《宏基因组文库构建》PPT课件
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宏基因组文库构建
宏基因组文库构建宏基因组文库构建分子微生物生态学的研究业已证明环境中大量存在未能培养的微生物，某些环境中采用现有培养技术能够培养的微生物不到1%，超过99%的微生物尚未能培养(1)，可见基于微生物分离培养的技术途径开发利用微生物资源受到了极大的限制。
为了突破上述限制，充分挖掘和利用微生物的多样性基因资源，人们在寻找新技术方法上倾注了极大的热情。
“宏基因组（Metagenome）”是由Handelsman等1998年提出的新名词，其定义为“the genomes of the total microbiota found in nature”，即生境中全部微小生物遗传物质的总和，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和（2 ）。
宏基因组文库既包含了可培养的又包含了未能培养的微生物基因，避开了微生物分离培养的问题，极大地扩展了微生物资源的利用空间。
目前已采用土壤、海水、海洋浮游生物、海棉、甲虫、人唾液等环境样品成功构建了宏基因组文库，已筛选到的生物活性物质有各种酶类及一些次生代谢产物，包括脂酶/酯酶、蛋白酶、淀粉酶、氧化酶、几丁质酶、核酸酶、膜蛋白、4-羟基丁酸代谢酶系、生物素合成酶系、色素、抗菌抗肿瘤活性物质及抗生素抗性基因等（3、4、5）。
一、实验原理1、基本原理从环境样品中直接提取总DNA，经纯化后部分酶切，然后把这些DNA片段连接到载体上，转化替代宿主细胞，形成一个重组DNA文库即宏基因组文库。
获得的克隆子根据宿主细胞获得的新功能进行筛选, 或用相关已知序列设计探针或PCR引物寻找并分离目的基因片段，加上表达调控元件后使目的基因表达，从而获得产物。
2、载体促使宏基因或基因簇在重组克隆子中表达或提高表达量，载体起着重要作用。
载体的选择主要是针对有利于感兴趣的目标产物基因的表达、目标基因的扩增及在筛选细胞毒类物质时表达量的调控等。
1）大片段插入载体由于很多微生物活性物质是其次生代谢产物，代谢途径由多基因簇调控，尽量插入大片段DNA以获得完整的代谢途径多基因簇是很有必要的。
宏基因组学的PPT
宏基因组学的PPT宏基因组学是通过收集宿主的粪便里的微生物、以及培养皿中的微生物，利用专业的宏基因组技术进行分析。
它能够获得宏基因组信息和相关序列，从而为疾病相关症状的诊断和治疗提供依据。
随着人类健康问题愈演愈烈，为了降低成本，并能通过生物技术进行治疗，研究人员开发了宏基因组学技术。
其通过收集环境中存在的特定细菌，来分析它们在土壤、水源或大气中的分布，以了解它们在整个生态系统中所扮演的角色。
宏基因组学（宏测序法）是一种对人体和环境进行科学评价（包括微生物菌群与疾病之间关系）的工具。
它是一种高通量方法来鉴定微生物群落或疾病（包括寄生虫病等),并用于进行疾病和环境健康状态跟踪和诊断。
虽然宏基因组学可以通过分析病原体来诊断疾病——但目前还没有针对特定微生物群落或某一种病原体开展研究。
1.目的宏基因组学通过收集宿主的粪便和排泄物，以及在培养皿或土壤中的特定微生物群落来检测微生物菌群。
它们在宿主的整个生命周期中都是重要的，并且是许多宿主健康相关问题发生和治疗的潜在因素之一。
通过对宿主宏基因组学数据进行统计分析，可以更好地了解宿主微生物多样性与环境健康状况之间的关系；进而有助于了解宿主肠道微生物及其他微生物群落对人体健康所发挥作用；同时也有助于了解特定微生物群落与其健康状况之间的关系。
此外，还可以通过研究宿主体内微生物种群之间互相作用机制，从而更好地理解宿主微生物群落结构及疾病发生背后原因。
