实验三死活细胞的鉴别

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酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴定_百替生物

实验七酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴定一、实验目的1.观察酵母菌的形态特征、出芽生殖方式，并掌握酵母菌与细菌形态特征的区别。

2.学习鉴别死活细胞的实验方法。

二、实验原理酵母菌是单细胞的真核微生物，菌体比细菌大而且不运动。

酵母菌的繁殖方式分为无性繁殖和有性繁殖两种，以无性繁殖为主。

芽殖是酵母菌普遍的无性繁殖方式，少数为裂殖；有性繁殖是产生子囊和子囊孢子。

本实验是通过美蓝染液水浸片和水一碘液水浸片来观察酵母的形态和芽殖方式。

美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。

用美蓝对酵母活细胞染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型，而对代谢作用微弱或死细胞，无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。

因此，不仅用此法可观察酵母细胞形态，也可用来鉴别酵母菌的死细胞和活细胞。

三、实验器材1.材料：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或卡尔酵母(Saccharomyces calsbergensis)培养2天左右的麦芽汁(或豆芽汁)液体培养物。

2.试剂：O.1％吕氏碱性美蓝染色液、革兰氏染色用的碘液。

3.器材：显微镜、载玻片、盖玻片、接种环、洒精灯等。

四、实验步骤1.美蓝浸片观察（1）在载玻片中央加一滴0.1%吕氏碱性美蓝染色液，然后按无菌操作接种环挑去少量酵母菌放在染液中，混合均匀，染液不宜过多。

注：染液不宜过多或过少，否则，在盖上盖玻片时，菌液会溢出或出现大量气泡。

（2）用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上。

注：盖玻片不宜平着放，以免产生气泡。

（3）将制片放置约3min后镜检，先用低倍镜然后用高倍镜观察酵母的形态和出芽情况，并根据颜色来区别死活细胞。

（4）染色约0.5h后再次观察，注意死细胞数量是否增加。

2.水-碘浸片观察在载玻片中央滴一滴碘液，然后在其上加3小滴水，取少许酵母菌苔放在水-碘液中混匀，盖上盖玻片后镜检。

死细胞鉴别实验报告

死细胞鉴别实验报告引言细胞是生物体的基本单位，而细胞的生死状态对于研究生物体的健康状态和反应至关重要。

因此，鉴别细胞是否存活或死亡是细胞生物学研究中的一个重要方面。

本实验旨在探究几种常用的细胞死亡检测方法，比较它们的原理、优缺点以及适用范围。

材料与方法材料- 死细胞（来源为培养基中存放久的细胞）- 活细胞（来源为新鲜培养的细胞）- Annexin V-FITC/PI 染色试剂盒- MTT（甲基硫代氮唑盐）试剂盒- PI（荧光素）染色试剂盒- 倒置显微镜- 96孔板方法1. Annexin V-FITC/PI 双染法- 取少量活细胞和死细胞，离心去除培养液。

- 用PBS洗涤2次。

- 加入适量Annexin V-FITC染色试剂和PI染色试剂，按试剂盒使用说明操作。

- 由于每种细胞线对于荧光素的增加有所不同，所以需要观察活细胞和死细胞的荧光信号。

- 在倒置显微镜下观察染色细胞。

活细胞通常会呈现绿色荧光，而死细胞则会呈现红色荧光，同时也能观察到双染的细胞。

2. MTT 法- 将活细胞和死细胞分别均匀悬浮在培养基中，制备concentration为1 \times 10^6/mL的细胞悬浮液。

- 取200μL的细胞悬浮液于96孔板孔中，每孔设置3个平行重复。

- 加入MTT试剂，按照试剂盒使用说明操作。

- 倒置显微镜下观察细胞的形态变化。

- 使用酸解液将MTT染色后的溶液吸出，避免细胞产生二次吸收。

- 使用微孔板阅读器检测各孔的吸光度。

3. PI 染色法- 准备好活细胞和死细胞的悬浮液。

- 取少量细胞悬浮液，在离心管中离心去除培养液。

- 滴加PBS重新悬浮细胞，使得细胞形态变得均匀。

- 加入适量的PI染色试剂，按照试剂盒使用说明操作。

- 通过倒置显微镜观察细胞的形态变化，并记录颜色和荧光信号。

实验结果与讨论Annexin V-FITC/PI 双染法结果在观察活细胞和死细胞样本时，我们发现活细胞产生了明亮的绿色荧光，而死细胞则产生了红色荧光。

备课素材：如何判断细胞的活性高中生物人教版必修1

如何判断细胞的活性细胞活性是判断体外培养细胞在某些条件下是否能正常生长的重要指标,检测方法如下：一、染色计数法1. 化学染色法染色计数法是细胞培养中检查细胞死活最常用的方法，直接利用死细胞和活细胞对染料的不同亲和力，检查细胞活性，能在光学显微镜下观察到染色结果。

可分为两类：死细胞着色法和活细胞着色法。

使死细胞着色的常用染料有台盼蓝、苯胺黑、伊红Y。

能使活细胞着色的常用染料有结晶紫、亚甲基蓝、甲苯胺蓝等。

其中最常用的是台盼蓝染色法。

细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA结合，使其着色，而活细胞能阻止染料进入细胞内，故可以鉴别死细胞与活细胞。

