聚合酶链反应及其应用
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Tth DNA聚合酶在Mg2+的存在下，能由DNA模板合成DNA； Tth DNA聚合酶在较高的温度下仍具有逆转录酶活性，因此能很 好地克服RNA链中普遍存在二级结构的难题。
用于PCR的DNA聚合酶简介
Pfu DNA聚合酶（Pyrococcus furiosus）
Pfu是一种高保真的DNA聚合酶，出错率极低； 7.0 X 10–7 - 1.6 X 10–6
PCR技术的诞生与发 展 PCR技术的基本原 理 PCR技术的反应条 件 PCR反应的质量指 标
PCRБайду номын сангаас术的诞生与发展
聚合酶链反应（ Polymerase Chain Reaction，PCR ）又称为PCR 扩增技术，是一种高效、快速、特异性的体外DNA聚合程序。
1985年，美国PE-cetus公司人类遗传研究室的 Kary mullis发明了具有划时代意义的PCR技术；
KlenTaq DNA聚合酶的Mg2+最佳浓度范围很宽，因此很容易优化 反应条件；
在最佳反应条件下，KlenTaq DNA聚合酶出错率为 5.1 X 10–5， 性能略优于Taq DNA聚合酶。
用于PCR的DNA聚合酶简介
Tth DNA聚合酶（Thermus thermophilus）
Tth DNA聚合酶在Mn2+的存在下，能有效地反转录长度在1000碱 基以下的RNA；
2 PCR的DNA聚合酶与扩增的精 确性
PCR扩增反应的精确性
DNA聚合酶对PCR精确性的重要影 响 用于PCR的DNA聚合酶简介
DNA聚合酶的使用
PCR扩增反应的精确性
利用PCR技术扩增DNA靶序列的一个重要问题是这种DNA体外聚 合反应的序列忠实程度，即DNA扩增产物序列的准确率。PCR反应的 准确率远远低于细胞内的DNA聚合反应，除了缺少完善的DNA聚合校 正系统外，影响PCR反应准确率的因素还包括：
用于PCR的DNA聚合酶简介
DeepVent DNA聚合酶（Pyrococcus species GB-D）
DeepVent DNA聚合酶是一种在低温和高温条件下均极其稳定的 聚合酶，且能使用广范围的辅助溶剂如甲酰胺和DMSO等；
DeepVent DNA聚合酶能产生长达14 kb的扩增产物，其外切酶 活性比Vent DNA聚合酶高 4 倍，聚合活性比Taq DNA酶高5-15倍， 出错率比Vent DNA聚合酶低 2 倍；
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火
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5聚 ‘合
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℃5
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循环25-30次 ‘
目标DNA片段达106-
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PCR反应的质量指标
PCR反应的质量标准有： 特异性（序列选择） 有效性（序列产量） 准确性（序列对错）
上述三大标准并非由单一因素所决定，因此在PCR反应中必须 对多种参数进行联合控制和改进，但由于PCR反应中的各参数往往 是相互影响的，因此任何参数的改进不可能同时满足特异性、有效 性、准确性。
与dNTP的结合特异性 磷酸二酯键的形成速率 焦磷酸的释放速率 碱基错误掺入之后的持续延伸性 3’→5’的核酸外切活性的强弱
用于PCR的DNA聚合酶简介
Taq DNA聚合酶（Thermus aquaticus）
Taq DNA酶的聚合出错率较高（2.1X10-4），因为它没有3’→5’的 的核酸外切酶活性和校正功能。然而通过优化反应条件，可使Taq酶的 聚合出错率降低到原来的1/3。Taq DNA聚合酶催化的聚合反应的普遍 错误类型是由AT转换为GC；如果模板DNA具有形成二级结构的可能性 则Taq DNA酶还常常导致扩增产物的缺失突变。
与其它DNA聚合酶（如Taq酶）相比，具有相对较好的高保真性，其 出错率为2.4 X 10–5 - 5.7 X 10–5 ；