这为人类健康提供了新的见解。
在环境方面，宏基因组学可以从宿主微生物群落中发现与生态系统结构相关、通过检测宿主体内微生物群落来揭示生命现象本质和机制；还可以通过感染或死亡微生物群落以及与宿主相互交互作用规律来揭示微生物群落与疾病发生之间关系：同时宏基因组学还可以为相关研究人员提供研究资源、为治疗提供科学依据。
此外，宏基因组学还能为环境健康状态跟踪和诊断提供参考——为了解环境健康状态和健康风险提供科学依据。
2.方法原理在了解宿主肠道中的微生物群落的组成之后，宏基因组学可以分析宿主的粪便样本。
宏基因组和宏蛋白组ppt课件
6
环境微生物群落多样性分析测序区域
7
Shannon Ra 曲 线
物 种 累 曲 线
8
环境微生物群落多样性分析测序
9
环境微生物群落多样性分析测序
10
环境微生物群落多样性分析测序
11
环境微生物群落多样性分析测序的研究特性
• 有效的对微生物群落进行分类，物种组成以及进化关系的 分析。
15
本文通过宏蛋白组学方法，揭示了贫 瘠土壤与肥沃土壤中微生物种群的不 同生物学功能： 1. 种群结构趋向一致 2. 贫瘠土壤中基因功能偏向于C源和N
源的固定 3. 肥沃土壤基因功能偏向于对腐殖质
的分解利用
作者认为宏蛋白组学能够有效 的揭示不同环境下土壤微生物 群落功能的异质性，不同的生 化趋势，不同的生物地理特征
17
本文作者追踪研究了执行不同海 域任务军舰的壳体水线的生物膜 中的微生物群落物种丰度及功能 特性，阐述了微生物群落在不同 的物理、化学、地理和季节因素 下的变化和特性； 研究方式整合了宏基因组分析和 宏蛋白组分析的研究方案，为 meta-omics研究模式提供了很好 的范例。
18
宏蛋白组的研究现状
(1)可以捕捉新的功能基因和代谢途径； (2)鉴定与特异胁迫有关的蛋白。蛋白质组学联合宏基因组数据可以更好地揭示环境群落分类多样 性、功能多样性和生物过程。
目前成熟的蛋白组研究手段为宏蛋白组研究提供了可靠的工具 • 2DGE-LC-MS • 2DLC-MS • Itraq • Labelfree
14
• 无需培养分离菌群：
直接从环境样本中扩增核糖体rDNA高变区进行测序，解决了 大部分菌株不可培养的难题。
• 客观还原菌群结构：
专业、成熟、稳定的样本制备流程，严格控制PCR循环数， 客观还原样品本身的菌群结构及丰度比例。
环境微生物群落多样性分析测序区域
7
Shannon Ra 曲 线
物 种 累 曲 线
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环境微生物群落多样性分析测序
9
环境微生物群落多样性分析测序
10
环境微生物群落多样性分析测序
11
环境微生物群落多样性分析测序的研究特性
• 有效的对微生物群落进行分类，物种组成以及进化关系的 分析。
15
本文通过宏蛋白组学方法，揭示了贫 瘠土壤与肥沃土壤中微生物种群的不 同生物学功能： 1. 种群结构趋向一致 2. 贫瘠土壤中基因功能偏向于C源和N
源的固定 3. 肥沃土壤基因功能偏向于对腐殖质
的分解利用
作者认为宏蛋白组学能够有效 的揭示不同环境下土壤微生物 群落功能的异质性，不同的生 化趋势，不同的生物地理特征
17
本文作者追踪研究了执行不同海 域任务军舰的壳体水线的生物膜 中的微生物群落物种丰度及功能 特性，阐述了微生物群落在不同 的物理、化学、地理和季节因素 下的变化和特性； 研究方式整合了宏基因组分析和 宏蛋白组分析的研究方案，为 meta-omics研究模式提供了很好 的范例。
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宏蛋白组的研究现状
