新生大鼠心肌细胞培养技术
新生大鼠心肌细胞的培养和分离
1. 材料和方法
• 1.1心肌细胞的消化 • 取一只加盖烧杯，内放一块用乙醚饱和的纱布， 把 0~3 日龄的大鼠幼鼠放进该烧杯中麻醉，用 2 % 碘酒和 75 % 酒精消毒胸腹皮肤，在无菌条件 下开胸取出心脏，立即置于 4º C D-Hanks 液 (mmol/L：Nacl 137, Kcl 5.4, Na2HPO4 0.37, K2HPO4 0.44, NaHCO3 4.2)中剪取心室肌，洗净 残血，剪成约1mm³ 大小的组织块，弃去D-Hanks 液加入0.08% 胰蛋白酶液10~15ml，于37°C静 置5min，吸出上层悬液，并加入等量的含血清 培养基。经终止消化后离心 ( 1800 r/min) 弃上 清液，加入含血清的培养液。吹散沉淀细胞， 同条件下离心，用 10 % 血清培养液制成细胞悬 液，置于37°C含5%CO2培养箱中。
3.实验讨论
• 有很多文献报道新生大鼠心肌细胞的培养 时间为10~12天,本次实验的培养时间为3天, 与之比较成活时间较短,但本实验可以说明 低浓度胰蛋白酶消化液(0.08%)比一般浓度 (0.125%) 的消化时间效果好 , 消化时间在 3~5 分钟内可减少细胞死亡率 . 实验过程中 出现的细胞向一处聚集的现象和可见的连 续的形态变化,可以说明体外培养心肌细胞 重新连接成更大单位细胞团是可能的,它们 可能通过形态的变化相互钩连,连接成网.
1.3心肌细胞的无血清培养
• 当心肌细胞培养24小时后换无血清培养液 （含DMEM培养液，胰岛素10g/ml, 铁蛋 白 1 0 g/ml， 维 生 素 C100g/L 维 生 素 B121.5µ mol/L）继续培养 48 小时 , 每隔 8 小 时换液一次,尽量保持各添加成分浓度不变, 最后收集细胞,进行测定。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞是一种重要的细胞类型，对于心脏生理学和病理学研究具有重要意义。
在研究心脏疾病发生发展机制、药物筛选及分子生物学研究中，大鼠心肌细胞的分离、鉴定和培养是必不可少的步骤。
本文将介绍大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养的方法。
一、大鼠心肌细胞的分离1. 材料准备（1）动物：健康的大鼠（2）工具：手术刀、剪刀、镊子、针头、离心管、培养皿等（3）试剂：PBS、Hanks液、COLLAGENASE、TRYPSIN、DNA酶I2. 心肌细胞的分离（1）准备心肌组织：选取健康的大鼠，进行心肌组织的分离。
将动物取出心脏，迅速放入含有PBS的离心管中，冷藏备用。
（2）组织的机械分离：将心脏取出后进行机械分离，去掉多余的结缔组织等。
（3）酶消化：将组织加入COLLAGENASE、TRYPSIN等酶进行消化，使细胞释放。
（4）滤网过筛：将酶消化后的组织经过滤网过筛，得到心肌细胞的悬液。
（5）细胞纯化：使用密度梯度离心法或其他方法对心肌细胞悬液进行纯化，得到较纯的心肌细胞。
二、大鼠心肌细胞的鉴定1. 形态学鉴定（1）显微镜观察：将得到的心肌细胞悬液放入培养皿中，通过显微镜观察心肌细胞的形态。
（2）心肌细胞的特征：心肌细胞具有两个或多个横纹和中央的单核的细胞核，且具有特殊的形状和排列方式。
2. 免疫细胞化学鉴定（1）选取适当的心肌细胞标记物：如肌球蛋白、酸性肌球蛋白等（2）进行免疫细胞化学染色：使用特异性抗体对心肌细胞进行染色，观察标记物的表达情况。
（3）通过显微镜观察：观察心肌细胞的染色情况，以确定其特异性。
三、大鼠心肌细胞的培养1. 培养基的配制（1）培养基配方：DMEM/F12培养基+10%胎牛血清+1%青霉素/链霉素+适量营养因子（2）pH值调节：将配制好的培养基进行pH值调节至7.42. 大鼠心肌细胞的培养（1）培养皿涂层：将培养皿内涂覆明胶或胶原等基质蛋白，有利于细胞的附着生长。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞是一种重要的研究对象，分离、鉴定和培养大鼠心肌细胞是进行相关研究的基础工作。