如果扩增长度大于2 kb，则需要高于2 mM的Mg2+，而在扩增长 度小于2 kb时，扩增产物的长度与Mg2+的浓度并无关联；
如果模板链中存在次黄嘌呤核苷或脱氧尿嘧啶核苷，Vent DNA 聚合酶不能延伸引物。
Pfu DNA聚合酶扩增出的产物带有平头末端； Pfu DNA聚合酶扩增速度极快，达1.5 - 2 min / kb； Pfu DNA聚合酶的热稳定性很高。
用于PCR的DNA聚合酶简介
Vent DNA聚合酶（Thermococcus litorVaelntisDN）A聚合酶具有3’→5’的核酸外切酶活性和校正功能，因此
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PCR技术的反应条件
DNA或RNA模板 DNA引物 DNA聚合酶 dNTPs Mg2+（缓冲液）
待扩增DNA区域
聚合酶链反应及其应用
1 PCR的原理与反应条 2 件 PCR的DNA聚合酶与扩增的精确 3 性 PCR的模板及制 4 备 PCR的引物设计及合成
5 PCR反应的其它控制参 6 数 PCR技术的衍生与发展
7 PCR技术在生命科学研究中的应 8 用 PCR技术在临床医学方面的应用
1 PCR的原理与反应条件
Taq DNA酶在使用时应注意：
避免稀释保存Taq DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶在室温下也具有延伸引物的活性
用于PCR的DNA聚合酶简介
KlenTaq DNA聚合酶（Thermus aquaticus）
KlenTaq DNA聚合酶是一种N端缺失了的Taq DNA聚合酶，因而 没有5’的核酸外切酶活性；
1988年，美国PE-cetus公司推出世界上第一台 PCR热循环仪，从而使PCR反应自动化；
1993年，Kary mullis因发明PCR技术获得诺贝 尔化学奖；
1995年，定量PCR仪诞生，使定量研究DNA靶序列成为现实。
PCR技术的基本原理
待扩增DNA区域
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DNA聚合酶的保真性能（主要因素） DNA链的物理损伤 PCR反应体系的洁净度
DNA聚合酶对PCR精确性的重要影响
DNA聚合酶的保真性主要取决于其3’→5’的核酸外切酶活性，它 负责对错误掺入的碱基进行校正。相关研究结果表明，DNA聚合酶的 出错率在每轮延伸每核苷酸1.6 X 10–6 - 2.1 X 10–4范围内。DNA聚合 酶的碱基掺入错误可能发生在其延伸阶段的五种活性：
用于PCR的DNA聚合酶简介
Pfu DNA聚合酶（Pyrococcus furiosus）
Pfu是一种高保真的DNA聚合酶，出错率极低； 7.0 X 10–7 - 1.6 X 10–6
PCR技术的诞生与发 展 PCR技术的基本原 理 PCR技术的反应条 件 PCR反应的质量指 标
PCRБайду номын сангаас术的诞生与发展
聚合酶链反应（ Polymerase Chain Reaction，PCR ）又称为PCR 扩增技术，是一种高效、快速、特异性的体外DNA聚合程序。
1985年，美国PE-cetus公司人类遗传研究室的 Kary mullis发明了具有划时代意义的PCR技术；
KlenTaq DNA聚合酶的Mg2+最佳浓度范围很宽，因此很容易优化 反应条件；
在最佳反应条件下，KlenTaq DNA聚合酶出错率为 5.1 X 10–5， 性能略优于Taq DNA聚合酶。
用于PCR的DNA聚合酶简介
Tth DNA聚合酶（Thermus thermophilus）
Tth DNA聚合酶在Mn2+的存在下，能有效地反转录长度在1000碱 基以下的RNA；
2 PCR的DNA聚合酶与扩增的精 确性
PCR扩增反应的精确性
DNA聚合酶对PCR精确性的重要影 响 用于PCR的DNA聚合酶简介
DNA聚合酶的使用
PCR扩增反应的精确性
利用PCR技术扩增DNA靶序列的一个重要问题是这种DNA体外聚 合反应的序列忠实程度，即DNA扩增产物序列的准确率。PCR反应的 准确率远远低于细胞内的DNA聚合反应，除了缺少完善的DNA聚合校 正系统外，影响PCR反应准确率的因素还包括：
用于PCR的DNA聚合酶简介
DeepVent DNA聚合酶（Pyrococcus species GB-D）
DeepVent DNA聚合酶是一种在低温和高温条件下均极其稳定的 聚合酶，且能使用广范围的辅助溶剂如甲酰胺和DMSO等；
