聚丙烯酰胺凝胶电泳讲解学习
sds-page电泳的基本原理
SDS-PAGE电泳是一种常用的蛋白质分析技术，通过电泳分离蛋白质样品的方法得到了广泛的应用。
本文将着重介绍SDS-PAGE电泳的基本原理。
一、SDS-PAGE电泳的概念SDS-PAGE是一种已经被广泛应用的蛋白质分离技术，它的全称是聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis）。
这种电泳技术利用聚丙烯酰胺凝胶作为分离介质，通过直流电场将蛋白质样品分离出不同电荷和大小的蛋白质成分。
二、SDS-PAGE电泳的原理1. 聚丙烯酰胺凝胶SDS-PAGE电泳中所使用的凝胶是由聚丙烯酰胺构成的。
聚丙烯酰胺凝胶具有一定的孔隙结构，可以根据蛋白质的大小和电荷来调整孔隙的大小，从而实现不同大小的蛋白质的分离。
2. SDS处理SDS是指月桂基硫酸钠，它是一种阴离子表面活性剂。
在SDS-PAGE 电泳中，将样品中的蛋白质经过SDS处理后，蛋白质表面都会均匀地吸附一定数量的SDS分子，并且使蛋白质呈负电荷。
这样，所有的蛋白质分子都会带有类似的电荷密度，可以消除蛋白质的本身的电荷特性，使蛋白质在电场作用下只受到电场力的作用，而不受到其他因素干扰。
3. 蛋白质分离将经过SDS处理的蛋白质样品加载到聚丙烯酰胺凝胶上，然后通过电泳进行分离。
经电泳分离后，蛋白质会根据其大小和电荷迁移到不同位置，从而使不同的蛋白质分离开来。
三、SDS-PAGE电泳的应用SDS-PAGE电泳技术在生物化学和分子生物学研究领域应用广泛。
它可以用于研究蛋白质的分子量、纯度和比例，也可以用于检测蛋白质的存在和表达水平，同时还可以用于鉴定蛋白质的异构体等。
四、SDS-PAGE电泳的发展SDS-PAGE电泳技术自问世以来，经过不断的改进和完善，在蛋白质分离和分析领域一直处于领先地位。
未来，随着科学技术的不断进步，SDS-PAGE电泳技术也将会迎来新的发展，并在更广泛的领域得到应用。
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳基本原理
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实验八聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳专业知识讲座
七、思索题
(1)为何要在样品中加少许溴酚兰和一定浓度旳蔗 糖溶液？蔗糖及溴酚兰旳作用分别是什么？
4. 样品旳处理及加样
将样品按0.5–1 mg/mL加样品溶解液，溶解后， 将其转移到带塞旳小离心管中，轻轻盖上盖子(不 要塞紧，以免加热时迸出)，在100℃沸水浴中加热 3min，取出冷却后加样。
用微量进样器取25 l上述混合液，经过缓冲液， 小心地将样品加到凝胶凹形样品槽底部。
5 .电泳
将电泳仪旳正极与下槽连接，负极与上槽连接，接 通冷却水，打开电泳仪开关，开始时电流为10 mA，待 样品进入分离胶后，将电流调至20-30 mA，当溴酚蓝 染料距硅胶框1 cm时，停止电泳，关闭电源及冷却水。
图5 不连续系统浓缩效应示意图
SDS － 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 （ SDSPAGE） ：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时， 它旳迁移率取决于它所带净电荷以及分子 旳大小和形状等原因。假如在丙烯酰胺凝 胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸 钠(sodium dodecyl sulfate,简称SDS)， 则蛋白质分子旳电泳迁移率主要取决于它 旳分子量，而与所带电荷和形状无关。所 以 能 够 利 用 SDS-PAGE 测 定 蛋 白 质 分 子 量 。
将上、下贮槽旳蒸馏水倒去 ，将混合均匀后旳
浓缩胶溶液，用细长头旳滴管加到长、短玻璃板旳 窄缝内(即分离胶上方)，距短玻璃上缘0.5 cm处， 轻轻加入样品槽模板.在上、下贮槽中加入蒸馏水， 但不能超出短玻璃板上缘。静置电泳槽，10 min左 右，上胶即可聚合，再放置10-20 min，加入电极 缓冲液，使液面没过短玻璃板约0.5 cm，轻轻取出 样品槽模板，即可加样。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)实验报告一、实验目的1.学习SDS-PAGE分离蛋白质的原理；2.掌握垂直板电泳的操作方法。
二、实验原理1、电泳：(1)定义：是指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。
(2)影响电泳效果的因素：①带电颗粒的大小和形状：颗粒越大，电泳速度越慢，反之越快；②颗粒的电荷数：电荷越少，电泳速度越慢，反之越快；③溶液的粘度：粘度越大，电泳速度越慢，反之越快；④溶液的pH值：影响被分离物质的解离度，离等电点越近，电泳速度越慢，反之越快；⑤电场强度：电场强度越小，电泳速度越慢，反之越快；⑥离子强度：离子强度越大，电泳速度越慢，反之越快；⑦电渗现象：电场中，液体相对于固体支持物的相对移动；⑧支持物筛孔大小：孔径小，电泳速度慢，反之则快。
2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）(1)定义聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳。