通过细胞计数可得出细胞的存活率。

本染色法方便实用，价格低廉，操作简单。

但是台盼蓝染色时，时间不宜过长，否则部分活细胞也会着色，会干扰计数。

而且，细胞没有经过固定，形态不清晰。

2. 荧光染色法一些荧光染料对死细胞和活细胞也有不同的作用效果，利用荧光显微镜检测细胞活性。

如碘化丙啶（PI），被活细胞排斥但能穿透正在死亡或已经死亡细胞的细胞膜，因此活细胞不被染料上色，只有死细胞或凋亡细胞才能被染上红色。

吖啶橙（AO）能透过质膜完整的细胞，嵌入细胞核DNA，使之发出明亮的绿色荧光。

溴乙锭（EB）仅能透过胞膜受损的细胞，嵌入核DNA，发橘红色荧光。

也可应用AO-EB双染法鉴定细胞死活。

这种检测方法相比传统的染料，具有灵敏度高，操作简便，结果容易分辨等特点，而且利用双染法还可以分辨活细胞、凋亡早期细胞、凋亡晚期细胞、死亡细胞。

在细胞凋亡的检测上有很广泛的应用。

缺点在于，要求特殊的仪器进行检测，如荧光显微镜、激光扫描共聚焦显微镜或流式细胞仪。

而且通过荧光染料具有毒性，操作时需要带手套。

二、克隆（集落）形成试验克隆形成试验是测定单个细胞增殖能力的有效方法之一，其基本原理是单个细胞在体外持续分裂增殖6次以上，其后代所组成的细胞群体，称为克隆或集落。

一般情况，每个克隆可含50个以上的细胞，大小在0.3~1.0mm3之间。

食品微生物实验技术--实验三观察酵母菌形态及放线菌的形态

三、器具材料
1. 器材：无菌平皿、接种环、接种铲、酒精灯、火柴、恒温培养箱，显微镜、载玻片、盖玻片、擦镜纸、手持放大镜。 2．培养基：灭菌麦芽汁琼脂培养基(三角瓶装)，无菌马铃薯蔗糖琼脂培养基、营养琼脂培养基。 3．试剂及染色液：美蓝染色液、石炭酸复红染色液、结晶紫染色液、蒸馏水。 4．菌种：啤酒酵母、“5406”链霉菌、各种细菌和酵母菌菌落。
2.酵母菌死活细胞鉴别及繁殖方式观察
在干净的载玻片中央滴加一滴吕氏美蓝染色液，按无菌操作要求，用接种环挑取少许酿酒酵母培养物于美蓝染色液中混匀，加盖一块洁净的盖玻片，注意不要产生气泡，在高倍镜下观察鉴别酵母细胞的死活情况及酵母出芽落
放线菌菌落
5.细菌的运动性观察
2．悬滴法在培养12~18h的试管斜面上滴加1~2mL无菌水，制成稍混浊的菌悬液，取1滴菌液于干净的盖玻片中央(不要把液滴涂开，要求保留园形突起的水珠)，另取凹玻片一块，在凹窝周围涂少量凡士林，现将带有菌液的盖玻片轻轻翻转，使液滴恰好悬于凹窝处上方且避免菌液触及凹窝的边和底，并用火柴棒轻略按盖玻片，使凡士林密封边缘，以减少菌液蒸发(图2-3)。标本制成后，先用低倍镜找到水滴，再换高倍镜或油镜观察。
四、操作步骤
1.酵母菌个体形态观察 (水浸片法)
在干净的载玻片中央滴加一滴蒸馏水，按无菌操作要求，用接种环在上述培养的平皿表面挑取少许被试酵母菌培养物于蒸馏水中混匀，使呈轻度混浊。加盖一块洁净盖玻片，注意切勿产生气泡，制成水浸片(用滤纸吸干多余水分)，稍静置后，放在显微镜高倍物镜下观察酵母菌的个体形状，大小及出芽情况等
五、作业与思考题
1.绘制你在显微镜中所观察到的酵母菌个体形态。 2.鞭毛染色为何首先要进行细菌运动性检查? 3.绘制“链霉菌”的个体形态图。 4.放线菌的菌丝有几种?各有什么作用?