(1)可以捕捉新的功能基因和代谢途径； (2)鉴定与特异胁迫有关的蛋白。蛋白质组学联合宏基因组数据可以更好地揭示环境群落分类多样 性、功能多样性和生物过程。
目前成熟的蛋白组研究手段为宏蛋白组研究提供了可靠的工具 • 2DGE-LC-MS • 2DLC-MS • Itraq • Labelfree
14
• 无需培养分离菌群：
直接从环境样本中扩增核糖体rDNA高变区进行测序，解决了 大部分菌株不可培养的难题。
• 客观还原菌群结构：
专业、成熟、稳定的样本制备流程，严格控制PCR循环数， 客观还原样品本身的菌群结构及丰度比例。
基因组文库的构建.ppt
重 组cDNA的总和，通常是在细菌或酵母中。 这些克隆代表从某个特定物种或器官的所 有mRNA制备得到的cDNA。
cDNA分子克隆(cDNA clone) ：将 cDNA片段装在载体上转化细菌,组中分离单拷贝的基因；N
AAAAAAA mRNA
(b)寡聚(dT)引物
第一条 cDNA 的合成
An
An
Tn
(c)发夹引物
第二条 cDNA 的合成
TTTTTTຫໍສະໝຸດ GGGGGGCCCCCC
加接头 1
TTTTTT
GGGGGG
AAAAAA
CCCCCC
(d)同聚物加尾反应 TTTTTT
TTTTTT AAAAAA
连接 DNA 片段和载体
重组载体 DNA 导入 E.coli (体外包装或转化)
基因库的鉴定与段的产生与分离
一.基因组DNA的片段化
1.用限制酶片段化:
用限制酶消化DNA，不经凝胶电泳分部离,直接和载体 连接的克隆方法叫鸟枪法(shot-gan approach)
(2)有的基因表达具有严格的时空性，要获得 其mRNA并非易事。用不同发育阶段，或差A。不能用于基因结构和调节的研 究。一个基因经不同的剪接可产生不同的部 分重叠的cDNA克隆。
高速搅拌：1500转/分×30分 长度8kb的分子群体。
可切 平均
3.双酶消化
单酶消化的产物一般分子较大，选择时要考 虑到载体容量，如噬菌体插入片段不超过 25kb,为此可选用识别4bp的限制酶(切割平 均长度为256bp) ,识别6bp的限制酶切割平 均长度4096 bp.
双酶切产生的DNA片段平均大小不超过1kb, 但如采用双酶部分消化，产物的分子量 可达10～30kb,它们存在着随机序重叠， 用蔗糖梯度离心或凝胶电泳可将这些片 段群体按大小分开，可得到的分子量大 小约为20kb的随机DNA片段群体。
cDNA分子克隆(cDNA clone) ：将 cDNA片段装在载体上转化细菌,组中分离单拷贝的基因；N
AAAAAAA mRNA
(b)寡聚(dT)引物
第一条 cDNA 的合成
An
An
Tn
(c)发夹引物
第二条 cDNA 的合成
TTTTTTຫໍສະໝຸດ GGGGGGCCCCCC
加接头 1
TTTTTT
GGGGGG
AAAAAA
CCCCCC
(d)同聚物加尾反应 TTTTTT
TTTTTT AAAAAA
连接 DNA 片段和载体
重组载体 DNA 导入 E.coli (体外包装或转化)
基因库的鉴定与段的产生与分离
一.基因组DNA的片段化
1.用限制酶片段化:
用限制酶消化DNA，不经凝胶电泳分部离,直接和载体 连接的克隆方法叫鸟枪法(shot-gan approach)
(2)有的基因表达具有严格的时空性，要获得 其mRNA并非易事。用不同发育阶段，或差A。不能用于基因结构和调节的研 究。一个基因经不同的剪接可产生不同的部 分重叠的cDNA克隆。
高速搅拌：1500转/分×30分 长度8kb的分子群体。
可切 平均
3.双酶消化
单酶消化的产物一般分子较大，选择时要考 虑到载体容量，如噬菌体插入片段不超过 25kb,为此可选用识别4bp的限制酶(切割平 均长度为256bp) ,识别6bp的限制酶切割平 均长度4096 bp.
