银杏GbPAL基因启动子表达载体的构建
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２ 结果与分析
２．１ ＧｂＰＡＬｐ 表达载体的构建 ＧｂＰＡＬ 基因 启 动 子 区 域 内 未 见 限 制 性 内 切 酶
ＢａｍＨ Ｉ和 ＨｉｎｄⅢ两个含有３５Ｓ启动子序列的酶切位 点，而植物表达载体 ｐＢＩ１２１上包含这两个酶切位点。 使用特异性引物（包含酶切位点及保护碱基序列）可扩 增得 到 两 端 含 有 ＢａｍＨ Ⅰ和 Ｈｉｎｄ Ⅲ 酶 切 位 点 的 ＧｂＰＡＬｐ片段，再 运 用 基 因 重 组 技 术，插 入 缺 失 ３５Ｓ 启 动子的植物表达载体ｐＢＩ１２１，从而构建 ＧｂＰＡＬ 基因 启动子表达载体ｐＢＩ１２１：ＧｂＰＡＬｐ（图１）。
［收 稿 日 期 ］ ２０１２－０１－０６；２０１２－０３－２７ 修 回 ［基金项目］ 国家自然科学基金项目“银杏叶黄酮关 键 基 因 ＧｂＰＡＬ１ 与 ＧｂＣＨＳ２ 启 动 子 的 克 隆 与 功 能 研 究”（３０９７１９７４）；湖 北 省 自 然 科 学
基 金 项 目 “银 杏 叶 黄 酮 合 成 中 两 个 关 键 酶 基 因 启 动 子 的 克 隆 与 功 能 分 析 ”（２００８ＣＤＡ０６１） ［作 者 简 介 ］ 李 金 宝 （１９８７－ ），女 ，在 读 硕 士 ，研 究 方 向 ：分 子 生 物 学 。Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｊｉｎｂａｏ６００＠１６３．ｃｏｍ ＊ 通 讯 作 者 ： 程 水 源 （１９６５－ ），男 ，教 授 ，博 士 生 导 师 ，从 事 植 物 次 生 代 谢 分 子 生 物 学 研 究 。Ｅ－ｍａｉｌ：ｓ＿ｙ＿ｃｈｅｎｇ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ
贵 州 农 业 科 学 ·１８· Ｇｕｉｚｈｏｕ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
１．２ 方法 １．２．１ ＧｂＰＡＬｐ 双酶 切 以 含 目 的 片 段 的 ｐＭＤ－ １８Ｔ－ＧｂＰＡＬｐ 载 体 为 模 板，使 用 引 物 ＰＡＬｐｒｏＳ２： ５’－ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＧＴＴＧＴＴＣＣＧＣＡＴＣＣＡＴＴＴ Ｔ－３ ’ 和 ＰＡＬｐｒｏＡ２： ５ ’－ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＣＡＧ－ ＧＡＡＣＧＧＡＧＣＣＡＡＡＴＡ－３’扩 增 得 到 带 有 Ｈｉｎｄ Ⅲ和 ＢａｍＨ Ｉ双酶切 位 点 的 启 动 子 片 段，回 收 并 纯 化。 １．２．２ ＧｂＰＡＬｐ 表 达 载 体 构 建 取 空 质 粒 ｐＢＩ１２１进行双酶切，去除３５Ｓ启动子。酶切后 Ｇｂ－ ＰＡＬ 基 因 启 动 子 片 段 与 酶 切 后 植 物 表 达 载 体 ｐＢＩ１２１ 进 行 连 接 反 应，反 应 体 系 为 （总 体 积 １０ μＬ）：ｐＢＩ１２１直链 １μＬ，酶 切 后 ＧｂＰＡＬｐ 为 ３μＬ， 连 接 缓 冲 液 （１０％）１ μＬ，Ｔ４ ＤＮＡ 连 接 酶 １ μＬ， ｄｄＨ２Ｏ ４μＬ，１６℃水浴过 夜。 将 连 接 后 植 物 表 达 载 体ｐＢＩ１２１转化到 大 肠 杆 菌 中，涂 抹 于 含 有 卡 那 霉 素（５０μｇ／ｍＬ）的 ＬＢ 固 体 平 板 上 ３７℃ 倒 置 培 养 １２～１８ｈ，参照 Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ等［８］方 法 提 取 ｐＢＩ１２１： ＧｂＰＡＬｐ 质粒 ＤＮＡ 进行检测。 １．２．３ ＧｂＰＡＬｐ 表达载体转 化 参 照 朱 锦 辉 等［９］ 方法，首 先 于 含 Ｒｉｆ ４０μｇ／ｍＬ 的 ＹＥＢ 液 体 培 养 基 中２８℃ 振 荡 活 化 根 癌 农 杆 菌 ＬＢＡ４４０４ 至 ＯＤ６００ 为 ０．５ 左 右，制 备 农 杆 菌 感 受 态 细 胞，然 后 将 ｐＢＩ１２１：ＧｂＰＡＬｐ 质 粒 ＤＮＡ 转 化 进 此 细 胞，接 种 于 ＹＥＢ 固体平板上（含５０μｇ／ｍＬ Ｋａｎ和４０μｇ／ｍＬ Ｒｉｆ），２８℃培 养 ４８ｈ 左 右，待 单 菌 落 长 出 后 挑 取 于 ＹＥＢ 中２８℃振 荡 培 养 过 夜，浑 浊 后 用 ＧｂＰＡＬｐ 特 异性引 物 进 行 菌 落 ＰＣＲ 检 测，并 参 照 Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ 等 方 ［８］ 法提取ｐＢＩ１２１：ＧｂＰＡＬｐ 质 粒 ＤＮＡ 进 一 步 进行酶切鉴定。