细胞学实验三

将墨汁0.5-1ml注射入蟾蜍的被淋巴囊内。 2-3个小时后制作背淋巴囊内的淋巴液涂片，观察到白细胞吞噬进的黑色墨汁小颗粒。
内容（三）操作
1、显微测量
（蟾蜍红细胞，甲基绿-派洛咛染色）
步骤
1. 用台尺对目尺定标 2. 测量10个蟾蜍红细胞长径、短径，取平均值
目镜测微尺的实际长度
目镜测微尺的实际长度=镜台测微尺格数/目镜测微尺格数x10um
2、死活细胞鉴别（酵母细胞）
原理——染色排除法：
许多酸性染料不容易穿过活细胞的质膜进入细胞内，却能渗入死亡的细胞内，使其着色，以此来鉴别死活细胞。
二乙酸酯荧光素FDA染色
步骤
滴1滴酵母悬液于载玻片中央 ↓
滴1滴0.2%台盼兰染液 ↓
混合，染色2min ↓
盖盖玻片
↓ 显微镜下观察
结果：死细胞染成蓝色，活细胞不着色
细胞质的不断流动即为胞质环流。
通过胞质环流可借以实现胞内物质运转，有利于代谢活动的进行。
步骤：制作黑藻叶片观察标本
载玻片中央滴一滴水 ↓
取尖端叶片，铺平在水滴中 ↓
盖盖玻片 ↓
观察
镜下观察黑藻叶片：
绿色椭圆形的叶绿体会和其他小颗粒在细胞内向着示教
细胞存活率=（活细胞数/细胞总数）x100%
实验报告
1、测量5-10个蟾蜍红细胞的长径、短径大小，计算平均值；
（要求：计算公式，标定结果，测量结果）
2、计算酵母细胞存活率（5个视野）。
实验流程
1. 观察细胞的胞质环流黑藻叶片 2. 观察细胞的吞噬作用
小鼠巨噬细胞吞噬细菌蟾蜍白细胞吞噬墨汁 3. 显微测量目镜测微尺，镜台测微尺蟾蜍血涂片 4. 死活细胞鉴定，计算细胞存活率酵母细胞 5. 实验报告

微生物学实验教程

微生物学实验内容实验一 . 显微镜的使用及细菌的简单染色实验二 . 细菌的革兰氏染色实验三 . 酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别实验四 . 酵母菌的数量测定实验五 . 酵母菌的大小测定实验六 . 微生物菌落的观察实验实验七 . 霉菌的形态观察实验八 . 培养基的制备与灭菌实验九 . 放线菌的形态及菌落特征的观察实验十 . 微生物的纯种分离培养实验一 . 普通光学显微镜的使用一、目的要求1. 学习并掌握油镜的原理和使用方法。

2. 复习普通台式显微镜的结构、各部分的功能和使用方法。

二 . 显微镜的基本结构及油镜的工作原理现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜。

它们由机械装置和光学系统两大部分组成。

在显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。

而在普通光学显微镜通常配置的几种物镜中，油镜的放大倍数最大，对微生物学研究最为重要。

与其他物镜相比，油镜的使用比较特殊，需在载玻片与镜头之间加滴镜油，这主要有如下二方面的原因：1. 增加照明亮度油镜的放大倍数可达 100Χ，放大倍数这样大的镜头，焦距很短，直径很小，但所需要的光照强度却最大。

从承载标本的玻片透过来的光线，因介质密度不同（从玻片进入空气，再进入镜头），有些光线会因折射或全反射，不能进入镜头，致使在使用油镜时会因射入的光线较少，物像显现不清。

所以为了不使通过的光线有所损失，在使用油镜时须在油镜与玻片之间加入与玻璃的折射率（n=1.55）相仿的油镜（通常用香柏游，其折射率 n=1.52）。

2. 增加显微镜的分辨率显微镜的分辨率或分辨力 (resolution or resolving power) 是指显微镜能辨别两点之间的最小距离的能力。

从物理学角度看，光学显微镜的分辨率受光的干涉现象及所用物镜性能的限制，可表示为：（公式 P16 ）式中λ= 光波波长；NA=物镜的数值孔径值。

光学显微镜的光源不可能超出可见光的波长范围（ 0.4--0.7μm），而数值孔径值则取决于物镜的镜口角和玻片与镜头间介质的折射率，可表示为： NA=n × sin α式中α为光线最大入射角的半数。

实验三酵母菌、霉菌、放线菌的形态观察

实验三酵母菌、霉菌、放线菌的形态观察一目的要求1.观察酵母菌的个体形态及出芽生殖方式，学习区分酵母菌死活细胞的实验方法。

2.掌握酵母菌的菌落特征及其与细菌菌落的区别。

3．学会识别霉菌的菌落特征，掌握霉菌的乳酸石炭酸制片法。

4．学习观察霉菌个体形态及各种无性孢子的方法。

5．学会观察放线菌的菌落特征，个体形态及其繁殖方式。

二实验原理1．酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，多数是圆形或椭圆形，其大小通常比常见细菌大几倍甚至十几倍。

用美蓝对酵母菌的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型，因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的、而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色，借此即可对酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别。

2.霉菌形态比细菌、放线菌复杂，个体比较大，具有分支的菌丝体和分化的繁殖器官。

霉菌菌丝体(尤其是繁殖菌丝)及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。

因此，在观察时要注意菌丝直径大小，菌丝体有无隔膜，营养菌丝有无假根，无性繁殖形成的孢子是那一种？孢子是怎样着生的？3.放线菌是指能形成分枝丝状体或菌丝体的一类革兰氏阳性细菌。

常见放线菌大多能形成菌丝体，紧贴培养基表面或深入培养基内生长的叫基内菌丝，基内菌丝生长到一定阶段还能向空气中生长出气生菌丝，并进一步分化产生孢子丝及孢子。

孢子的表面光滑或粗糙、圆或椭圆，孢子有各种颜色，这些形态特点都是鉴定放线菌的重要依据。

三实验材料1．菌种（1）啤酒酵母、面包酵母、裂殖酵母、热带假丝酵母;（2）毛霉、黑根霉、青霉、黑曲霉;（3）白色链霉菌、红色链霉菌2. 0.1%的美蓝染色液，乳酸石炭酸溶液、乳酸石炭酸棉蓝溶液, 芽孢染色液、无菌水、盖玻片、载玻片，接种钩，接种铲。