SDS-PAGE:是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）(2)SDS的作用SDS是一种阴离子去垢剂，可与蛋白质结合，形成SDS-蛋白质复合物。
由于SDS带有大量负电荷，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖,即消除了蛋白质分子之间电荷差异。
因此在电泳时，蛋白质分子的迁移速度则主要取决于蛋白质分子大小(3) SDS-PAGE分类：¾SDS-PAGE按照缓冲液pH值和凝胶孔径差异分为连续系统和不连续系统两大类：连续系统：电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。
不连续系统：缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度均不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳(4)聚丙烯胺凝胶的生成：聚丙烯胺凝胶由丙烯酰胺单体（Acr）和N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚合而成。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳简单原理和步骤
C. 银染检测灵敏度高100-1000倍。
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1.2ml 4.3ml 1.9ml 112ul 5ul
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2. 浓缩胶制备的方法
(1). 将丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体储备液 0.6ml，浓缩胶缓冲液888u1、水2ml、10 ％过硫酸铵56ul、TEMEDl0ul混合均匀后， 立即灌胶。
(2). 将预先制备好的浓缩胶慢慢地灌进狭槽中， 然后将所需的样品梳(形成加样孔)插于夹 心槽上部，并上下轻轻拉动梳子，小心地 去除粘附在梳齿顶部的小气泡，待聚合完 全后即可拔去梳子，准备电泳。
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二、试剂
A. 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体溶液(Acr和Bis) 称取丙烯 酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加水至100ml，过滤后存 于棕色瓶中，于4℃保存。
B. 4X分离胶缓冲液 称取Tris 18．17g，加入10%SDS贮备液 4ml，用12mol/L HCl调pH至8，8，定容至100ml。
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3. 样品制备及电泳
(1). 样品处理：蛋白质样品和分子量标准蛋白质在 上样电泳前均需变性。通常是将样品蛋白质溶 液与等体积的样品缓冲液混合后置于eppendorf 管中，将混合物置于95-100℃加热5分钟，立即 置于冰上，或于-20℃储存，以便再次分析时使 用。
(2). 上样：样品制备好以后，即可上样电泳。先将 样品梳子移去，用双蒸水淋洗每个样品孔，然 后在样品孔中加入电泳缓冲液，同时在电泳槽 中也加满电泳缓冲液。处理完毕后，根据实验 的需要加样电泳。
C. 4X浓缩胶缓冲液 称取Tris 6.06g，加入10%SDS 4ml，用 l2mol/L HCI调pH至6．8，定容至100ml。
生物化学实验五《聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白》课件
➢ 分辨率高 ➢ 用于复杂和特殊样品的分离
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不连续电泳的四种不连续体系
➢凝胶的不连续 ➢缓冲液成份的不连续 ➢缓冲液pH值的不连续 ➢电压梯度的不连续
不连续电泳的三种物理效应
➢ 样品的浓缩效应 ➢ 凝胶的分子筛效应 ➢ 电荷效应
电泳的过程三种效应同时存在，对蛋白样品起协同作用，使样品各组 分按照带电量、分子质量及形状按一定的顺序分离。
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三、实验步骤
封槽
清洁、干燥的小玻管一端，用Parafilm贴封后垂直放在管架上
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制胶和灌胶
分离胶：A:C:D:E＝1:2:3:2（V/V） 浓缩胶：B:C:D:E＝2:1:5:2（V/V）
➢ A: pH8.9 Tris/Hcl缓冲液
➢ B: pH6.7 Tris/Hcl缓冲液
➢ C: 30% Acr-Bis贮存液
电泳
➢ 连接电极，上负下正； ➢ 浓缩胶：3mA／管，分离胶：4mA／管； ➢ 待示踪染料接近凝胶管底部约0.5cm处，切断电源。
剥胶