小一致；将酶切后的空 质 粒 和 引 入 酶 切 位 点 的 目 的 片 段 进 行 连 接 转 化 后，含 目 的 基 因 ｐＢＩ１２１：ＧｂＰＡＬｐ：
ＬＢＡ４４０４菌落培养成功。成功构建了 ＧｂＰＡＬ 基因启动子真核表达载体ｐＢＩ１２１：ＧｂＰＡＬｐ。
［关键词］银杏；ＧｂＰＡＬ 启动子；表达载体构建；转化
解 氨 酶 （Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｎｅ ａｍｍｏｎｉａｌ－ｌｙａｓｅ，ＰＡＬ， Ｅ．Ｃ４．３．１．５）是从初生代谢转入苯丙烷类 次 生 代 谢 第一步反应的酶，它催化 Ｌ－苯 丙 氨 酸 解 氨 生 成 反 式 肉桂酸，在高等植物 苯 丙 烷 等 次 生 代 谢 中 起 着 关 键 作用。植物启动子 是 重 要 的 顺 式 作 用 元 件，是 转 录 调控的中心，这些顺 式 元 件 也 存 在 于 黄 酮 途 径 所 涉 及 的 酶 的 编 码 基 因 启 动 子 区 域 等 ，如 肉 桂 酸－４－羟 化 酶、４－香豆酸辅酶 Ａ 连 接 酶 和 查 尔 酮 合 成 酶 （ＣＨＳ） 基因等 。 ［２－４］ 研究苯丙烷类相关酶基因启动 子，弄 清
Байду номын сангаас
［中 图 分 类 号 ］Ｓ７９２．９５
［文 献 标 识 码 ］Ａ
Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ ｏｆ ＰＡＬ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｉｎ Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａ
ＬＩ Ｊｉｎ－ｂａｏ１，ＴＡＮＧ Ｙｉｎ１，ＸＵ Ｆｅｎｇ１，ＣＨＥＮＧ Ｈｕａ２，ＬＩ Ｌｉｎ－ｌｉｎｇ２，ＣＨＥＮＧ Ｓｈｕｉ－ｙｕａｎ２＊
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ＧｂＰＡＬｐａｎｄ ｐｌａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＢＩ１２１ｗｅｒｅ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｗｉｔｈ ＢａｍＨ Ｉ＋ Ｈｉｎｄ Ⅲ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ＧｂＰＡＬｐｆｒａｇｍｅｎｔ ｗａｓ ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｐｌａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＢＩ１２１ ｗｉｔｈｏｕｔ ３５Ｓ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｂｙ Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ．Ｆｉｎａｌｌｙ ｔｈｅ ｐＢＩ１２１ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＧｂＰＡＬ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｗａｓ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｉｎｔｏ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＬＢＡ４４０４． Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＬＢＡ４４０４ｗｉｔｈ ｐＢＩ１２１：ＧｂＰＡＬｐ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ＰＣＲ ａｎｄ ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ．