四内容与步骤1．酵母菌(1)菌落特征和菌苔特征的观察。

观察菌落表面干燥或湿润、隆起形状、边缘整齐度、大小、颜色等，并用接种环挑菌，注意与培养基结合是否紧密。

酵母菌的形态观察与微生物大小的测定

酵母菌的形态观察, 死活细胞鉴别,微生物测量技术,显微镜直接计数法一、实验目的1．观察酵母菌的形态及出芽生殖方式，学习区分酵母菌死活细胞的实验方法；掌握酵母菌的一般形态特征及其与细菌的区别。

2．了解目镜测微尺和镜台测微尺的构造及使用原理，掌握测定微生物细胞大小的方法.3. 了解血球计数板的构造和使用方法,学会用血球计数板对酵母细胞进行计数。

二、实验原理染色：美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。

用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。

因此，具有还原能力的酵母细胞是无色的，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色。

测量：微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，由于菌体微小，只能在显微镜下测量。

用于测量微主物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。

目镜测微尺是一块圆形玻片，在玻片中央把5mm长度刻成50等分，或把10 mm长度刻成100等分。

测量时，将其放在接目镜中的隔板上(此处正好与物镜放大的中间物像重叠)用于测量经显微镜放大后的细胞物象。

由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺校正，以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。

计数：每一个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0．1mm，所以计数室的容积为0．1mm3。

在计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上16或25，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成1ml菌液中的总菌数。

下面以一个大方格有25个中方格的计数板为例进行计算：设五个中方格中总菌数为A，菌液稀释倍数为B，那么，一个大方格中的总菌数因1ml=1cm3=1000mm3，三、实验仪器1 菌种: 培养48h的酵母菌．２染色液和试剂：0.05%、0.1%吕氏碱性美蓝．3 器材：显微镜、血球计数板、目镜测微尺、镜台测微尺、盖玻片、吸水纸、计数器、移液器、擦镜纸。

实验三、霉菌的形态观察和酵母菌的形态观察及死活细胞鉴别

二、基本原理基本原理
1、酵母菌形态观察和死活细胞鉴别
酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比常见细菌大几倍甚至十几倍。大多数酵母以芽殖少数以裂殖见细菌大几倍甚至十几倍。大多数酵母以芽殖、少数以裂殖进芽殖、裂殖进行无性繁殖；有性繁殖则通过结合产生子囊孢子。子囊孢子。行无性繁殖；有性繁殖则通过结合产生子囊孢子美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型氧化型呈蓝色，无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。因此，具有还原能力的酵母活细胞型变为无色的还原型。因此，具有还原能力的酵母活细胞是无活细胞是色的，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则分别呈蓝色和淡死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则分别呈蓝色和或代谢作用微弱的衰老细胞则分别呈蓝色蓝色。蓝色。
四、操作步骤
在载玻片上滴加一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液子挑取少许菌丝，子挑取少许菌丝，浸于染液中散开盖上盖玻片用镊用解剖针将菌丝分用高倍
低倍镜观察
镜观察菌丝局部
操作要点：操作要点： • 挑菌和制片时要细心，尽可能保持霉菌自然生长状态。挑菌和制片时要细心，尽可能保持霉菌自然生长状态。 • 尽可能将菌丝分开，加盖玻片时勿压入气泡，以免影响观察。尽可能将菌丝分开，加盖玻片时勿压入气泡，以免影响观察。 • 挑取菌丝前镊子和解剖针要在酒精灯上灼烧灭菌。挑取菌丝前镊子和解剖针要在酒精灯上灼烧灭菌。
实验三酵母菌的形态观察及死、酵母菌的形态观察及死、活细胞的鉴别和霉菌的形态观察的鉴别和霉菌的形态观察

死活细胞的鉴别

（一）、死活细胞的鉴别生活细胞近似无色透明，用普通光镜无法观察其形态，需用相差显微镜来观察。

染色排除法：组织培养中检查死活细胞最常用的是“染色排除法”这类方法简单但不甚严格，它只能判断细胞的代谢死亡，不反映细胞能否增殖。

由于未经过固定、专门染色，所以看不到死活细胞的形态差别。

所用染料的分类：一般的生物染料不能穿过活细胞膜只有细胞被固定或细胞膜被破坏，染料才能进入细胞膜。

第一类：死细胞着色，使死细胞着色的大部分是酸性染料。

它们不容易穿透活细胞的质膜，进入胞内，但却能渗透死亡的细胞，使之着色。

如①台盼兰（Trypan blue）：0.5-1%的台盼兰，pH7.0-7.2，每毫升细胞悬液加0.1ml 染液，2 分钟后镜检，活细胞没有染上，死细胞全部被染成蓝色。