本文将介绍大鼠心肌细胞的分离、鉴定和培养方法。
1. 大鼠心肌细胞的分离方法：a. 准备消化液：将含有0.1%胰酶和0.05%胰蛋白酶的耗氧培养液(如DMEM/F12)预先加热至37℃。
b. 杀死大鼠：快速杀死大鼠，并立即进行心肌细胞的分离。
c. 开胸取心：通过剖开胸腔，将心脏暴露，并迅速取出。
d. 剪开心脏：用剪刀切开心脏的心室部分，将其放入预先加热的消化液中。
e. 贴壁处理：将心室组织液搅拌均匀，并放置在37℃培养箱中酶解。
每隔10分钟，用吸球轻轻吸取上清液，反复操作3-4次。
2. 大鼠心肌细胞的鉴定方法：a. 形态学观察：用显微镜观察分离得到的心肌细胞的形态，心肌细胞呈长条状，具有明显的纵纹和横纹。
b. 钙离子荧光染色：使用荧光染料如Fluo-4 AM来标记细胞内的钙离子，并观察细胞内钙离子的动态变化。
c. 免疫荧光染色：使用心肌细胞特异性标记物如肌球蛋白进行免疫荧光染色，观察标记物的染色情况。
3. 大鼠心肌细胞的培养方法：a. 培养基准备：将DMEM/F12培养液加入10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素溶液和1%胎牛血清补充物。
b. 细胞接种：将分离得到的心肌细胞加入培养基中，浓度为1 * 10^5 cells/ml，并将细胞悬浮液加入培养皿中。
c. 培养条件：将培养皿放入恒温培养箱中，温度设定为37℃，CO2浓度设定为5%。
d. 培养液更换：一般情况下，每2-3天更换一次培养基，同时可添加适量的生长因子和激素。
e. 心肌细胞传代：当心肌细胞达到80-90%的密度时，可以进行细胞传代。
传代方法与培养方法相似，注意细胞的保持适当的密度。
大鼠心肌细胞的分离、鉴定和培养是大鼠心肌细胞研究的关键步骤。
通过合适的操作和条件，可以获得纯度较高的心肌细胞，并进行相关研究。
需要注意的是，心肌细胞的分离和培养过程需要在无菌条件下进行，以避免细菌和其他微生物的污染。
新生大鼠心肌细胞培养技术
【 ｅ Ｏｄ】 Ｃ ｌ ｕｕｅ ｅ ｎ ｕｓ Ｍｙｃ ｄ ｌ Ｒ ｔ Ｋｙ ｌ Ｗ Ｓ ｅ ｔ ｈｉ ｅ； ｌｌ ｒ ｔ ｑ ｃ ｃ ｏ ｒｉ； ａ ａ ａ ｓ
原 代培 养心 肌 细胞作 为 一种 主要 的研 究模 型 ， 被广泛 地 应 用 于心 血 管 疾 病 的研 究 中。我 们 经 过 长期 摸索 总结 出一 套 简便 、 有效 的大 鼠心肌 细胞 的
【 要】 目的 探讨新生大鼠心肌细胞的分离、 摘 培养方法。方法 取 １ 龄新生大 鼠的心室肌细胞 ， ～３ ｄ
用胶原酶 １分离心肌 细胞 ， 离心收集心肌细胞 ， 差速贴 壁法 纯化后 培养于 ＤＭＥ 培养基 。显微镜 下鉴定 心肌细 Ｍ
胞的纯度和形态结构 ， 锥虫蓝染色检查心肌细胞成 活率 。结果 出现 同簇 细胞 的同步跳动 。结论
【ｂｔ ｃ】 Ｏ ｊ ｔｅ ｏ ｎ ｓ ａ ｐｒｔａｄｃｌｒ ｍ ｏａ ｉ ｌｏ ｎ ｎｔｒｓ Ｍｅ ｏｓ Ａ ｓａｔ ｂ ｃｖ Ｔ ｄ ｎｅ ｙｗ ｙ ｏ ｅａ ｅ ｎ ｔ ｅ ｙ ｒ ａｃ ｓ ｆ ｅ ａ ｔ ｒ ｅｉ ｉ ｆ ａ ａ ｔ ｓ ａ ｕ ｕ ｃ ｄ ｄ ｏ ｅ ａ ． ｔ ｄ ｌ ｈ
取一窝 １ ～３ｄ龄新 生大 鼠， 不用 麻醉和处 死 ， 用手 固
定住 四肢 ，５ ７ ％的酒精消毒皮肤 ， 无菌 眼科剪 在剑 突上一肋 处 人剪 （ 注意避免剪破消化 道预 防污 染） 。开 口 ０ ５ｃ ， ． ｒ 心 ｎ 脏 自然 跳 出 ， 心 尖 部 组 织 剪 下 迅 速 置 于 预 冷 的 不 含 将
ｗｅｅ ｕ ｉ ｙ ｃ ｒｎ ｕｌ ． ｏ ｃｕ ｉ Ｔ ｉ ｉ ａ ｆ ｔ ｅｗ ｙ ｔ ｕ ｙｍｙ ｃｒ ｉ ｅ ｓ ｒ ｊｍｐｎ ｓｎ ｈｏ ｏ ｓ Ｃ ｎ ｌ ｏ ｇ ｙ ｓｎ ｈｓ ｓｎ ｅｆ ｉ ａ ｓ ｄ ｏａｄａ ｃｌ ． ｃ ｅ ｖ ｏ ｔ ｌ ｌ
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养心肌细胞是构成心脏组织的重要细胞之一，对于心脏疾病的研究和治疗具有重要意义。