杏叶中 类 黄 酮 生 物 合 成 过 程 中 的 两 个 关 键 酶 之 一 。 ［６］ 目前，有关 ＰＡＬ 基因启动子调控类黄酮代谢 的研究鲜有报道。 研 究 ＰＡＬ 基 因 启 动 子 的 功 能 有 助于了解银杏类黄酮合成代谢的分子机制。对此，
笔者等在前期已通过 Ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｉｎｇ技术克隆银 杏 ＧｂＰＡＬ 基 因 启 动 子 （ＧｂＰＡＬｐ）序 列 的 ［７］ 基 础 之 上，构建了 ＧｂＰＡＬ 启动子的 植 物 表 达 载 体，为 利 用 ＧｂＰＡＬ 启 动 子 驱 动 ＧＵＳ 基 因 的 表 达，进 而 弄 清 ＧｂＰＡＬ 启动子调控类黄酮代谢的功能奠定基础。
图１ 植物表达载体 ｐＢＩ１２１：ＧｂＰＡＬｐ 的构建 Ｆｉｇ．１ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ
ｆｏｒ ｐＢＩ１２１：ＧｂＰＡＬｐ
注：Ｍ 为 ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ ＤＬ２０００，ａ 为 ＧｂＰＡＬ 启 动 子 片 段 纯 化 产 物，ｂ为 ＢａｍＨ Ｉ和 Ｈｉｎｄ Ⅲ双酶切 ＧｂＰＡＬ 启动子片段纯化产物。 Ｎｏｔｅ：Ｍ，Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ２０００；ａ，Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ＧｂＰＡＬ ｐｒｏ－ ｍｏｔｅｒ ｆｒａｇｍｅｎｔ；ｂ，Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ＧｂＰＡＬ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｂｙ ＢａｍＨ Ｉ ａｎｄ Ｈｉｎｄ Ⅲ． 图 ２ ＧｂＰＡＬ 启 动 子 片 段 纯 化 产 物 及 ＢａｍＨ Ⅰ 和
贵 州 农 业 科 学 ２０１２，４０（５）：１７～１９ Ｇｕｉｚｈｏｕ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
［文 章 编 号 ］１００１－３６０１（２０１２）０５－０２３６－００１７－０３
银杏 ＧｂＰＡＬ 基因启动子表达载体的构建
李金宝１，唐 寅１，许 锋１，程 华２，李琳玲２，程水源２ ＊
（１．长江大学 园艺园林学院，湖北 荆州 ４３４０２５；２．黄冈 师 范 学 院 经 济 林 木 种 质 改 良 与 资 源 综 合 利用湖北省重点实验室，湖北 黄冈 ４３８０００）
［摘 要］为 弄 清 ＧｂＰＡＬ 启 动 子 调 控 类 黄 酮 代 谢 的 功 能，采 用 双 酶 切 方 法，用 ＢａｍＨ Ｉ＋Ｈｉｎｄ Ⅲ 将
其代谢过程，有助于 研 究 苯 丙 烷 次 生 代 谢 产 物 分 子 调控［５］。银杏（Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａ）是世界上古老 的 孓 遗 植 物 ，其 中 黄 酮 类 化 合 物 具 有 重 要 的 药 用 价 值 ，对 其 活性成分的研究最为广泛和深入。此成分在银杏各 器官均有分布，但 在 叶 中 的 含 量 最 高。 笔 者 所 在 项 目 组 前 期 研 究 表 明，苯 丙 氨 酸 解 氨 酶 （ＰＡＬ，ＥＣ ４１３１１１５）活 性 与 叶 黄 酮 的 合 成 积 累 成 正 相 关，是 银
ＧｂＰＡＬｐ 与植物表达载体ｐＢＩ１２１分别酶切纯化，通过 Ｔ４ＤＮＡ 连接酶将 ＧｂＰＡＬｐ 片段连接到已切除 ３５Ｓ
启动子的植物表达载体ｐＢＩ１２１上，并转化到农杆菌 ＬＢＡ４４０４上，然后进行菌落 ＰＣＲ 及酶切鉴定。 结果表
明：扩增到的 ＧｂＰＡＬｐ 片段成功引入了ＢａｍＨ Ｉ和 Ｈｉｎｄ Ⅲ 酶切位点，ＧｂＰＡＬｐ 酶切后与酶切前的条 带 大
Ｈｉｎｄ Ⅲ的双酶切 Ｆｉｇ．２ Ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ＧｂＰＡＬ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｆｒａｇｍｅｎｔ
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａ；ＧｂＰＡＬ ｐｒｏｍｏｔｅｒ；ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ；ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ
苯丙烷类合成代谢为高等植物提供了多种化合 物，其在植物的发育 及 耐 逆 性 （如 机 械 损 伤、病 原 菌 侵染、紫外等）方面发挥了重要的作用 。 ［１］ 苯丙 氨 酸
１ 材料与方法
１．１ 材料 植 物 表 达 载 体 ｐＢＩ１２１、大 肠 杆 菌 （Ｅ．ｃｏｌｉ
ＴＯＰ１０）、农 杆 菌 （Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＬＢＡ４４０４），均 为 楚 天 学 者 及 园 艺 作 物 逆 境 生 理 实 验室保存。限制性内 切 酶 Ｂａｍ ＨⅠ、Ｈｉｎｄ Ⅲ、Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ、胶 回 收 试 剂 盒、ｐＭＤ－１８Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ、 Ｋａｎ、Ａｍｐ、引 物、ＰＣＲ 体 系 及 耗 材 等 分 别 购 自 不 同 生物公司。
（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｇａｒｄｅｎｉｎｇ，Ｙａｎｇｔｚｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉｎｇｚｈｏｕ，Ｈｕｂｅｉ ４３４０２５；２．Ｈｕｂｅｉ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ａｎｄ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｃｏｎｏｍｉｃ Ｆｏｒｅｓｔ，Ｈｕａｎｇｇａｎｇ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｈｕａｎｇｇａｎｇ，Ｈｕｂｅｉ ４３８０００，Ｃｈｉｎａ）
２．１ ＧｂＰＡＬｐ 表达载体的构建 ＧｂＰＡＬ 基因 启 动 子 区 域 内 未 见 限 制 性 内 切 酶
ＢａｍＨ Ｉ和 ＨｉｎｄⅢ两个含有３５Ｓ启动子序列的酶切位 点，而植物表达载体 ｐＢＩ１２１上包含这两个酶切位点。 使用特异性引物（包含酶切位点及保护碱基序列）可扩 增得 到 两 端 含 有 ＢａｍＨ Ⅰ和 Ｈｉｎｄ Ⅲ 酶 切 位 点 的 ＧｂＰＡＬｐ片段，再 运 用 基 因 重 组 技 术，插 入 缺 失 ３５Ｓ 启 动子的植物表达载体ｐＢＩ１２１，从而构建 ＧｂＰＡＬ 基因 启动子表达载体ｐＢＩ１２１：ＧｂＰＡＬｐ（图１）。
［收 稿 日 期 ］ ２０１２－０１－０６；２０１２－０３－２７ 修 回 ［基金项目］ 国家自然科学基金项目“银杏叶黄酮关 键 基 因 ＧｂＰＡＬ１ 与 ＧｂＣＨＳ２ 启 动 子 的 克 隆 与 功 能 研 究”（３０９７１９７４）；湖 北 省 自 然 科 学
基 金 项 目 “银 杏 叶 黄 酮 合 成 中 两 个 关 键 酶 基 因 启 动 子 的 克 隆 与 功 能 分 析 ”（２００８ＣＤＡ０６１） ［作 者 简 介 ］ 李 金 宝 （１９８７－ ），女 ，在 读 硕 士 ，研 究 方 向 ：分 子 生 物 学 。Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｊｉｎｂａｏ６００＠１６３．ｃｏｍ ＊ 通 讯 作 者 ： 程 水 源 （１９６５－ ），男 ，教 授 ，博 士 生 导 师 ，从 事 植 物 次 生 代 谢 分 子 生 物 学 研 究 。Ｅ－ｍａｉｌ：ｓ＿ｙ＿ｃｈｅｎｇ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ
贵 州 农 业 科 学 ·１８· Ｇｕｉｚｈｏｕ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