双酶切产生的DNA片段平均大小不超过1kb, 但如采用双酶部分消化，产物的分子量 可达10～30kb,它们存在着随机序重叠， 用蔗糖梯度离心或凝胶电泳可将这些片 段群体按大小分开，可得到的分子量大 小约为20kb的随机DNA片段群体。
宏基因组-PPT
Cloning vectors Size of inser segments Vector structure Expresslion hosts
Escherchia coli Escherchia coli Escherchia coli Escherchia coli Escherchia coli Saccharomyces
2.环境保护和污染修复
挖掘降解基因和功能菌株，进行生物修复 获取任何序列的基因或功能，由此合成新物质或发 现新的生物物种。 发掘极端环境为生物的新物种，了解其耐受机制， 帮助极端环境的污染修复。 从宏基因组中分离的重要基因元件组编成具有其他 活性成分、或可降解污染物功能的基因簇，以替代 原有不易降解化合物，或直接降解环境中石油烃、 有害有害化合物、重金属。
（1）基于序列的筛选方法
②.焦磷酸测序( Pyrosequencing)
焦磷酸测序技术是在焦磷酸盐测序法的基础 上结合一种乳胶材料和皮升级反应孔，将基因组 DNA 进行随机切割，批量地进行整个测序反应， 能够在相同的时间内破译 6×106组以上的基因组 序列，比 Sanger法要快100倍，提高了测序的效 率。
底物诱导基因 表达法SIGEX screening
1.样品中DNA的提取和富集
采用合适的方法，既要尽可能地完全抽提出 环境样品中的DNA，又要保持较大的片段以 获得完整的目的基因或基因簇。所以提取原 则是在最大提取量和最小剪切力之间折中 常用的提取方法有直接裂解法和间接提取法 (细胞提取法)
3.开拓天然产物新资源
2000年8月, Brady和 Clardy等人构建了一 个含有约7000000个5个, 并从 其中一个克隆发酵物 中分离出一系列具有 抗菌活性的长链N2酰 基酪氨酸类新化合物 1213
Escherchia coli Escherchia coli Escherchia coli Escherchia coli Escherchia coli Saccharomyces
2.环境保护和污染修复
挖掘降解基因和功能菌株，进行生物修复 获取任何序列的基因或功能，由此合成新物质或发 现新的生物物种。 发掘极端环境为生物的新物种，了解其耐受机制， 帮助极端环境的污染修复。 从宏基因组中分离的重要基因元件组编成具有其他 活性成分、或可降解污染物功能的基因簇，以替代 原有不易降解化合物，或直接降解环境中石油烃、 有害有害化合物、重金属。
（1）基于序列的筛选方法
②.焦磷酸测序( Pyrosequencing)
焦磷酸测序技术是在焦磷酸盐测序法的基础 上结合一种乳胶材料和皮升级反应孔，将基因组 DNA 进行随机切割，批量地进行整个测序反应， 能够在相同的时间内破译 6×106组以上的基因组 序列，比 Sanger法要快100倍，提高了测序的效 率。
底物诱导基因 表达法SIGEX screening
1.样品中DNA的提取和富集
采用合适的方法，既要尽可能地完全抽提出 环境样品中的DNA，又要保持较大的片段以 获得完整的目的基因或基因簇。所以提取原 则是在最大提取量和最小剪切力之间折中 常用的提取方法有直接裂解法和间接提取法 (细胞提取法)
3.开拓天然产物新资源
2000年8月, Brady和 Clardy等人构建了一 个含有约7000000个5个, 并从 其中一个克隆发酵物 中分离出一系列具有 抗菌活性的长链N2酰 基酪氨酸类新化合物 1213
宏基因组的构建及应用ppt课件
ppt课件
18
PS：