在进行心脏细胞的研究和培养过程中，对大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养是非常关键的步骤。
本文将介绍大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养的方法和步骤，希望能够帮助读者更好地理解和掌握这一关键技术。
一、大鼠心肌细胞的分离大鼠心肌细胞的分离是进行心肌细胞培养的第一步，其关键在于有效地分离心肌细胞，保证细胞的纯度和活力。
以下是常用的大鼠心肌细胞分离的方法：1. 心脏采集：首先需要从大鼠体内取出心脏组织，最好选择小鼠、大鼠等小型动物，以便于获取足够数量和较为纯净的心肌细胞。
2. 心室组织的分离：将心脏组织置于含有氧气的离心纯化液中，迅速剪下心脏，并去除心包膜、心尖等结缔组织，然后将心室组织切成小段。
3. 细胞的分离和纯化：将切成小段的心室组织放入含有0.1%胰蛋白酶和0.1%重组胰岛素的胰酶溶液中进行消化，去除结缔组织和细胞外基质，然后用离心分离出心肌细胞。
4. 心肌细胞的过筛和纯化：经过离心后，得到的上清液中含有大量的心肌细胞和其他细胞。
通过过筛的方法，可以进一步提取纯净的心肌细胞，并将其进行鉴定和培养。
1. 形态鉴定：观察分离得到的心肌细胞在显微镜下的形态特征，包括细胞形状、大小、结构等。
正常的心肌细胞应该呈长条形、有交叉条纹，并具有丰富的胞浆。
2. 免疫细胞化学鉴定：通过染色技术，使用与心肌细胞特异蛋白相关的抗体标记心肌细胞，如肌动蛋白、肌钙蛋白等，观察其在心肌细胞中的表达情况，以确定其纯度和特异性。
3. 功能鉴定：通过检测心肌细胞的功能特性，如心肌收缩力、电生理特性等，来判断心肌细胞的活性和健康程度。
可以通过贴壁法、钙离子荧光示踪等技术手段来进行功能鉴定。
通过以上的鉴定方法，可以全面地评估分离得到的心肌细胞的纯度和活性，为后续的心肌细胞培养和实验奠定基础。
在分离和鉴定得到的心肌细胞可以进行培养，为心脏疾病的研究和治疗提供重要的实验材料。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞是心肌细胞的主要来源之一，在心脏疾病的研究中具有非常重要的作用。
为了开展相关研究，需要对大鼠心肌细胞进行分离鉴定以及培养，以下是一份详细的操作
步骤。
1. 器材准备
（1）无菌试剂：试剂瓶/管、离心管、移液器、细胞培养基等。
（2）消毒器材：无菌吸管、离心机、高压灭菌器、悬浮液制备仪等。
（3）实验器材：显微镜、培养箱、细胞计数板、细胞离心机等。
2. 心肌细胞的分离
（1）准备新鲜的大鼠心脏组织。
（2）将心脏组织放入离心管中，加入PBS洗涤1-2次。
（3）将心脏组织切成小块，加入预先调配好的组织消化液（如DMEM/F12加入胰蛋白酶），37℃放入恒温水浴中消化2-3次。
（4）将消化的样本离心，去除上清液，加入预备的培养基，悬浮细胞。
（5）进行筛选，并将心肌细胞分离，最终得到心肌细胞。
（1）将分离好的心肌细胞放置在显微镜下观察其形态。
（2）进行免疫荧光染色，使用特定的心肌细胞抗体进行染色，观察细胞核及膜表达，判断其是否为心肌细胞。
（1）将鉴定好的心肌细胞放入预备好的细胞培养基中。
（2）放置于37℃恒温培养箱中，维持培养基液位。
（3）每2-3天更换一次新的培养基。
以上就是大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养的操作步骤，具体操作时应注意操作规范
和实验安全，保证实验结果的准确性和可靠性。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养是生物医学研究中常见的实验步骤。
下面将介绍大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养的方法步骤。