DeepVent DNA聚合酶能产生长达14 kb的扩增产物，其外切酶 活性比Vent DNA聚合酶高 4 倍，聚合活性比Taq DNA酶高5-15倍， 出错率比Vent DNA聚合酶低 2 倍；
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目标DNA片段达106-
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PCR反应的质量指标
PCR反应的质量标准有： 特异性（序列选择） 有效性（序列产量） 准确性（序列对错）
上述三大标准并非由单一因素所决定，因此在PCR反应中必须 对多种参数进行联合控制和改进，但由于PCR反应中的各参数往往 是相互影响的，因此任何参数的改进不可能同时满足特异性、有效 性、准确性。
与dNTP的结合特异性 磷酸二酯键的形成速率 焦磷酸的释放速率 碱基错误掺入之后的持续延伸性 3’→5’的核酸外切活性的强弱
用于PCR的DNA聚合酶简介
Taq DNA聚合酶（Thermus aquaticus）
Taq DNA酶的聚合出错率较高（2.1X10-4），因为它没有3’→5’的 的核酸外切酶活性和校正功能。然而通过优化反应条件，可使Taq酶的 聚合出错率降低到原来的1/3。Taq DNA聚合酶催化的聚合反应的普遍 错误类型是由AT转换为GC；如果模板DNA具有形成二级结构的可能性 则Taq DNA酶还常常导致扩增产物的缺失突变。
与其它DNA聚合酶（如Taq酶）相比，具有相对较好的高保真性，其 出错率为2.4 X 10–5 - 5.7 X 10–5 ；
如果扩增长度大于2 kb，则需要高于2 mM的Mg2+，而在扩增长 度小于2 kb时，扩增产物的长度与Mg2+的浓度并无关联；
如果模板链中存在次黄嘌呤核苷或脱氧尿嘧啶核苷，Vent DNA 聚合酶不能延伸引物。
Pfu DNA聚合酶扩增出的产物带有平头末端； Pfu DNA聚合酶扩增速度极快，达1.5 - 2 min / kb； Pfu DNA聚合酶的热稳定性很高。
用于PCR的DNA聚合酶简介
Vent DNA聚合酶（Thermococcus litorVaelntisDN）A聚合酶具有3’→5’的核酸外切酶活性和校正功能，因此
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PCR技术的反应条件
DNA或RNA模板 DNA引物 DNA聚合酶 dNTPs Mg2+（缓冲液）
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聚合酶链反应及其应用
1 PCR的原理与反应条 2 件 PCR的DNA聚合酶与扩增的精确 3 性 PCR的模板及制 4 备 PCR的引物设计及合成
5 PCR反应的其它控制参 6 数 PCR技术的衍生与发展
7 PCR技术在生命科学研究中的应 8 用 PCR技术在临床医学方面的应用
1 PCR的原理与反应条件
Taq DNA酶在使用时应注意：
避免稀释保存Taq DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶在室温下也具有延伸引物的活性
用于PCR的DNA聚合酶简介
KlenTaq DNA聚合酶（Thermus aquaticus）
KlenTaq DNA聚合酶是一种N端缺失了的Taq DNA聚合酶，因而 没有5’的核酸外切酶活性；
1988年，美国PE-cetus公司推出世界上第一台 PCR热循环仪，从而使PCR反应自动化；
1993年，Kary mullis因发明PCR技术获得诺贝 尔化学奖；
1995年，定量PCR仪诞生，使定量研究DNA靶序列成为现实。
PCR技术的基本原理
待扩增DNA区域
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DNA聚合酶的保真性能（主要因素） DNA链的物理损伤 PCR反应体系的洁净度
DNA聚合酶对PCR精确性的重要影响
DNA聚合酶的保真性主要取决于其3’→5’的核酸外切酶活性，它 负责对错误掺入的碱基进行校正。相关研究结果表明，DNA聚合酶的 出错率在每轮延伸每核苷酸1.6 X 10–6 - 2.1 X 10–4范围内。DNA聚合 酶的碱基掺入错误可能发生在其延伸阶段的五种活性：