取下凝胶管，用注射器吸取一定量的蒸馏水，将针头插入胶柱-与管内壁之间 ，边注水边旋转玻管，直至胶柱与管壁分离，然后用洗耳球轻轻在玻管的一 端加压，使凝胶柱从玻管缓慢滑出，将凝胶柱置于干净的试管内，用蒸馏水 冲洗几次。
实验五 聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白 动物医学院动物生化教研室
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一、实验目的
① 掌握聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳的原理； ② 学习聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳的操作技术； ③ 了解血清蛋白的主要成份。
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二、实验原理
➢ 不连续系统聚丙烯酰胺凝胶电泳中，蛋白样品通过浓缩胶的浓 缩按分子大小排列成层，然后进入分离胶，随着电泳的不断进行 ，不同大小、电荷的蛋白质分子逐渐被分开。
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是一种常用的蛋
白质分离和分析方法。
工作原理：SDS（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子表面活性剂，可以让蛋白质以线性二级结构展开。
在电泳过程中，SDS与蛋白质结合，给蛋白质赋予等电点电荷，使得蛋白
质以质量为依据进行分离。
聚丙烯酰胺是一种用于凝胶电
泳的材料，通过聚合后形成凝胶，可以限制蛋白质的运动，使其按照大小分子量在凝胶中迁移。
步骤：
1. 准备凝胶：将聚丙烯酰胺溶液制备成凝胶，通常是在平
板上铺设。
2. 样品预处理：将需要分离的蛋白质样品与SDS等混合，再加入还原剂，使其煮沸变性化。
这样可以让所有蛋白质
在电泳过程中以线性形式展开。
3. 输运样品：将蛋白质样品加入凝胶孔隙中。
4. 电泳：通电使蛋白质样品在凝胶中迁移，较大分子量的
蛋白质迁移速度较慢，较小分子量的蛋白质迁移速度较快。
5. 可视化：通过染色方法（如Coomassie蓝染色）将蛋白质可视化，并观察分析结果。
SDS-PAGE广泛应用于蛋白质分离、分析和纯化等领域，
例如鉴定蛋白质大小、检测蛋白质含量、分离复杂样品中
的蛋白质等。
聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理
聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理一、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）基本原理聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel elecrtrophoresis，PAGE）是一种分析两性物质结构的有效方法。
它是以聚丙烯酰胺凝胶为载体，应用交流或直流电场，乙二醇或乙二醇水溶液作为移动介质，使分子在电场中经由凝胶移动的方法。
具体而言，在PAGE中，分子在电场的作用下，从凝胶上的电极处向凝胶内部移动（例如正电极向凝胶内部移动），同时，分子根据其在凝胶网络中的活动和受到通过电场施加的力的影响，以不同的速率穿过凝胶，从而获得他们特定的构型，最终从凝胶边缘离开，在凝胶面连续移动，并最终到达电极处。
PAGE试验，最初的凝胶电泳试剂和反应体系主要是：在聚丙烯酰胺(PAGE)网络中混合有多种构型的分子，如水溶性酶、酸性蛋白质、核酸、抗体、复合蛋白质等，然后在此反应系统中加入电场，使其穿过凝胶网络，最终降解产物可以通过激光共聚焦成像系统被识别。
二、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）的优势1、PAGE技术能够极大地提高蛋白质分析的灵敏度和精确度。
由于它的分辨率高，可以检测到任何大小的分子，因此，可以对蛋白质的组成、构型、结构及其功能特性有更深入的了解。
2、PAGE技术的速度快，可以在几分钟内完成蛋白质分析，非常适合在大量的样本分析中使用，且它的成本也较低，可以大大提高蛋白质的检测速度和效率。
3、PAGE技术可进行准确有效的分析，这种测定方法也可提供浓度的分析。
4、PAGE技术有较高的灵敏度，能够检测到微量的蛋白质，可以检测到蛋白质的微弱变化，从而发现蛋白质在特定状态下是否有差异。
5、PAGE技术还有制备样品的优势，例如，不需要预处理，可以直接使用凝胶，并可以更有效地增加高技术水平的研究；此外，也有其他的细胞或分子的制备方法，从而可以获得更高的准确性和细节化的信息。
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳原理
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳原理SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离和纯化技术，其原理主要是利用SDS（十二烷基硫酸钠）对蛋白质进行变性处理，使得蛋白质呈现线性构象，并在电场作用下根据其大小分子量进行迁移分离。
下面将详细介绍SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理及其操作步骤。
首先，我们需要了解SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理。
SDS是一种带有负电荷的表面活性剂，它能够与蛋白质中的极性氨基酸结合，使得蛋白质呈现负电荷。
在加热的条件下，SDS可以使蛋白质变性成为线性构象，并且使得蛋白质的电荷密度基本一致。
这样，蛋白质在电场作用下就可以根据其大小分子量进行迁移，从而实现蛋白质的分离。
接下来，我们来介绍SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作步骤。
首先是样品的制备，通常需要将蛋白质样品与SDS缓冲液混合，并在加热条件下进行变性处理。
然后将样品加载到凝胶孔中，通常使用的是聚丙烯酰胺凝胶。
接着是电泳条件的设定，包括电场强度、电泳时间等参数的调节。
在电泳过程中，蛋白质会根据其分子量在凝胶中进行迁移，最终形成清晰的蛋白质条带。
最后是染色和分析，通常使用共价染色或银染色来观察蛋白质的分离情况，并进行进一步的分析和鉴定。
总结一下，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种基于蛋白质分子量的分离技术，其原理是利用SDS对蛋白质进行变性处理，使得蛋白质呈现线性构象，并在电场作用下根据其大小分子量进行迁移分离。
在实际操作中，需要进行样品的制备、凝胶的加载、电泳条件的设定以及染色和分析等步骤。
通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，我们可以有效地分离和纯化蛋白质样品，为蛋白质研究提供了重要的技术支持。
聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchangppt课件
加样
加样:加样器针尖贴着高玻璃板伸到加样槽 中间位置加样，针尖不要扎破下面的胶面。 加样量:10 ul -50 ul
电泳
1)加样完毕后，将电泳槽盖好盖，与电泳仪相连 接。 2)电泳仪电压调至最大，电流调到最小，打开电 泳仪开关进行恒流电泳。 3)浓缩胶:30mA(150V)
蛋白质、核酸和氨基酸等物质的分离和鉴定。
带电粒子的运动速度---
即带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度。
μ = Q X /6πrη
Q 粒子所带电荷量 X 电场强度 r 粒子半径 η 介质的粘度
影响电泳速度的因素
1、内在因素: 样品自身性质
2、外在因素: 电场 缓冲液 支持介质
缓冲液 pH： 解离性质
进入pH8.9的分离胶中,各种蛋白质所带净电荷量 不同而有不同的迁移率。表面电荷多,则迁移快;反 之,则慢.
实验操作
一、制胶(本实验的关键步骤)
1、安装玻板： 将洗净的、带白色边条的玻板水平放好，将
U型硅胶密封条摆好。然后，将不带边条的 短玻板盖在U型硅胶密封条上。
2、安装铁夹：用4只铁夹将安装好的玻板夹 好。
分离胶:40mA(200V) 加样后马上将微量加样器仔细冲洗多遍，以免血清 堵塞针尖。
观察并记录电泳现象
八、剥胶、染色、脱色
• 剥胶：拆开电泳槽装置，用竹镊子轻轻撬开两层 玻璃板，戴上一次性手套，用手和镊子将分离胶 剥离到染色液盘内，染色15分钟。
• 脱色： 将分离胶小心完整地从染色液中移到脱色 液内，脱色三次，每次10分钟（每次更换新鲜脱 色液80-100ml），脱色时在摇床上摇。
当电者方向相反时，会减慢颗粒泳 动速度。 • 分子筛：是凝胶电泳的一个特性。筛孔越小，则颗粒在
聚丙烯酰胺凝胶电泳(共42张PPT)全
配制20ml不同浓度分离胶 所需各种试剂用量/ml
5% 7.5% 10% 15%
配制10ml浓缩 胶 所需试剂用量
3%
3.33 5.00 6.66 10.00
-
2.50 2.50 2.50 2.50
-
-
-
-
-
3.0
-
-
-
-
1.25
0.20 0.20 0.20 0.20
0.10
1%TEMED 重蒸馏水
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳
概述
❖1967年由Shapiro建立。
❖1969年由Weber和Osborn进一步完善。
他们发现样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入 离子去污剂（SDS）以后,蛋白质亚基的电泳迁移 率主要取决于亚基分子量的大小,电荷因素可以忽 视。
基本原理
1.蛋白质分子的解聚
(1)SDS
（十二烷基硫酸钠，sodium dodecyl sulfate, SDS)
阴离子去污剂 变性剂
助溶性试剂
断裂分子内和分子间的氢键 分子去折叠
破坏蛋白质分子的二级和三级结构
❖ (2)强还原剂 巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）
使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂，这样分离出的 谱带即为蛋白质亚基。
实验原理
