片时。脱钙结束的骨组织必须用自来水流水冲洗12~24小时方可进入脱水流程。

4、参考文献：

[1] 朱立平, 陈学清. 免疫学常用实验方法. [M] //. 人民军医出版社,

2000:

[2] 王德田, 董建强. 实用现代病理学技术. [M] //. 中国协和医科大学出版

社, 2012:

[3] 潘林. 实验病理学技术图鉴. [M] //. 科学出版社, 2012: