聚丙烯酰胺凝胶电泳讲解学习

琼酯糖凝胶电泳的浓度及分辨率
琼脂糖浓度（W/V） 大小范围（bp）
0.6% 0.8% 1.0% 1.2% 1.5% 2%
1000-23000 800-10000 400-8000 300-7000 200-4000 100-3000
不同类型琼脂糖的性质
琼脂糖类型
凝结温度/℃
标准琼脂糖
35~38 40~42
琼脂糖凝胶的制作是将干的琼脂糖悬浮于缓冲液中，通常使用的浓度 是1％－3％，加热煮沸至溶液变为澄清，注入模板后室温下冷却凝聚即成 琼脂糖凝胶。琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质。
琼脂糖凝胶孔径较大适用于分离同工酶及其亚型、大分子 核酸等，应用较广。琼脂糖可以制成各种形状、大小和孔隙度。 琼脂糖凝胶分离DNA度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可 分离长度从200bp至近50kb的DNA段。琼脂糖通常用水平装置 在强度和方向恒定的电场下电泳。目前，一般实验室多用琼脂 糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。
琼脂糖凝胶可以用于蛋白质和核酸的电泳支持介质，尤其适合于 核酸的提纯、分析。如浓度为1％的琼脂糖凝胶的孔径对于蛋白质来说 是比较大的，对蛋白质的阻碍作用较小，这时蛋白质分子大小对电泳 迁移率的影响相对较小，所以适用于一些忽略蛋白质大小而只根据蛋 白质天然电荷来进行分离的电泳技术，如免疫电泳、平板等电聚焦电 泳等。
琼脂糖适合于DNA、RNA分子的分离、分析，由于DNA、RNA分 子通常较大，所以在分离过程中会存在一定的摩擦阻碍作用，这时分 子的大小会对电泳迁移率产生明显影响。例如对于双链DNA，电泳迁 移率的大小主要与DNA分子大小有关，而与碱基排列及组成无关。
另外，一些低熔点的琼脂糖（62 ℃时熔化，因此其中的样品如 DNA可以重新溶解到溶液中而回收。
由于琼脂糖凝胶的弹性较差，难以从小管中取出，所以一般琼脂糖凝 胶不适合于管状电泳，管状电泳通常采用聚丙烯酰胺凝胶。琼脂糖凝 胶通常是形成水平式板状凝胶，用于等电聚焦、免疫电泳等蛋白质电 泳，以及DNA、RNA的分析。垂直式电泳应用得相对较少。
目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳，其优点如下：
1） 琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可 以进行电泳。
注意： 1、 每孔点样的体积一般少于25ul。 2、 加一定量的蔗糖来增加样品的浓度，以使样品停留在点样孔中。 3、 加入水溶性的阴离子追踪染料（如溴酚蓝）。 4、 加入标准分子质量样品，根据已知分子质量的带相应位置做出标准曲线。 5、 电泳一般是在追踪染料泳动到胶的80%部位时停止。注意电泳期间，电 泳槽盖要安全盖好，以防止液体蒸发。 6、 将胶浸没在1mg/L的溴化乙锭（EB）中，5min后即可看到DNA带。 7、 在紫外灯下可以看到DNA带，这种方法检测的界限是每条带约10ng 。 8、 要对某一条带（如质粒）进一步分析，可将含该带的凝胶切割下来，回 收DNA
操作
凝胶的EB染色
EB使用时的配制、贮存及使用 EB常用水配制成10 mg/ml的贮存液，于室温保存在棕色瓶或用 铝箔包裹的瓶中，使用终浓度为0.5 μg/ml 。
Goodview可与DNA分子形成复合物，发射的荧光 强度较游离的Goodview强度大10倍以上，且荧光 强度与DAN含量成正比
0.8~10 0.4~8 0.3~7 0.2~4 0.1~3 0.05~1
0.5~1 0.1~0.5 0.01~0.1
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琼脂糖凝胶电泳的注意事项
DNA分子带负电，从琼脂糖凝胶的负极向正极泳动，速度依赖于其分子质量。 小的紧密的DNA分子的较大伸展片断容易穿过琼脂糖介质。依据所要分离的 DNA分子的大小来选择琼脂糖的浓度。
高强度琼脂糖
修饰的低熔点/ 凝点琼 脂糖
超低熔点
34~43 25~35 35 8~15 25~30
低黏性低熔点琼脂糖 38
30
熔化温度/ ℃ 90~95
85~90
85~95 63~65 65 40~45 70 85 75
不同厂家生产 的不同商品其 凝结温度和熔 化温度有一定 差异
不同类型琼脂糖分离DNA片段的范围
聚丙烯酰胺凝胶电泳
电泳技术应用
电泳技术主要用于分离各种有机物（如氨基酸、多肽、 蛋白质、脂类、核苷酸、核酸等）和无机盐；也可用于 分析某种物质纯度，还可用于分子量的测定。
电泳技术与其他分离技术结合
电泳法与层析法结合 用免疫原理测试电泳结果
用于蛋白质结构的分析 提高对蛋白质的鉴别能力
电泳与酶学技术结合
发现同工酶，对于酶的 催化和调节功能有了深 入的了解
琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳原理：
琼脂糖是从琼脂中提纯出来的，主要是由D－半乳糖和3,6脱水L－半乳 糖连接而成的一种线性多糖。
在 pH 值为 8.0～8.3 时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核 酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳 支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出 现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌 入荧光染料（如 EB ）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。
2） 琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占98%~99%），近似自由电 泳，样品扩散较自由电流，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分 辨率高，重复性好。
3） 琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯检测 及定量测定。
4） 电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制成干膜可 长期保存。
浓度 （%）
0.3 0.5 0.8 1.0 1.2 1.5 2.0 3.0 4.0 6.0
标准 (kb) 1~50 0.7~25 0.5~15 0.25~12 0.15~6 0.08~4
高强度 (kb)
低熔点 (kb)
低黏度低溶 点(kb)
0.8~10 0.4~8 0.3~7 0.2~4 0.1~3
聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，具有机械强度 好、弹性大、透明、化学稳定性高、无电渗作用、设备简单、 样品量小（1~100ug）、分辨率高等优点，并可通过控制单体 浓度或单体与交联剂的比例，聚合成不同孔径大小的凝胶， 可用于蛋白质、核酸等分子大小不同的物质的分离、定性和 定量分析。还可结合解离剂十二烷基硫酸钠（SDS），以测 定蛋白质亚基的相对分子质量。