浓缩效应：不连续性所致 制胶缓冲液：Tris-HCl （根据亚基分子量分离蛋白质） (3)二硫键是否完全被还原 与蛋白质的结合量：大多数1. (2)样品缓冲液的离子强度 混匀后，置真空干燥器中，抽气10min 圆盘电泳 不连续SDS-PAGE 1967年由Shapiro建立。 注入电极缓冲液 用 (3)二硫键是否完全被还原 选择适当的凝胶浓度。 （根据亚基分子量分离蛋白质） ＞100 糊状不成形，易破碎。
SDS-PAGE-聚丙烯酰胺凝胶电泳详解ppt课件
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SDS的作用
破坏蛋白质分子之间以及其他物质分 子之间的非共价键，使蛋白质变性而改变 原有的构象，保证蛋白质分子与SDS充分结 合而形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。
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二、SDS-PAGE的基本原理
（一）蛋白质分子的解聚 样品介质和聚丙烯酰胺中加入离子
去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的 电泳迁移率主要取决于亚基分子量的 大小，而电荷因素可以被忽略。
连续电泳 不连续电泳
（3）根据电泳的形式
圆盘电泳 垂直电泳
平板电泳 水平电泳
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2、操作 （1） 制备分离胶 （2） 制备积层胶(堆积胶）
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下的反应： 蛋白质本身的电荷被屏蔽 氢键断裂 疏水相互作用被取消 多肽被去折叠(二级结构破坏),并形成椭球形
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①还原SDS处理 当加入还原试剂DTT或β-二巯基乙醇后，
蛋白质被完全去折叠，只根据分子量分离。
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②带有烷基化作用的还原SDS处理 烷基化作用可以很好地并经久牢固地保护
（3）长轴的长度则与亚基分子量的大 小成正比。
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胶束在SDS-PAGE系统中的电泳迁 移率不再受蛋白质原有电荷的影响，
而主要取决于椭圆棒的长轴长度，即 蛋白质或亚基分子量的大小。
当蛋白质的分子量在15KD— 200KD之间时，电泳迁移率与分子量 的对数呈线性关系
§4.3聚丙烯酰胺凝胶电泳
常用的硅化剂为二氯二甲基硅烷 （dichlorodimethyl silane）,商品名为Siliconisel25。为了灌胶时不漏胶，可在封边条和玻璃板之 间涂医用凡士林，也有人用冷却至50℃的1%琼 脂糖凝胶封堵缝隙。或用胶带纸或医用橡皮膏将 玻璃板的三个边缘封贴。 三、制胶 根据所需的凝胶浓度配制凝胶溶液，参见表 4.7，灌胶前加入TEMED。
§4. 3. 2 连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 连续聚丙烯酰胺凝胶电泳（continuous electrophoresis）是1959年L.Weintraub和 S.Raymond最早创立的，是指电泳系统采用相同孔 径的凝胶和相同的缓冲液（包括样品缓冲液、凝胶 缓冲液和电极缓冲液），在pH恒定、离子强度不 同的条件下进行区带电泳。
C = 6.5－0.3T
（4.14）
此式可用于计算T为5％～20％时的凝胶组成。C 值并不很严格，在大多数情况下，可变化的范围 约为 ±1％。
当C保持恒定时，凝胶的有效孔径随着T的增加 而减小，当T保持恒定，C为4％时，有效孔径最 小。C大于或小于4％时，有效孔径均变大，C大 于5％时凝胶变脆，不宜使用，实验中最常用的 C是2.6％和3％。
该技术是利用样品（如蛋白质）的电荷效 应进行分离的，而凝胶的分子筛效应不明显。 一般只用于分离简单的样品，分辨率不高。 但由于其具有制胶简便、快捷、缓冲系统组 成简单、 pH 恒定等优点，至今还有部分实 验在使用该方法。
§4. 3. 3 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳（discontinuous electrophoresis，也称为圆盘电泳）是20世纪60 年代中期由S.Hjertè n、L.Orenstein和B. J. Davis 创建并完善的电泳技术。是指使用不同孔径的 凝胶和不同缓冲体系的电泳方式，在电泳过程 中，凝胶按需要在一块玻璃板内被制成不同浓 度的两部分（小的部分是浓缩胶，大的部分是 分离胶）。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳ppt课件
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• 通常丙烯酰胺的聚合有两种：
1：化学聚合
常用过硫酸铵，过硫酸钾来引发这个过程，用TEMED， 三乙醇胺作为加速剂，这种引发-增速的催化系统是氧化还原过程。当TEMED溶液中加入过硫酸铵后，过硫酸铵产 生自由基，而丙烯酰胺和自由基作用活化，活化的烯酰胺 形成多聚长链。
a，b的比例很关键，如果a:b <10，胶脆，硬；
如果a:b > 100，胶糊状。
