催化水解反应的金属酶

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3.催还机理
Na+，K+-ATP酶的基本功能是催化ATP末端 磷酸水解，进行Na+、K+ 的主动运送，以维持 细胞内Na+、K+ 浓度相对稳定，保持细胞膜内 外渗透压平衡 ATP水解是一个多步骤的连续反应。
ADP Mg
2+
K+
E1+ ATP
(1)
E1· ATP Na+, Mg2+ E1~P
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一些典型的金属水解酶模拟物
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金属水解酶模拟的发展
随着蛋白质工程技术的发展，金属水解酶活 性中心附近的一些弱相互作用如疏水、静电、 氢键和范德华力等成为新的研究热点。近年来， 超分子研究方法与技术的引入，使得金属水解 酶的模拟从酶催化中心的金属离子及其配位基 团的模拟，发展到对金属酶的催化中心及其亚 稳态、次层结构的疏水环境及底物识别基团的 模拟，在超分子层次上实现金属酶结构和功能 的模拟。
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碳酸酐酶的催化循环机理最广泛被人 接受的是所谓的锌-羟基机理。 但到底中间体Zn-HCO3-中与Zn2+ 配位 的HCO3- 中的氧原子采取的是单齿配 位还是双齿配位，这个问题并不清楚。
2. 催化机理
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Lipscomb机理(左)和Lindskog机理(右)
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1.组成与结构
Na+，K+-ATP酶由α 、β 两种亚单位 组成。有关α 和β 亚单位一、二、三级结 构的资料很少，因为蛋白裂解后其疏水片 段聚合在一起而造成测定的困难，氨基酸 顺序分析进展缓慢。 α 亚单位是催化亚单位，含有催化 ATP水解的活性部位。β 亚单位是糖蛋白， 其确切功能尚不清楚。
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碳酸酐酶催化CO2水合的反应机理示意图
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近年来对不同金属离子的碳酸酐酶模型 化合物的研究发现，其金属离子的催化 活性Zn2+ > Co2+ > > Ni2+ Cu2+，特别 是Cu2+ 取代的碳酸酐酶几乎没有催化活 性。研究表明四方锥构型的Cu2+ 配合物 不具有催化活性，而具有四方锥构型的 Zn2+ 配合物与CO2/HCO3-反应有最高的反 应活性。
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Thr199
Thr199 O - H+ Glu106 Zn N N NH His94 His96 (a) (b) NH + H+ O O
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O O H O H O H H H OZn HN His119 His94 N N NH His96 N
Glu106 HN His119 N
O2N O
O C
O2N
O P O
O O
NO2 O2N
O O P O O HPNP
OH
p-NA
BNPP
其中，对硝基苯酚醋酸酯(p-NA)常被用 作模拟羧酸酯或者蛋白质的肽键，双(对硝基苯 酚)磷酸酯(BNPP)常被用作模拟DNA磷酸双酯， 而2-羟丙基-对硝基苯酚磷酸酯(HPNP)因其具有 可亲核进攻磷原子的羟基而常被用作模拟RNA磷 酸双酯。
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我们要通过学科交叉，将合成化学、超 分子化学、界面化学等与生物无机化学相结 合，努力开拓金属水解酶模拟研究的新方向 主要包括： (1) 通过设计结构新颖的配体，赋予模拟物特 别的化学性质，从而实现金属水解酶模拟物 的高活性；
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(2) 设计杂化金属水解酶模拟物，即将具有催化 功能的金属配合物与主体分子(如蛋白质、 DNA、抗体、环糊精和杯芳烃等)进行有机/无 机杂化得到的催化剂, 提供特定的第二配位环 境，构建反应的预组织结构而诱导反应的区域/ 立体选择性，从而提高模拟酶的活性；
(2)
E2 - P
(4) ......