１．２ 方法 １．２．１ ＧｂＰＡＬｐ 双酶 切 以 含 目 的 片 段 的 ｐＭＤ－ １８Ｔ－ＧｂＰＡＬｐ 载 体 为 模 板，使 用 引 物 ＰＡＬｐｒｏＳ２： ５’－ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＧＴＴＧＴＴＣＣＧＣＡＴＣＣＡＴＴＴ Ｔ－３ ’ 和 ＰＡＬｐｒｏＡ２： ５ ’－ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＣＡＧ－ ＧＡＡＣＧＧＡＧＣＣＡＡＡＴＡ－３’扩 增 得 到 带 有 Ｈｉｎｄ Ⅲ和 ＢａｍＨ Ｉ双酶切 位 点 的 启 动 子 片 段，回 收 并 纯 化。 １．２．２ ＧｂＰＡＬｐ 表 达 载 体 构 建 取 空 质 粒 ｐＢＩ１２１进行双酶切，去除３５Ｓ启动子。酶切后 Ｇｂ－ ＰＡＬ 基 因 启 动 子 片 段 与 酶 切 后 植 物 表 达 载 体 ｐＢＩ１２１ 进 行 连 接 反 应，反 应 体 系 为 （总 体 积 １０ μＬ）：ｐＢＩ１２１直链 １μＬ，酶 切 后 ＧｂＰＡＬｐ 为 ３μＬ， 连 接 缓 冲 液 （１０％）１ μＬ，Ｔ４ ＤＮＡ 连 接 酶 １ μＬ， ｄｄＨ２Ｏ ４μＬ，１６℃水浴过 夜。 将 连 接 后 植 物 表 达 载 体ｐＢＩ１２１转化到 大 肠 杆 菌 中，涂 抹 于 含 有 卡 那 霉 素（５０μｇ／ｍＬ）的 ＬＢ 固 体 平 板 上 ３７℃ 倒 置 培 养 １２～１８ｈ，参照 Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ等［８］方 法 提 取 ｐＢＩ１２１： ＧｂＰＡＬｐ 质粒 ＤＮＡ 进行检测。 １．２．３ ＧｂＰＡＬｐ 表达载体转 化 参 照 朱 锦 辉 等［９］ 方法，首 先 于 含 Ｒｉｆ ４０μｇ／ｍＬ 的 ＹＥＢ 液 体 培 养 基 中２８℃ 振 荡 活 化 根 癌 农 杆 菌 ＬＢＡ４４０４ 至 ＯＤ６００ 为 ０．５ 左 右，制 备 农 杆 菌 感 受 态 细 胞，然 后 将 ｐＢＩ１２１：ＧｂＰＡＬｐ 质 粒 ＤＮＡ 转 化 进 此 细 胞，接 种 于 ＹＥＢ 固体平板上（含５０μｇ／ｍＬ Ｋａｎ和４０μｇ／ｍＬ Ｒｉｆ），２８℃培 养 ４８ｈ 左 右，待 单 菌 落 长 出 后 挑 取 于 ＹＥＢ 中２８℃振 荡 培 养 过 夜，浑 浊 后 用 ＧｂＰＡＬｐ 特 异性引 物 进 行 菌 落 ＰＣＲ 检 测，并 参 照 Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ 等 方 ［８］ 法提取ｐＢＩ１２１：ＧｂＰＡＬｐ 质 粒 ＤＮＡ 进 一 步 进行酶切鉴定。
小一致；将酶切后的空 质 粒 和 引 入 酶 切 位 点 的 目 的 片 段 进 行 连 接 转 化 后，含 目 的 基 因 ｐＢＩ１２１：ＧｂＰＡＬｐ：
ＬＢＡ４４０４菌落培养成功。成功构建了 ＧｂＰＡＬ 基因启动子真核表达载体ｐＢＩ１２１：ＧｂＰＡＬｐ。
［关键词］银杏；ＧｂＰＡＬ 启动子；表达载体构建；转化
解 氨 酶 （Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｎｅ ａｍｍｏｎｉａｌ－ｌｙａｓｅ，ＰＡＬ， Ｅ．Ｃ４．３．１．５）是从初生代谢转入苯丙烷类 次 生 代 谢 第一步反应的酶，它催化 Ｌ－苯 丙 氨 酸 解 氨 生 成 反 式 肉桂酸，在高等植物 苯 丙 烷 等 次 生 代 谢 中 起 着 关 键 作用。植物启动子 是 重 要 的 顺 式 作 用 元 件，是 转 录 调控的中心，这些顺 式 元 件 也 存 在 于 黄 酮 途 径 所 涉 及 的 酶 的 编 码 基 因 启 动 子 区 域 等 ，如 肉 桂 酸－４－羟 化 酶、４－香豆酸辅酶 Ａ 连 接 酶 和 查 尔 酮 合 成 酶 （ＣＨＳ） 基因等 。 ［２－４］ 研究苯丙烷类相关酶基因启动 子，弄 清
Байду номын сангаас
［中 图 分 类 号 ］Ｓ７９２．９５
［文 献 标 识 码 ］Ａ
Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ ｏｆ ＰＡＬ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｉｎ Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａ
ＬＩ Ｊｉｎ－ｂａｏ１，ＴＡＮＧ Ｙｉｎ１，ＸＵ Ｆｅｎｇ１，ＣＨＥＮＧ Ｈｕａ２，ＬＩ Ｌｉｎ－ｌｉｎｇ２，ＣＨＥＮＧ Ｓｈｕｉ－ｙｕａｎ２＊