②苯胺兰(Aniline’ black)：0.05%的苯胺黑以1：10 的量与细胞悬液混匀，1-2 分钟后，死细胞被染成黑色。

③伊红Y：细胞悬液与细胞悬液混喝，2 分钟后死细胞被染成桃红色。

等。

第二类：活细胞着色，多为碱性染料，如中性红、健那绿、亚甲蓝、甲苯胺蓝等。

它们是一些无毒或毒性很小的染料，由于电性吸引而堆积在细胞中某一特定的结构上从而显色，即它们解离后带正电，其中有的染料可与胞内某些结构专一性的结合。

①1%结晶紫染色生理1%结晶紫盐水与细胞悬液1：2 混合，立即镜检，或细胞被染成蓝紫色，而死细胞不着色。

属于活细胞染料。

活细胞染料无毒，无物理、化学变化，基本上不影响细胞的生命活动。

②用呀啶橙染色可以鉴别出细胞固定前的死活状态。

丫啶橙是一种与DNA 和RNA 都能结合的荧光染料，在兰光或紫外光激发下，DNA 可激发出530nm 的荧光发射峰，RNA 可激发出640nm 的荧光发射峰，它与双链DNA 的结合方式是潜入双链之间，而与单链DNA 和RNA 则由静电吸引堆积在磷酸根上。

在蓝光的激发下，细胞核发亮绿色荧光，核仁和胞质RNA质发生变形，其核呈暗绿色，胞质整个呈暗绿色。

酵母菌形态观察及死活鉴别

酵母菌形态观察及死活鉴别
一、实验目的
1.认识并观察酵母菌的形态特征，并掌握酵母菌与细菌形态特征的区别。

2.学习鉴别死活细胞的实验方法。

二、实验原理
1、酵母菌是单细胞的真核微生物，菌体比细菌大而且不运动。

2、本实验是通过美蓝染液浸片和碘液浸片来观察酵母的形态
美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。

因此，不仅用此法可观察酵母细胞形态，也可用来鉴别酵母菌的死细胞和活细胞
三、实验器材
酵母悬液、美蓝染色液、革兰氏染色用的碘液、显微镜、载玻片、盖玻片
四、实训步骤
1、水-碘浸片观察
在载玻片中央滴一滴碘液，取一滴酵母悬液放在碘液中混匀，盖上盖玻片后镜检。

2、美蓝浸片观察
（1）在载玻片中央加一滴美蓝染色液，滴加一滴酵母菌放在染液中，混合均匀，染液不宜过多。

注：染液不宜过多或过少，否则，在盖上盖玻片时，菌液会溢出或出现大量气泡。

（2）将制片放置约3min 后镜检，先用低倍镜然后用高倍镜观察酵母的形态和出芽情况，并根据颜色来区别死活细胞。

五、实验报告
绘图说明你所观察到的酵母菌的形态特征
六、注意事项
1、染色液不宜过多或过少，否则在盖上盖玻片时，菌液会溢出或出现大量的气泡，影响观察。

2、盖片时斜着放不易产生气泡。

1。

细胞生物学实验本科生实验内容

细胞生物学实验（本科生）实验内容实验一细胞的结构目的：1、熟悉实验室规范2、掌握光镜下细胞器的形态、分布特点；3、掌握临时制片法；4、学会生物绘图内容：（一）录像：临时标本片的制作（二）光镜下细胞器形态学观察：1、高尔基体（兔神经节切片）2、细胞核及核仁（蝾螈表皮装片）3、线粒体（肾小管切片）4、细胞骨架（培养肝癌细胞飞片）5、中心体*（马蛔虫受精卵切片）（二）操作：制作人口腔上皮细胞临时制片（显示活体线粒体）（三）实验报告：绘制人口腔粘膜上皮细胞实验二细胞化学细胞工程目的：1、掌握甲基绿-派洛咛染色法原理及操作技巧2、了解几种化学成分的显示方法及原理；3、观察各种化学成分在细胞中的分布；4、了解PCC原理；5、了解细胞融合及其应用；内容：（一）录象：克隆羊（二）观察：1、糖原（动物肝切片，PAS反应）2、酸性蛋白（蟾蜍血涂片，酸性固绿染色）3、酸性磷酸酶*（鼠腹腔液涂片，金属沉淀法显色）4、DNA* （小鼠睾丸切片，Feulgen反应）5、DNA、RNA*（人口腔粘膜上皮细胞涂片，吖啶橙染色，荧光显微镜观察）6、细胞融合（鸡血细胞、培养细胞）7、PCC*（Hela细胞）（三）操作：制作蟾蜍血涂片，显示DNA、RNA（四）实验报告：甲基绿-派洛咛染色原理、步骤及结果实验三显微测量细胞的生理活动目的：1、掌握显微测量技术；2、观察细胞的生理活动；3、掌握死活细胞的鉴别方法及原理；内容：(一)录象：细胞的活动显微测量（二）观察：1、胞质环流（黑藻叶片）2、吞噬作用*（小鼠白细胞）3、吞噬作用（蟾蜍白细胞）（三）操作：1、显微测量（蟾蜍红细胞）2、死活细胞鉴别（酵母细胞）（四）实验报告：1、测量5-10个细胞的大小，计算平均值；2、计算细胞存活率。