E1 + Pi
(3)
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四、金属水解酶模拟
解释： 构建结构与功能都能体现出天然金属 水解酶本身特点的模型物，通过研究这 些模型物来揭示天然水解酶结构与功能 的关系及其作用机制。
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反应过程
⑤ ④
①
② ③
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二、紫色酸性磷酸酯酶
紫色酸性磷酸酯酶（PAP）是含铁的糖蛋 白，能够从植物和动物体内分离出来，在微酸 性条件下，能催化水解磷酸酯，该类酶具双核 铁中心活性部位，每个蛋白有两个铁原子，两 个铁原子以Fe2+ Fe3+形式存在时，具有催化活 性。
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一、碱性磷酸酯酶
碱性磷酸酯酶(AP)是一种核酸酶,因 为它在pH为8是活性最大而得名，它 只催化磷酸酯的水解反应，而对磷 酸二酯无催化作用。它的催化活性 很高。
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AP的结构
虽然不同的酶的结构 有差异，但起反应活 性中心都是一样的， 含有一对Zn（Ⅱ）离 子和一个Mg（ Ⅱ ） 离子
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四、核酸酶P1
核酸酶P1中含有三个Zn2+ 离子，下图是核酸酶 P1的结构和金属离子的配位构型。
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第四节 其他金属水解酶 一、碳酸酐酶 二、亮氨酸氨肽酶 三、 Na+、K+-ATP酶 四、金属水解酶模拟
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一、碳酸酐酶
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2.辅助因子的特异性
Na+，K+-ATP 酶的最主要特征是它的 活性依赖于Na+ 和K+ 的存在。对Na+ 的 需要是绝对的，而K+ 则可以被Cs+、Li+ 和NH4+ 等多种一价阳离子代替。在 Na+/K+ 比值为5～10时，酶的活性最高。 任何一种离子超出其最大激活浓度都有 抑制作用，这可能与两种离子相互竞争 酶的活性部位有关。酶与底物结合还需 要Mg2+ 存在。
底物的代替
在金属水解酶模拟研究过程中，化学 家们通常选用一些活化了的小分子来替代 天然的大分子底物。这是因为，一方面天 然底物的结构复杂且异常稳定，通常难以 被水解，另一方面，这些小分子的水解反 应可以很简便地用化学、光谱手段进行监 测，可以为研究者提供大量有关反应机理 方面的信息。
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His325 Tyr167
Asp164 Asp135 O H Fe(III) O HO O P O-
His202 H
+
H His295
+
紫色酸性磷酸酯酶催化磷酸单酯水解的机理
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三、磷酸双酯酶
磷酸双酯酶的这种双金属协同作用的催 化机理也被用于解释催化DNA中磷酸双酯 键水解的金属酶的作用机理。 Base
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3.近期模拟研究
[Cu(phen)2OCO2H]＋
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[Cu(phen)2O2COH]＋
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Lipscomb和Lindskog中间体模拟分子的晶体结构
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4. 蛋白质工程
按人们意志改变蛋白质的结构和 功能或创造新的蛋白质的过程。 包括在体外改造已有的蛋白质， 化学合成新的蛋白质，通过基因 工程手段改造已有的或创建新的 编码蛋白质的基因去合成蛋白质 等。
NH
- HCO3-
+ HCO3(d) (c)
- CO2
+ CO2
Thr199 O O O OH C O - O Zn HN His119 His94 N N NH His96 N NH O O
Thr199 O O C
H
H
H
O Zn
ON
Glu106
Glu106 HN His119 His94 N N NH His96 NH
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三、Na+、K+-ATP酶
依赖于钠、钾的三磷酸腺苷酶， 简称Na+，K+-ATP 酶，广泛存在于各 种动物的细胞质膜上，其功能是催 化ATP水解，运送Na+ 和K+ 通过细胞 质膜，在维持细胞的渗透性、低Na+ 高K+ 的细胞内环境和细胞的静息电 位方面具有重要意义。