一般有弹性，透明的胶，a. :b比例应在30左右
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丙烯酰胺储存液的配制
• 29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液： 丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。 储于棕色瓶，4℃避光保存。 使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉 淀，可以过滤。
各试剂的作用
•Acr：
Bis：
Acr与Bis共同成为分子筛的主体。
•APS：催化剂
TEMED：加速剂
在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发
丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生
甲叉键交联，从而形成三维网状结构。
DTT：还原剂，使半胱氨酸的二硫键断裂并被还原。
SDS：为去污剂，断裂蛋白质的氢键，破坏蛋白分子的二、三级 结构而去折叠成多肽。解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，从而消
除了不同分子间的电荷差异和结构差异。
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• 甘氨酸：由于pI=6.0,在pH=8.8是带负电，向正极泳动。 因解离度小，有效迁移率很低，泳动慢。
• HCl：强电解质，Cl-有效迁移率大，泳动快。因此，蛋白 质的有效迁移率介于甘氨酸与Cl-之间。
多肽链_聚丙烯酰胺凝胶电泳__解释说明
多肽链聚丙烯酰胺凝胶电泳解释说明1. 引言1.1 概述多肽链是由氨基酸残基通过脱水缩合反应形成的生物大分子，广泛存在于生物体内并参与许多生物学过程。
多肽链的结构和功能对其研究具有重要意义。
聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的多肽分离和检测技术，通过在凝胶中施加电场，利用多肽链在电场中迁移速度差异实现其分离。
1.2 文章结构本文将首先介绍多肽链的基本概念，包括其定义、结构特点以及功能和重要性。
然后详细阐述聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理，包括原理介绍、实验步骤和条件，以及该技术在不同领域中的应用优势。
接下来将重点介绍多肽链在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分离和检测技术方法，包括SDS-PAGE技术、Native-PAGE技术以及Isoelectric Focusing(IPG)技术。
最后进行结论总结，并展望未来关于多肽链与聚丙烯酰胺凝胶电泳研究的发展方向。
1.3 目的本文旨在全面介绍多肽链与聚丙烯酰胺凝胶电泳这一分离和检测技术的关系。
通过对多肽链的基本概念、聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理以及多肽链分离和检测技术方法的详细说明，旨在提供一个全面了解该领域研究进展和应用前景的参考。
同时，本文还将对该领域未来的研究方向进行展望，从而为相关领域的科学家和研究人员提供有价值的信息和启示。
2. 多肽链的基本概念2.1 定义多肽链是由两个或更多氨基酸残基通过肽键连接而成的链状分子。
它们是生物体内蛋白质合成过程中的中间产物，也可以作为药物、营养品和化妆品等领域的重要原料。
2.2 结构特点多肽链的结构特点主要包括以下几个方面：第一，多肽链是由20种不同的氨基酸残基按照特定的顺序组成。
每个氨基酸残基都有一个氨基（NH2）和一个羧酸（COOH）官能团。
第二，多肽链的两端分别有自由的氨基末端（N-末端）和羧酸末端（C-末端），这些末端可能参与进一步反应或与其他化合物发生相互作用。
第三，多肽链上不同位置的氨基酸残基可能具有不同的性质和活性，从而决定了多肽在生物过程中扮演的角色。
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理方法及应用
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理方法及应用简介SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)是一种常用的蛋白质分离技术，广泛应用于生物化学和分子生物学实验中。
本文将介绍SDS-PAGE的原理、方法以及主要应用领域。
原理SDS-PAGE基于凝胶电泳原理，利用聚丙烯酰胺凝胶作为分离载体，通过电场作用使样品中的蛋白质分子按照分子量大小进行迁移，实现分离。
1.聚丙烯酰胺凝胶：聚丙烯酰胺是一种无色、透明的高分子化合物，它可以形成含有孔隙结构的凝胶。
凝胶中的孔隙大小可以调节，从而实现对不同分子量的蛋白质进行分离。
2.SDS：SDS是一种表面活性剂，具有较强的蛋白质变性能力。
在SDS-PAGE中，SDS能够使蛋白质变性，并赋予蛋白质均等的电荷密度，使其在电场作用下按照分子量进行迁移。
方法下面是SDS-PAGE实验的步骤：1.制备凝胶：将聚丙烯酰胺粉末溶解在缓冲液中，加入过硫酸铵或TEMED催化剂，混合均匀后倒入模具中。