实验四细胞增殖染色体（质）目的：1、熟悉细胞增殖的主要方式；2、掌握细胞增殖周期各期的形态学特点；3、熟悉人染色体的基本形态特征；4、掌握X染色质标本的制备方法及原理；内容：（一）观察：1、动物细胞有丝分裂（马蛔虫受精卵切片）2、植物细胞有丝分裂（洋葱根尖纵切片）3、收缩环*（肝癌细胞飞片）4、无丝分裂*（草履虫装片）5、人染色体的基本形态（人血涂片）（二）操作：1、制作有丝分裂压片（洋葱根尖）2、制作X染色质标本片（人口腔粘膜上皮细胞）（三）实验报告：绘有丝分裂图、X染色质图。

死活细胞鉴别实验报告

一、实验目的1. 掌握细胞培养的无菌操作技术。

2. 学习并掌握动物细胞原代培养和传代培养的实验方法。

3. 了解细胞生死状态鉴别的原理和方法。

4. 熟悉和掌握各种鉴别细胞生死状态方法的判定特征。

二、实验原理细胞培养是指在无菌条件下，将动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。

细胞生死状态的鉴别方法主要包括化学染色法和荧光染色法。

活细胞和死亡细胞在生理功能和性质上存在以下差异：1. 细胞膜通透性差异：活细胞的细胞膜具有选择性通透性，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性地通过；而细胞死后，细胞膜受损，通透性增加。

2. 代谢差异：活细胞具有正常的代谢活动，而死亡细胞代谢活动停止。

基于以上差异，我们可以通过以下方法鉴别死活细胞：1. 台盼蓝染色法：活细胞不会被台盼蓝染成蓝色，而死细胞会被染成淡蓝色。

2. 伊红染色法：活细胞不着色，而死细胞会被染成红色。

3. 荧光染色法：活细胞不发光，而死细胞会发出荧光。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：动物细胞培养液、培养皿、移液枪、吸管、显微镜、台盼蓝染液、伊红染液、荧光染液等。

2. 实验仪器：超净工作台、离心机、细胞培养箱、显微镜等。

四、实验步骤1. 取动物细胞培养液，加入适量的台盼蓝染液，混匀后静置5分钟。

2. 用吸管吸取染色的细胞悬液，滴加在载玻片上，盖上盖玻片。

3. 将载玻片置于显微镜下观察，活细胞不着色，而死细胞被染成蓝色。

4. 取动物细胞培养液，加入适量的伊红染液，混匀后静置5分钟。

5. 用吸管吸取染色的细胞悬液，滴加在载玻片上，盖上盖玻片。

6. 将载玻片置于显微镜下观察，活细胞不着色，而死细胞被染成红色。

7. 取动物细胞培养液，加入适量的荧光染液，混匀后静置5分钟。

8. 用吸管吸取染色的细胞悬液，滴加在载玻片上，盖上盖玻片。

9. 将载玻片置于荧光显微镜下观察，活细胞不发光，而死细胞发出荧光。

酵母形态观察

三、实验材料
1.菌种： Saccharomyces cerevisiae 酿酒酵母 1.菌种：菌种 2.染色液：0.1%吕氏碱性美蓝 2.染色液：0.1%吕氏碱性美蓝染色液 3.器材：载玻片，显微镜、盖玻片、吸水 3.器材：载玻片，显微镜、器材滴管、擦镜纸。纸、滴管、擦镜纸。
四、内容及方法
五、实验结果
1.酵母个体形态，芽体（绘图） 1.酵母个体形态，芽体（绘图）酵母个体形态 2.计算死活细胞的比率，说明吕氏碱性美蓝 2.计算死活细胞的比率，说明吕氏碱性美蓝计算死活细胞的比率染液浓度和作用时间对死活细胞数的影响
酵母个体形态
六、思考题
1.在显微镜下， 1.在显微镜下，酵母菌有哪些突出的特征区别在显微镜下于一般的细菌？于一般的细菌？ 2.用美蓝染色法对酵母细胞进行死活鉴别时为 2.用美蓝染色法对酵母细胞进行死活鉴别时为什么要控制染液的浓度和染色时间？什么要控制染液的浓度和染色时间？
酵母菌死活细胞的鉴别酵母菌死活细胞的鉴别用美兰液浸片法进行酿酒酵母死活细胞鉴别用美兰液浸片法进行酿酒酵母死活细胞鉴别1在载玻片上各滴加一滴染色液和酵母菌培养液盖上盖玻片勿使产生气泡且不要再移动盖玻片2将制好的水浸片放置3分钟后镜检
实验五
酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别
一、目的要求
1.学习自制水浸片法观察酵母菌 1.学习自制水浸片法观察酵母菌 2.观察酵母菌形态和出芽生殖方 2.观察酵母菌形态和出芽生殖方式 3.学习并掌握区分酵母菌死活细胞的染色方法 3.学习并掌握区分酵母菌死活细胞的染色方法
二、实验原理
1.酵母菌是不运动的单细胞真核微生物， 1.酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比酵母菌是不运动的单细胞真核微生物常见的细菌大几倍甚至几十倍，因此，不必染色即可用常见的细菌大几倍甚至几十倍，因此，显微镜观察其形态。显微镜观察其形态。大多数酵母以出芽方式进行无性繁有的二分裂殖；子囊菌纲中的酵母菌在一定条件下，殖，有的二分裂殖；子囊菌纲中的酵母菌在一定条件下，可产生子囊孢子的方式进行有性生殖。可产生子囊孢子的方式进行有性生殖。酵母菌假菌丝的生成与培养基的种类、培养条件等因素有关。生成与培养基的种类、培养条件等因素有关。 2.美蓝是一种弱氧化剂氧化态呈蓝色，还原态呈无色。美蓝是一种弱氧化剂， 2.美蓝是一种弱氧化剂，氧化态呈蓝色，还原态呈无色。用美蓝对酵母细胞进行染色时，用美蓝对酵母细胞进行染色时，活细胞由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能将美蓝由兰色的氧化态转变为无色的还原态型，从而细胞呈无色；色的氧化态转变为无色的还原态型，从而细胞呈无色；而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则由于细胞内还原力较弱而不具备这种能力，从而细胞呈蓝色，力较弱而不具备这种能力，从而细胞呈蓝色，据此可对酵母菌的细胞死活进行鉴别。酵母菌的细胞死活进行鉴别。