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(3) 构建完整的多金属酶仿生催化系统，通过超 分子和生物技术，将多个相关金属酶模拟物组 合到一起，从而实现对底物的完全催化。
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由于时间、 精力、可参考资 料有限，更重要 的是我们学识浅 薄，所以不当与 错误之处在所难 免，恳请刘院长 批评指正！
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菜豆紫色酸性磷酸酯酶(PDBID: 4KBP )的结构和活性中心
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过程
His323 His286 Zn(II) Asn201 OO R H+ His296 Asp164 His323 Asp135 O His325 His286 H O (III)Fe Zn(II) Tyr167 HO O O Asn201 P R O O O+ H+ His202 H H+ His296 His295 2+
碳酸酐酶(CA) 是一类广泛分布于 动物、植物及细菌体内参与酸碱平衡调 节及离子交换等过程的含锌金属酶。它 们最主要的生理功能是能可逆地催化二 氧化碳(CO2) 的水合过程，如方程式示： CO2 + H2O = HCO3- + H+
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碳酸酐酶在动物组织代谢和肺部间、许多 分泌过程、鸟外壳钙化及植物光合作用中 的CO2传输中起着重要作用，并维持细胞内 的CO2/HCO3-的平衡。 碳酸酐酶能可逆催化CO2的水合反应。 在生命体内能催化酯（羧酸酯、磷酸酯等） 和醛类等物质的水解反应。 研究发现碳酸酐酶对自然界碳酸盐岩溶解 的催化及在大气CO2沉降中有着重要的意义。
O O 3' O O
3' O 5' O OH
P
O
O
DNA聚合酶酶催化磷酸双酯水 解的过渡态模型
3'
H
Mg2+
Mg2+
O Glu357
.. . ... .
O .
O . .. . . . . . . O
Asp355
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需要强调的是，核酸酶活性中心双金 属结构并不是普遍存在的。许多核酸 酶，例如核糖核酸酶H、核酸内切酶 EcoRI和葡萄糖链球菌核酸酶的活性中 心都是单金属结构。而且，已有研究 人员对一些基于Mg2+ 的核酸酶的双金 属离子催化机理提出了质疑，因为这 种机理几乎仅仅是建立在少数几种酶 的晶体结构的基础之上。
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催化水解反应的金属酶
第三节 酯酶 一、碱性磷酸酯酶 二、紫色酸性磷酸酯酶 三、磷酸双酯酶 四、核酸酶P1 第四节 其他金属水解酶 一、碳酸酐酶 二、亮氨酸氨肽酶 三、Na+、K+-ATP酶 四、金属水解酶模拟
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第三节 酯酶
酯酶催化各种酯键水解。其中，羧酸 酯酶催化羧酸酯水解。 RCOO-R′ + H2O → RCOOH + R′OH 如脂肪酶、磷脂酶A。此外，磷酸酯酶 则催化磷酸酯键水解。 RO—PO(OH)—OR′+ H2O → RO— PO(OH)2 + R′OH 磷酸酯酶又分为磷酸单酯酶(底物R = H)，如碱性磷酸酯酶，以及磷酸二酯 酶，如磷脂酶C。
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二、亮氨酸氨肽酶
1.简介 亮氨酸氨肽酶是一种分布广泛的 肽链端解酶，它催化肽链N-末端水 解。 LAP是一种蛋白酶，LAP广泛 分布于人体各组织，以肝、胆、肾、 小肠以及子宫肌层内含量最多。
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2.结构
亮氨酸氨肽酶相对分子量为310 000，由6个相同的亚基构成。每个 亚基由478个氨基酸残基组成，亚基 的相对分子量为51 000，每个亚基 都不含二硫键，有7个游离的—SH基， 每个亚基都含有两个Zn2+。
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活性中心
围绕金属酶的结构与功能的关系， 早期研究主要集中在对金属酶活性中心 的金属离子及其配位原子的酶学和化学 模拟研究，并取得了非常重要的成果。 这些研究表明配体本身的结构，金属活 性中心的配位情况及多核金属之间的协 同作用都会对模型物的催化水解活性产 生非常大的影响。
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1.组成与结构
碳酸酐酶Ⅱ(PDBID: _3KKX )的结构和活性中心
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碳酸酐酶的活性中心除了Zn2+ 伴有重 要的催化角色外，其周围的疏水口袋 也有不可忽视的作用。研究发现它是 底物CO2分子的结合部位，起着固定 CO2分子的作用。另外，外层几个非 配位的氨基酸残基也起了很大的作用。