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ＧｂＰＡＬｐａｎｄ ｐｌａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＢＩ１２１ｗｅｒｅ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｗｉｔｈ ＢａｍＨ Ｉ＋ Ｈｉｎｄ Ⅲ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ＧｂＰＡＬｐｆｒａｇｍｅｎｔ ｗａｓ ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｐｌａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＢＩ１２１ ｗｉｔｈｏｕｔ ３５Ｓ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｂｙ Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ．Ｆｉｎａｌｌｙ ｔｈｅ ｐＢＩ１２１ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＧｂＰＡＬ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｗａｓ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｉｎｔｏ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＬＢＡ４４０４． Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＬＢＡ４４０４ｗｉｔｈ ｐＢＩ１２１：ＧｂＰＡＬｐ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ＰＣＲ ａｎｄ ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ．
杏叶中 类 黄 酮 生 物 合 成 过 程 中 的 两 个 关 键 酶 之 一 。 ［６］ 目前，有关 ＰＡＬ 基因启动子调控类黄酮代谢 的研究鲜有报道。 研 究 ＰＡＬ 基 因 启 动 子 的 功 能 有 助于了解银杏类黄酮合成代谢的分子机制。对此，
笔者等在前期已通过 Ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｉｎｇ技术克隆银 杏 ＧｂＰＡＬ 基 因 启 动 子 （ＧｂＰＡＬｐ）序 列 的 ［７］ 基 础 之 上，构建了 ＧｂＰＡＬ 启动子的 植 物 表 达 载 体，为 利 用 ＧｂＰＡＬ 启 动 子 驱 动 ＧＵＳ 基 因 的 表 达，进 而 弄 清 ＧｂＰＡＬ 启动子调控类黄酮代谢的功能奠定基础。
图１ 植物表达载体 ｐＢＩ１２１：ＧｂＰＡＬｐ 的构建 Ｆｉｇ．１ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ
ｆｏｒ ｐＢＩ１２１：ＧｂＰＡＬｐ
注：Ｍ 为 ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ ＤＬ２０００，ａ 为 ＧｂＰＡＬ 启 动 子 片 段 纯 化 产 物，ｂ为 ＢａｍＨ Ｉ和 Ｈｉｎｄ Ⅲ双酶切 ＧｂＰＡＬ 启动子片段纯化产物。 Ｎｏｔｅ：Ｍ，Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ２０００；ａ，Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ＧｂＰＡＬ ｐｒｏ－ ｍｏｔｅｒ ｆｒａｇｍｅｎｔ；ｂ，Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ＧｂＰＡＬ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｂｙ ＢａｍＨ Ｉ ａｎｄ Ｈｉｎｄ Ⅲ． 图 ２ ＧｂＰＡＬ 启 动 子 片 段 纯 化 产 物 及 ＢａｍＨ Ⅰ 和
贵 州 农 业 科 学 ２０１２，４０（５）：１７～１９ Ｇｕｉｚｈｏｕ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