酵母菌的形态观察实验报告

一、实验目的1. 观察酵母菌的细胞形态及出芽生殖方式。

2. 学习掌握区分酵母菌死、活细胞的染色方法。

二、实验原理酵母菌是一种单细胞真菌，其细胞结构包括细胞壁、细胞膜、细胞质、细胞核等。

酵母菌主要通过出芽生殖进行繁殖，即在母细胞的一端形成芽体，芽体逐渐长大并与母细胞分离，形成新的个体。

美蓝是一种无毒性的染料，其氧化型呈蓝色，还原型无色。

活细胞具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型，因此，活细胞无色，而死细胞或代谢缓慢的老细胞则呈蓝色或淡蓝色。

三、实验器材1. 酿酒酵母或卡尔酵母（Saccharomyces calsbergensis）2. 0.1%吕氏碱性美蓝染液3. 革兰氏染色用的碘液4. 显微镜5. 载玻片6. 盖玻片7. 接种针8. 烧杯9. 火柴四、实验步骤1. 准备酵母菌培养物：取少量酿酒酵母，接种于土豆平板培养基上，28-30℃培养3-5天。

2. 制备美蓝浸片：a. 在载玻片中央滴一滴0.1%吕氏碱性美蓝染液。

b. 用接种针挑取少量酵母菌，均匀涂布在染液上。

c. 盖上盖玻片，轻压使酵母菌与染液充分接触。

3. 制备水浸片：a. 在载玻片中央滴一滴无菌水。

b. 用接种针挑取少量酵母菌，均匀涂布在水中。

c. 盖上盖玻片，轻压使酵母菌与水充分接触。

4. 显微镜观察：a. 将美蓝浸片和水浸片置于显微镜下观察。

b. 观察酵母菌的细胞形态、大小、细胞核、芽体等特征。

c. 比较美蓝浸片和水浸片中酵母菌的形态差异。

5. 死活细胞鉴别：a. 观察美蓝浸片中酵母菌的染色情况。

b. 活细胞呈无色，死细胞或代谢缓慢的老细胞呈蓝色或淡蓝色。

五、实验结果1. 酵母菌细胞形态：a. 酵母菌细胞呈椭圆形、圆形或卵圆形，大小不一。

b. 细胞核位于细胞中央，呈圆形或椭圆形，核膜清晰。

c. 细胞质均匀，无色或淡蓝色。

2. 出芽生殖方式：a. 观察到酵母菌细胞一端形成芽体，芽体逐渐长大。

b. 芽体与母细胞分离，形成新的个体。

死活染色实验报告

一、实验目的1. 了解死活细胞在生理技能和性质上的差异。

2. 掌握细胞生死状态的鉴别方法，包括化学染色法和荧光染色法。

3. 学习使用台盼蓝、伊红、苯胺黑、赤藓红、甲基蓝、碘化丙啶或溴化乙啶等染料鉴别细胞生死状态。

4. 学习使用植物质壁分离的性质鉴定植物细胞的生死状态。

5. 学习使用荧光素二乙酸酯、荧光素二丙酸酯、荧光素二丁酸酯或荧光素二苯甲酰酯等酯化的荧光素鉴别细胞生死状态。

二、实验原理细胞生死状态的鉴别主要基于细胞膜通透性、代谢等方面的差异。

活细胞的细胞膜具有选择性透过性，对物质进行选择性吸收；而死亡细胞的细胞膜通透性增加，物质可以自由通过。

此外，活细胞内的酶具有较强的活性和还原能力，而死亡细胞的酶活性降低。

三、实验材料与仪器1. 材料：- 活细胞：人口腔上皮细胞、酵母细胞、植物细胞等。

- 死细胞：经固定、处理后的细胞。

2. 试剂：- 台盼蓝、伊红、苯胺黑、赤藓红、甲基蓝、碘化丙啶或溴化乙啶等染料。

- 荧光素二乙酸酯、荧光素二丙酸酯、荧光素二丁酸酯或荧光素二苯甲酰酯等酯化的荧光素。

- 植物质壁分离剂。

- 美蓝染料。

3. 仪器：- 显微镜。

- 吸水纸。

- 恒温水浴锅。

- 离心机。

四、实验方法1. 死活细胞染色法：（1）取适量活细胞和死细胞，分别加入适量的染料，混匀。

（2）将混合液放入恒温水浴锅中，恒温染色10-15分钟。

（3）用吸水纸吸去多余染液，观察细胞染色情况。

2. 植物质壁分离法：（1）取植物细胞，用植物质壁分离剂处理。

（2）观察细胞质壁分离情况，判断细胞生死状态。

3. 美蓝染色法：（1）取适量酵母细胞，加入适量的美蓝染液。

（2）混匀，恒温染色10-15分钟。

（3）用吸水纸吸去多余染液，观察细胞染色情况。

五、实验结果与分析1. 死活细胞染色法：（1）台盼蓝染色：活细胞不被染色，死细胞被染色。