通过DNA微阵列技术(基因芯片技术)寻找环境基 因组序列中的有用片段也是一种全新的筛选技 术，它可以快速有效的识别和描述许多菌落的 特征，并可应用于大量保守基因的分离。基于 序列的筛选策略可以利用基因芯片技术大大提 高筛选效率，有可能筛选到某一类结构或功能 的蛋白质中的新分子，但必须对相关基因序列 有一定的了解，较难发现全新的活性物质。
在水体中的应用： 海洋蕴涵着非常丰富的微生物资源，目前已应用宏基因组 技术研究了多种海洋次生代谢产物合成途径，其中最为经 典的是研究海洋聚酮类和非核糖体肽类的生物合成基因簇。
ppt课件 22
2 、在新型生物催化剂中的应用
新型催化剂主要是酶。传统的新型酶的筛选方法限 制了筛选的广泛性和有效性。宏基因组学则克服了 这一限制，有效地提高了新酶的筛选效率。 现已发现了抗生素及维生素生物合成相关基因簇的 克隆，以及水解酶类和氧化还原酶类编码的基因。 宏基因组技术通过对环境的直接克隆，为研究和利 用占微生物99％以上的非培养微生物提供了新的途 径，为微生物的研究和发展提供了全新的策略。
ppt课件 20
ppt课件
21
1 、在生态学方面的应用
宏基因组在生态学上的应用主要是土壤与水体。
目前其在土壤微生物研究中的应用主要包括两方面： 一、进行土壤微生物及其资源的挖掘。目前的研究工作已经 得到大批新基因，特别是在一些极端环境中的微生物宏基 因组的研究中得到了一些具有特殊应用价值的功能酶基因 二、揭示土壤微生物的多样性及其与环境之间的关系。
ppt课件
17
3 序列驱动的筛选
序列驱动的筛选(Sequence-driven screening)是根 据已知功能的基因序列设计探针或PCR引物， 通过核酸杂交或PCR扩增来筛选具有目标序列 的克隆子。 优点：不依赖克隆基因在宿主菌株中的表达。 缺点：必须对即未知基因)。
宏基因组 PPT课件
SIGEX screening
样品中DNA的提取和富集
采用合适的方法，既要尽可能地完全抽提出 环境样品中的DNA，又要保持较大的片段以 获得完整的目的基因或基因簇。所以提取原 则是在最大提取量和最小剪切力之间折中
常用的提取方法有直接裂解法和间接提取法 (细胞提取法)
直接裂解法
操作方法：将环境样品直接悬浮在裂解缓冲 液中处理，继而抽提纯化，包括物理法(如冻 融法、超声法、玻璃珠击打法、液氮研磨法 等)和化学法、酶法等
宏基因组（广义）
广义宏基因组是指特定环境下所有生物 遗传物质的总和，它决定了生物群体的 生命现象。它是以生态环境中全部DNA 作为研究对象，通过克隆、异源表达来 筛选有用基因及其产物，研究其功能和 彼此之间的关系和相互作用，并揭示其 规律的一门科学
宏基因组（狭义）
狭义宏基因组学则以生态环境中全部细 菌和真菌基因组DNA作为研究对象，它 不是采用传统的培养微生物的基因组， 包含了可培养和还不能培养的微生物的 基因，通过克隆、异源表达来筛选有用 基因及其产物，研究其功能和彼此之间 的关系和相互作用，并揭示其规律
宏基因组工程与海洋生物学进行有机的结合，促 使人类了解许多为培养海洋微生物的基因组序列 及其功能产物，在海洋天然药物研究、海洋极端 环境微生物研究、海洋微生物多样性探索中具有 十分重要的应用前景。
环境保护和污染修复
挖掘降解基因和功能菌株，进行生物修复 获取任何序列的基因或功能，由此合成新物质或发
环境基因组学
1991年首次提出环境基因组学(environmental genomics)的概念，同年构建了第学研究所启动了环境基 因组计划(environmental genome project，EGP)， 开展有关人体遗传变异与环境胁迫相互关系的研究
病毒宏基因组学.ppt
读书报告
2020/2/4
病毒宏基因组学概述及其应用
研究背景 宏基因组学简介 病毒宏基因组学 研究策略与技术路线 研究成果与前景展望
Here We Go！
一大难题
virus B
virus C
virus A virus D
BACTERIA
在人类生产生活中，致病的微生物众多，其中病毒性疾病占据大多
数，而现有的诊断方法不可能囊括所有的病毒。因此，从宏观上把