［文 章 编 号 ］１００１－３６０１（２０１２）０５－０２３６－００１７－０３
银杏 ＧｂＰＡＬ 基因启动子表达载体的构建
李金宝１，唐 寅１，许 锋１，程 华２，李琳玲２，程水源２ ＊
（１．长江大学 园艺园林学院，湖北 荆州 ４３４０２５；２．黄冈 师 范 学 院 经 济 林 木 种 质 改 良 与 资 源 综 合 利用湖北省重点实验室，湖北 黄冈 ４３８０００）
［摘 要］为 弄 清 ＧｂＰＡＬ 启 动 子 调 控 类 黄 酮 代 谢 的 功 能，采 用 双 酶 切 方 法，用 ＢａｍＨ Ｉ＋Ｈｉｎｄ Ⅲ 将
其代谢过程，有助于 研 究 苯 丙 烷 次 生 代 谢 产 物 分 子 调控［５］。银杏（Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａ）是世界上古老 的 孓 遗 植 物 ，其 中 黄 酮 类 化 合 物 具 有 重 要 的 药 用 价 值 ，对 其 活性成分的研究最为广泛和深入。此成分在银杏各 器官均有分布，但 在 叶 中 的 含 量 最 高。 笔 者 所 在 项 目 组 前 期 研 究 表 明，苯 丙 氨 酸 解 氨 酶 （ＰＡＬ，ＥＣ ４１３１１１５）活 性 与 叶 黄 酮 的 合 成 积 累 成 正 相 关，是 银
ＧｂＰＡＬｐ 与植物表达载体ｐＢＩ１２１分别酶切纯化，通过 Ｔ４ＤＮＡ 连接酶将 ＧｂＰＡＬｐ 片段连接到已切除 ３５Ｓ
启动子的植物表达载体ｐＢＩ１２１上，并转化到农杆菌 ＬＢＡ４４０４上，然后进行菌落 ＰＣＲ 及酶切鉴定。 结果表
明：扩增到的 ＧｂＰＡＬｐ 片段成功引入了ＢａｍＨ Ｉ和 Ｈｉｎｄ Ⅲ 酶切位点，ＧｂＰＡＬｐ 酶切后与酶切前的条 带 大
Ｈｉｎｄ Ⅲ的双酶切 Ｆｉｇ．２ Ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ＧｂＰＡＬ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｆｒａｇｍｅｎｔ
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａ；ＧｂＰＡＬ ｐｒｏｍｏｔｅｒ；ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ；ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ
苯丙烷类合成代谢为高等植物提供了多种化合 物，其在植物的发育 及 耐 逆 性 （如 机 械 损 伤、病 原 菌 侵染、紫外等）方面发挥了重要的作用 。 ［１］ 苯丙 氨 酸
１ 材料与方法
１．１ 材料 植 物 表 达 载 体 ｐＢＩ１２１、大 肠 杆 菌 （Ｅ．ｃｏｌｉ
ＴＯＰ１０）、农 杆 菌 （Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＬＢＡ４４０４），均 为 楚 天 学 者 及 园 艺 作 物 逆 境 生 理 实 验室保存。限制性内 切 酶 Ｂａｍ ＨⅠ、Ｈｉｎｄ Ⅲ、Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ、胶 回 收 试 剂 盒、ｐＭＤ－１８Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ、 Ｋａｎ、Ａｍｐ、引 物、ＰＣＲ 体 系 及 耗 材 等 分 别 购 自 不 同 生物公司。
（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｇａｒｄｅｎｉｎｇ，Ｙａｎｇｔｚｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉｎｇｚｈｏｕ，Ｈｕｂｅｉ ４３４０２５；２．Ｈｕｂｅｉ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ａｎｄ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｃｏｎｏｍｉｃ Ｆｏｒｅｓｔ，Ｈｕａｎｇｇａｎｇ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｈｕａｎｇｇａｎｇ，Ｈｕｂｅｉ ４３８０００，Ｃｈｉｎａ）