待凝胶凝固后，将其置于凝胶槽中。
2.加载样品：将要分析的蛋白质样品添加至样品孔中。
通常将待测样品与相应的分子量标记物混合，标记物用于估计待测样品的分子量。
3.进行电泳：连接电源，将电流通入凝胶槽。
经过一段时间的电泳，蛋白质开始在凝胶中迁移。
4.染色和可视化：凝胶结束电泳后，可以使用染色剂如Coomassie蓝染色剂对蛋白质进行染色。
然后，使用成像设备或者透光扫描仪对凝胶进行可视化和分析。
应用SDS-PAGE在生物化学和分子生物学领域有广泛的应用：1.蛋白质分离与纯化：通过SDS-PAGE可以将复杂的蛋白质混合物分离为单个蛋白质，从而方便后续的纯化和进一步研究。
2.确定蛋白质相对分子质量：通过将待测样品与分子量标记物一起进行SDS-PAGE分析，可以估计待测样品的相对分子质量。
3.蛋白质定量：通过测量蛋白质在凝胶上的强度可以定量分析蛋白质的含量。
4.蛋白质结构和功能研究：SDS-PAGE可以用于研究蛋白质的亚单位组成、聚合态以及蛋白质之间的相互作用。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理及步骤
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳目的要求（1）学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。
（2）掌握SDS-PAGE测定蛋白质分子量的操作方法。
原理SDS-PAGE是PAGE是一种特殊形式，SDS是带负电荷的阴离子去污剂。
用SDS-PAGE 测定蛋白质分子量时，蛋白质需经样品溶解液处理。
在样品溶解液中含有巯基乙醇及SDS，各种蛋白质样品在巯基乙醇作用下，还原成单链，再进一步与SDS结合形成带大量负电荷的SDS-蛋白质复合物。
因此各种蛋白质分子在SDS-PAGE中，只能按其分子量大小而分离。
SDS-PAGE有连续体系（b）及不连续体系两种(d)，这两种体系有各自的样品溶解液及缓冲液，但加样方式，电泳过程及固定、染色与脱色方法完全相同。
聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体的一种区带电泳。
这种凝胶是以丙烯酰胺单体（Acrylamide，简写为Acr）和交联剂N，N'-甲叉双丙烯酰胺（N,N'-Methylena Bisacrylamide，简写为Bis）在催化剂的作用下聚合而成的。
Acr 和Bis 在它们单独存在或混合在一起时是稳定的，且具有神经毒性，操作时应避免接触皮肤。
但在具有自由基团体系时，它们聚合。
引发产生自由基团的方法有两种，即化学法和光化学法。
化学聚合的引发剂是过硫酸铵(NH4)2S2O3（Ammonium persulfate，简写为Ap），催化剂是N，N，N',N'-四甲基乙二胺（Tetramethylenediamine，简写为TEMED）。
在催化剂TEMED的作用下，由过硫酸铵（Ap）形成的自由基又使单体形成自由基，从而引起聚合作用。
TEMED 在低pH 时失效，会使聚合作用延迟；冷却也可使聚合速度变慢；一些金属抑制聚合；分子氧阻止链的延长，防碍聚合作用。
这些因素在实际操作时都应予以控制。
光聚合以光敏感物核黄素（即V B2）作为催化剂，在痕量氧存在下，核黄素经光解形成无色基，无色基被氧再氧化成自由基，从而引起聚合作用。
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高强度琼脂糖
修饰的低熔点/ 凝点琼 脂糖
超低熔点
34~43 25~35 35 8~15 25~30
低黏性低熔点琼脂糖 38
30
熔化温度/ ℃ 90~95
85~90
85~95 63~65 65 40~45 70 85 75
不同厂家生产 的不同商品其 凝结温度和熔 化温度有一定 差异
不同类型琼脂糖分离DNA片段的范围
琼脂糖凝胶的制作是将干的琼脂糖悬浮于缓冲液中，通常使用的浓度 是1％－3％，加热煮沸至溶液变为澄清，注入模板后室温下冷却凝聚即成 琼脂糖凝胶。琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质。
琼脂糖凝胶孔径较大适用于分离同工酶及其亚型、大分子 核酸等，应用较广。琼脂糖可以制成各种形状、大小和孔隙度。 琼脂糖凝胶分离DNA度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可 分离长度从200bp至近50kb的DNA段。琼脂糖通常用水平装置 在强度和方向恒定的电场下电泳。目前，一般实验室多用琼脂 糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。
由于琼脂糖凝胶的弹性较差，难以从小管中取出，所以一般琼脂糖凝 胶不适合于管状电泳，管状电泳通常采用聚丙烯酰胺凝胶。琼脂糖凝 胶通常是形成水平式板状凝胶，用于等电聚焦、免疫电泳等蛋白质电 泳，以及DNA、RNA的分析。垂直式电泳应用得相对较少。
目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳，其优点如下：
1） 琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可 以进行电泳。
浓度 （%）
0.3 0.5 0.8 1.0 1.2 1.5 2.0 3.0 4.0 6.0