（coamid）载体]、表达载体(pBluescript SK+)、穿梭载
体(Cosmid pOS700Ⅰ)及普通克隆T载体。
2020/2/4
研② 高纯度大分子量基因组 DNA的提取。 ③ 高质量大相对分子质量 DNA 的部分酶切与脉冲电 泳分级分离。 ④ 载体与外源片段的连接 与转化或侵染宿主细胞。 ⑤ 重202组0/2/4克隆的挑取和保存。
研究策略与技术路线
样品的处理 遗传物质的分离与富集 构建 宏基因组学的筛选序列分析
2020/2/4
研究策略与技术路线
VIS:Very Important Step
稀释
解冻
样品的处理
消化
过滤
离心
2020/2/4
研究策略与技术路线
反转录 双链 cDNA 合
成
DNA RNA
PCR 扩增
PCR 产物 的纯化
遗传物质的 分离与富集
2020/组DNA或cDNA片段 与适当的载体在体外通 过重组后，转化至宿主 细胞，并通过一定的选 择机制筛选后得到大量 的阳性菌落(或噬菌体), 所有 发掘潜在 的新的病 毒性疾病
挖掘新 的活性 物质
病毒宏基因组学
最早应用宏基因组学理论分析病毒群落的科学家是Breitbart教 授，他于2002年应用鸟枪测序法（shotgun sequencing）首次对 美国加州海岸的2处海洋中病毒群体进行研究，发现374-7114个潜 在的新病毒。
2020/2/4
病毒宏基因组学概述及其应用
研究背景 宏基因组学简介 病毒宏基因组学 研究策略与技术路线 研究成果与前景展望
Here We Go！
一大难题
virus B
virus C
virus A virus D
BACTERIA
在人类生产生活中，致病的微生物众多，其中病毒性疾病占据大多
数，而现有的诊断方法不可能囊括所有的病毒。因此，从宏观上把
（coamid）载体]、表达载体(pBluescript SK+)、穿梭载
体(Cosmid pOS700Ⅰ)及普通克隆T载体。
2020/2/4
研② 高纯度大分子量基因组 DNA的提取。 ③ 高质量大相对分子质量 DNA 的部分酶切与脉冲电 泳分级分离。 ④ 载体与外源片段的连接 与转化或侵染宿主细胞。 ⑤ 重202组0/2/4克隆的挑取和保存。
研究策略与技术路线
样品的处理 遗传物质的分离与富集 构建 宏基因组学的筛选序列分析
2020/2/4
研究策略与技术路线
VIS:Very Important Step
稀释
解冻
样品的处理
消化
过滤
离心
2020/2/4
研究策略与技术路线
反转录 双链 cDNA 合
成
DNA RNA
PCR 扩增
PCR 产物 的纯化
遗传物质的 分离与富集
2020/组DNA或cDNA片段 与适当的载体在体外通 过重组后，转化至宿主 细胞，并通过一定的选 择机制筛选后得到大量 的阳性菌落(或噬菌体), 所有 发掘潜在 的新的病 毒性疾病
挖掘新 的活性 物质
病毒宏基因组学
最早应用宏基因组学理论分析病毒群落的科学家是Breitbart教 授，他于2002年应用鸟枪测序法（shotgun sequencing）首次对 美国加州海岸的2处海洋中病毒群体进行研究，发现374-7114个潜 在的新病毒。
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f=20kb/3×109
n=690773.2
E.coli 4639221bp p=99% f=20kb/4600kb n=1056.9
p=99% f=10kb/4600kb n=2116
的外源 DNA不是基因组DNA，而是由某一生物的 特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA 经反转录形成的cDNA，它们所构成的重ribosomal RNAs and the genes encoding them was introduced to describe uncultured bacteria in the environment.