（2）伊红染色：活细胞不被染色，死细胞被染色。

（3）苯胺黑染色：活细胞不被染色，死细胞被染色。

（4）赤藓红染色：活细胞不被染色，死细胞被染色。

酵母菌死活细胞鉴别

四、操作步骤
1、滴加一滴0.1%吕氏碱性美蓝热染液于载玻片中央，无滴加一滴0.1%吕氏碱性美蓝热染液于载玻片中央吕氏碱性美蓝热染液于载玻片中央，菌操作用接种环由酵母菌培养斜面上挑取少许菌体置于染液混合均匀；（不要过于剧烈，以免破坏细胞）；（不要过于剧烈中，混合均匀；（不要过于剧烈，以免破坏细胞） 2、用镊子取一块盖玻片，将盖玻片一边与菌液接触，缓慢用镊子取一块盖玻片，将盖玻片一边与菌液接触，将盖玻片倾斜并覆盖在菌液上；（不要产生气泡）；（不要产生气泡将盖玻片倾斜并覆盖在菌液上；（不要产生气泡） 3、将制片放置3min后，用低倍镜及高倍镜观察酵母菌形将制片放置3min后态和出芽情况，并根据细胞颜色区分死活细胞；态和出芽情况，并根据细胞颜色区分死活细胞； 4、染色30min后再次观察，注意死活细胞比例是否发生变染色30min后再次观察后再次观察，化； 5、用0.05%吕氏碱性美蓝染液作为对照同时进行上述实验。 0.05%吕氏碱性美蓝染液作为对照同时进行上述实验吕氏碱性美蓝染液作为对照同时进行上述实验。建议做，用等量生理盐水稀释染液即可）（建议做，用等量生理盐水稀释染液即可）
酵母出芽
三、器材
1、菌种：酵母菌2d的培养斜面或平皿；的培养斜面或平皿；菌种：酵母菌2d的培养斜面或平皿 2、溶液和试剂：吕氏碱性美蓝染液；溶液和试剂：吕氏碱性美蓝染液； 3、仪器和其他用品：酒精灯，载玻片，盖玻片，仪器和其他用品：酒精灯，载玻片，盖玻片，显微镜，接种环，滴管等。显微镜，接种环，滴管等。
酵母菌细胞的形态观察、酵母菌细胞的形态观察、死活细胞的鉴别
一、目的和要求
1、观察酵母菌细胞的形态结构；观察酵母菌细胞的形态结构； 2、掌握鉴别酵母菌细胞死活的染色原理和方法；方法；

培养细胞之死活细胞的鉴别实验报告

4.4.3 根据染色结果计算活细胞率：依据死细胞染成蓝色、活细胞不着色的原则计数死细胞数和细胞总数，以如下公式计算细胞存活率：
细胞存活率=（细胞总数-死亡细胞数）/细胞总数 *100%
4.5 关于血球计数板
4.5.1 血球计数板是一块特制的厚载玻片，载玻片上有四条槽而构成三个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分割成两半，每个半边上面各有有一个方格网，每个方格网共分九大格，其中间的一大格（又称计数室）常被用作细胞的计数。
由于体外培养细胞自身没有抵抗污染的能力，而且培养基中的抗生素抗污染能力有限，因而培养细胞一旦发生污染多数将无法挽回。支原体污染后，因为它们不会使细胞死亡可以与细胞长期共存，培养基一般不发生浑浊，细胞无明显变化，外观上给人以正常感觉，实则细胞手到多方面潜在影响，如引起细胞变形，影响DNA合成，抑制细胞生长等。
课后作业
1.抑制肿瘤细胞增殖药物的筛选方法
1.1 MTT分析法
以活细胞代谢物还原剂3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide,MTT噻唑蓝为基础。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比(死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原)。还原生成的formazan结晶可在含50%的N，N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠(pH 4.7)的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。也可以用DMSO来溶解。
支原体污染的来源包括工作环境的污染、操作者本身的污染（某些支原体在人体是正常菌群）、培养基的污染、被污染细胞造成的交叉污染、实验器材的污染、制备细胞的原始组织或器官的污染，等等。