标准 (kb) 1~50 0.7~25 0.5~15 0.25~12 0.15~6 0.08~4
高强度 (kb)
低熔点 (kb)
低黏度低溶 点(kb)
0.8~10 0.4~8 0.3~7 0.2~4 0.1~3
琼脂糖适合于DNA、RNA分子的分离、分析，由于DNA、RNA分 子通常较大，所以在分离过程中会存在一定的摩擦阻碍作用，这时分 子的大小会对电泳迁移率产生明显影响。例如对于双链DNA，电泳迁 移率的大小主要与DNA分子大小有关，而与碱基排列及组成无关。
另外，一些低熔点的琼脂糖（62 ℃时熔化，因此其中的样品如 DNA可以重新溶解到溶液中而回收。Biblioteka 操作凝胶的EB染色
EB使用时的配制、贮存及使用 EB常用水配制成10 mg/ml的贮存液，于室温保存在棕色瓶或用 铝箔包裹的瓶中，使用终浓度为0.5 μg/ml 。
Goodview可与DNA分子形成复合物，发射的荧光 强度较游离的Goodview强度大10倍以上，且荧光 强度与DAN含量成正比
琼脂糖凝胶可以用于蛋白质和核酸的电泳支持介质，尤其适合于 核酸的提纯、分析。如浓度为1％的琼脂糖凝胶的孔径对于蛋白质来说 是比较大的，对蛋白质的阻碍作用较小，这时蛋白质分子大小对电泳 迁移率的影响相对较小，所以适用于一些忽略蛋白质大小而只根据蛋 白质天然电荷来进行分离的电泳技术，如免疫电泳、平板等电聚焦电 泳等。
0.8~10 0.4~8 0.3~7 0.2~4 0.1~3 0.05~1
0.5~1 0.1~0.5 0.01~0.1
琼脂糖凝胶电泳的注意事项
DNA分子带负电，从琼脂糖凝胶的负极向正极泳动，速度依赖于其分子质量。 小的紧密的DNA分子的较大伸展片断容易穿过琼脂糖介质。依据所要分离的 DNA分子的大小来选择琼脂糖的浓度。
聚丙烯酰胺凝胶电泳
电泳技术应用
电泳技术主要用于分离各种有机物（如氨基酸、多肽、 蛋白质、脂类、核苷酸、核酸等）和无机盐；也可用于 分析某种物质纯度，还可用于分子量的测定。
电泳技术与其他分离技术结合
电泳法与层析法结合 用免疫原理测试电泳结果
用于蛋白质结构的分析 提高对蛋白质的鉴别能力
电泳与酶学技术结合
注意： 1、 每孔点样的体积一般少于25ul。 2、 加一定量的蔗糖来增加样品的浓度，以使样品停留在点样孔中。 3、 加入水溶性的阴离子追踪染料（如溴酚蓝）。 4、 加入标准分子质量样品，根据已知分子质量的带相应位置做出标准曲线。 5、 电泳一般是在追踪染料泳动到胶的80%部位时停止。注意电泳期间，电 泳槽盖要安全盖好，以防止液体蒸发。 6、 将胶浸没在1mg/L的溴化乙锭（EB）中，5min后即可看到DNA带。 7、 在紫外灯下可以看到DNA带，这种方法检测的界限是每条带约10ng 。 8、 要对某一条带（如质粒）进一步分析，可将含该带的凝胶切割下来，回 收DNA
2） 琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占98%~99%），近似自由电 泳，样品扩散较自由电流，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分 辨率高，重复性好。
3） 琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯检测 及定量测定。
4） 电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制成干膜可 长期保存。
发现同工酶，对于酶的 催化和调节功能有了深 入的了解
琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳原理：
琼脂糖是从琼脂中提纯出来的，主要是由D－半乳糖和3,6脱水L－半乳 糖连接而成的一种线性多糖。
在 pH 值为 8.0～8.3 时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核 酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳 支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出 现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌 入荧光染料（如 EB ）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。
聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，具有机械强度 好、弹性大、透明、化学稳定性高、无电渗作用、设备简单、 样品量小（1~100ug）、分辨率高等优点，并可通过控制单体 浓度或单体与交联剂的比例，聚合成不同孔径大小的凝胶， 可用于蛋白质、核酸等分子大小不同的物质的分离、定性和 定量分析。还可结合解离剂十二烷基硫酸钠（SDS），以测 定蛋白质亚基的相对分子质量。
琼酯糖凝胶电泳的浓度及分辨率
琼脂糖浓度（W/V） 大小范围（bp）
0.6% 0.8% 1.0% 1.2% 1.5% 2%
1000-23000 800-10000 400-8000 300-7000 200-4000 100-3000
不同类型琼脂糖的性质
琼脂糖类型
凝结温度/℃
标准琼脂糖
35~38 40~42