°根据密码子的使用频率, 合成猜测体探针
° 设计两组简并探针, 用第二个探针对第一次筛 选的阳性克隆子作第二次杂交
• 综合合成
可能的话 设计一对, 用PCR产物作探针
精选课件ppt
14
三、免疫
在可获得PT后, 制备抗体, 用于筛选
四、高表达基因
高丰度mRNA, 如 用苯肼作了贫血处理的兔网织 红细胞中,血红蛋白mRNA的含量占绝大多数
8
见筛选工具: 探针
狭义: 核酸, 抗体 广义: 还包括其他筛选手段
精选课件ppt
9
一、功能筛选
利用目标基因的特定功能进行筛选
• 抗性基因: antibiotics抗性基因, 抗重金属活 性
• 分解基因: 苯环化合物, 分解酶
• 功能活性：杀虫675-6758
精选课件ppt1什么是？Library 基因（也称DNA）是指某一生物体全部或部分基因的集合，
就像一个没有目录的“基因图书馆” 基因的组成：外源DNA片段：研究对象基因组DNA或cDNA 载体：质粒载体（plasmid）、黏粒载体（cosmid）、人工染色体 （BAC、YAC）等 宿主：大肠杆菌（E.coli）、酵母（Saccharomyces cerevisiae）
精选课件teria in pure culture is typically the first step in investigating bacterial processes.
➢ standard culturing techniques account for 1% or less of the bacterial diversity in most environmental samples
➢ a suite of culture-independent techniques are
needed to complement efforts to culture the
thousands or millions of unknown species in the
精选课件ppt19什么是宏基因组？精选课件ppt15
五(1)、差别杂交
五(2)、扣除杂交 六、mRNA差别显示
Differential display PCR, DD PCR
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16
七、酵母双杂交系统
用于分离与某一已知蛋白发生相互作用的 蛋白质基因
GAL4蛋游激活区(UAS)可启动gal基因的转录
GAL4蛋白：可分为两个区域 DNA-BD: DNA结合域, N-末端 1-147aa AD: 转录激活域， C-末端 768-881aa
精选课件经纯化后部 分酶切，然后把这些DNA片段连接到载体 上胞获得的新功能进行筛选, 或用 相关已知序列设计探针或PCR引物寻找并 分离目的基因片段，加上表达调控元件后 使目的基因表达，从而获得产物。
• 功能缺失
在获得相应突变体的前提下 以此突变体作为宿主 在野生型的DNA导入后检测回复突变
如 营养缺陷型 相关的基因
二、核酸探针 • 同源DNA探针
高度保守的基因 rRNA基因 邻近种属的相应基因
相应基因
蛋白质N-末端aa序列
简并探针degeneracy 选取简并程度低的aa序列
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5
载体的选择：
可装载的外源DNA
Plasmid
λ Phage Cosmid BAC YAC
<10kb
0-23kb ~45kb ~ 100kb ~ 300kb-1.2Mb
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6
粘粒克隆所需的克隆子数是λ phage的一半， 如λ 需700000时，cosmid需350000个
如无特殊需要(如单个λ phage不能包容靶基因片段 或要分离一系列跨过染色体DNA特大区段的重叠克 隆时)一般不采用cosmid，因其在构建和贮存 比λ phage困难得多
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7
YAC可用于克隆500kb以上，甚至几Mb的DNA片段 BAC 可减少DNA分子间的重组
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10
Vector
Amp ori
MCS
Tet gene without promoter
将目标DAN切割成小片段, 插入MCS 在Tet 平板上筛选抗性菌落, 可得到promoter
其他标记: gfp, Kan
质粒复制单位的克隆
Amp ori
MCS
目标宿主可用的 抗性gene
将目标DAN切割成小片段, 插入MCS 在抗性平板上筛选抗性菌落, 可得到质粒复制单位
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2
1976年L.Clark,p)/基因组DNA大小的比值
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3
哺乳动物 3×109kb 若p=99% 平均克隆片段20kb
n=690773.2
E.coli 4639221bp p=99% f=20kb/4600kb n=1056.9
p=99% f=10kb/4600kb n=2116
的外源 DNA不是基因组DNA，而是由某一生物的 特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA 经反转录形成的cDNA，它们所构成的重ribosomal RNAs and the genes encoding them was introduced to describe uncultured bacteria in the environment.
°根据密码子的使用频率, 合成猜测体探针
° 设计两组简并探针, 用第二个探针对第一次筛 选的阳性克隆子作第二次杂交
• 综合合成
可能的话 设计一对, 用PCR产物作探针
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14
三、免疫
在可获得PT后, 制备抗体, 用于筛选
四、高表达基因
高丰度mRNA, 如 用苯肼作了贫血处理的兔网织 红细胞中,血红蛋白mRNA的含量占绝大多数
8
见筛选工具: 探针
狭义: 核酸, 抗体 广义: 还包括其他筛选手段
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9
一、功能筛选
利用目标基因的特定功能进行筛选
• 抗性基因: antibiotics抗性基因, 抗重金属活 性
• 分解基因: 苯环化合物, 分解酶
• 功能活性：杀虫675-6758
精选课件ppt1什么是？Library 基因（也称DNA）是指某一生物体全部或部分基因的集合，
就像一个没有目录的“基因图书馆” 基因的组成：外源DNA片段：研究对象基因组DNA或cDNA 载体：质粒载体（plasmid）、黏粒载体（cosmid）、人工染色体 （BAC、YAC）等 宿主：大肠杆菌（E.coli）、酵母（Saccharomyces cerevisiae）
精选课件teria in pure culture is typically the first step in investigating bacterial processes.
➢ standard culturing techniques account for 1% or less of the bacterial diversity in most environmental samples
➢ a suite of culture-independent techniques are
needed to complement efforts to culture the
thousands or millions of unknown species in the
精选课件ppt19什么是宏基因组？精选课件ppt15
五(1)、差别杂交
五(2)、扣除杂交 六、mRNA差别显示
Differential display PCR, DD PCR
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七、酵母双杂交系统
用于分离与某一已知蛋白发生相互作用的 蛋白质基因
GAL4蛋游激活区(UAS)可启动gal基因的转录
GAL4蛋白：可分为两个区域 DNA-BD: DNA结合域, N-末端 1-147aa AD: 转录激活域， C-末端 768-881aa
精选课件经纯化后部 分酶切，然后把这些DNA片段连接到载体 上胞获得的新功能进行筛选, 或用 相关已知序列设计探针或PCR引物寻找并 分离目的基因片段，加上表达调控元件后 使目的基因表达，从而获得产物。
• 功能缺失
在获得相应突变体的前提下 以此突变体作为宿主 在野生型的DNA导入后检测回复突变
如 营养缺陷型 相关的基因
二、核酸探针 • 同源DNA探针
高度保守的基因 rRNA基因 邻近种属的相应基因
相应基因
蛋白质N-末端aa序列
简并探针degeneracy 选取简并程度低的aa序列
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载体的选择：
可装载的外源DNA
Plasmid
λ Phage Cosmid BAC YAC
<10kb
0-23kb ~45kb ~ 100kb ~ 300kb-1.2Mb
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6
粘粒克隆所需的克隆子数是λ phage的一半， 如λ 需700000时，cosmid需350000个
如无特殊需要(如单个λ phage不能包容靶基因片段 或要分离一系列跨过染色体DNA特大区段的重叠克 隆时)一般不采用cosmid，因其在构建和贮存 比λ phage困难得多
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YAC可用于克隆500kb以上，甚至几Mb的DNA片段 BAC 可减少DNA分子间的重组
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Vector
Amp ori
MCS
Tet gene without promoter
将目标DAN切割成小片段, 插入MCS 在Tet 平板上筛选抗性菌落, 可得到promoter
其他标记: gfp, Kan
质粒复制单位的克隆
Amp ori
MCS
目标宿主可用的 抗性gene
将目标DAN切割成小片段, 插入MCS 在抗性平板上筛选抗性菌落, 可得到质粒复制单位
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1976年L.Clark,p)/基因组DNA大小的比值
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哺乳动物 3×109kb 若p=99% 平均克隆片段20kb