一、大鼠心肌细胞的分离1. 准备工具和试剂- 离心管、培养皿、组织研磨器、离心机、反应管等；- 消化酶（如胰蛋白酶、胰酶、胶原酶）、细胞分离缓冲液（如Hank's液、DMEM/F12液）- 磷酸盐缓冲液、磷酸缓冲液、PBS缓冲液等。
2. 动物安乐死和心脏取出- 通过适当的麻醉方法将大鼠处死；- 固定大鼠，将心脏迅速取出。
3. 大鼠心脏组织的处理- 将心脏放入含有预冷的磷酸盐缓冲液的离心管中；- 用螺旋式切割器将心脏切碎并加入含有消化酶的组织研磨器中；- 用搅拌器均匀搅拌、体外消化。
4. 细胞的分离和纯化- 将组织胶块转移到筛网上，用PBS缓冲液冲洗细胞；- 收集细胞上清液，离心沉淀；- 用细胞分离缓冲液重新悬浮沉淀细胞。
二、大鼠心肌细胞的鉴定1. 大鼠心肌细胞鉴定试剂- 法斯琪染色试剂；- cTnI、cTnT等心肌特异标志物抗体；- 免疫荧光显微镜。
2. 法斯琪染色鉴定- 采用法斯琪染色方案对心肌细胞进行染色；- 使用显微镜观察是否出现蓝色染色反应，标志细胞为心肌细胞。
3. 免疫荧光鉴定- 使用抗体与心肌特异标志物结合；- 使用免疫荧光显微镜观察细胞是否出现荧光信号。
三、大鼠心肌细胞的培养1. 大鼠心肌细胞的培养基- 常用的培养基有DMEM/F12液、Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）等。
2. 细胞培养条件- 培养基中添加适当的血清（如胎儿牛血清）和抗生素；- 培养箱中保持37℃、5% CO2含量。
3. 大鼠心肌细胞培养步骤- 将分离得到的心肌细胞加入培养基中；- 在培养箱中培养细胞，定期更换培养基；- 进行细胞观察和实验。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞是一种可供研究心脏疾病和相关生理学过程的重要模型细胞。
分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞对于心脏病研究具有重要意义。
本文将详细介绍大鼠心肌细胞的分离鉴定方法以及培养步骤。
1. 动物准备根据实验需要选择2-3个月大的健康雄性大鼠。
提前饲养大鼠，使其适应实验环境，避免压力引起心肌细胞损伤。
实验前一天，禁食12小时但允许饮水。
2. 心肌细胞分离将大鼠按麻醉操作，使用90mg/kg的琥珀胆碱或90mg/kg的乙酯进行麻醉。
确认大鼠麻醉后，通过软组织剪刀取出心脏，将其置于冷却的Buffer A中。
(Buffer A: 含有137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 0.5 mM MgCl2, 0.44 mM KH2PO4, 4.19 mM NaHCO3, 5.5 mM glucose, 10 mM HEPES的PBS液)将心脏移至工作台上，用毛刷清洁心脏表面的血液和附着物。
然后将心脏转移至10cm 培养皿内，将血管外壁剪除。
将心房和心尖切掉，将心脏切割成小块，并转移到15 mL离心管中。
加入5 mL Buffer A，并使用移液器缓慢混合。
使用1000 rpm进行梯度离心 (5 min)。
根据实验需要，可以选择制备低密度（20%离心液缓冲液）或高密度（50%离心液缓冲液）梯度离心。
将上清液去除，将沉淀与Buffer A混合。
将混合液过滤，去除残留的大块异物。
可使用0.22 μm的滤膜将上清液过滤。
收集上清液至50 mL离心管中，离心10 min(1000 rpm)。
去除上清液，保留沉淀。
再次挤压沉淀，使其成为小碎片。
将沉淀与37°C的Buffer B液混合。
(Buffer B: 含有137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 0.5 mM MgCl2, 0.9 mM CaCl2, 0.44 mM KH2PO4, 4.19 mM NaHCO3, 5.5 mM glucose, 10 mM HEPES, 10 mM taurine, 10 mM BDM的PBS液)以500 rpm离心5 min，去掉上清液，保留沉淀。
大鼠原代心肌培养
新生大鼠原代心肌培养需高压消毒：工具盒：小转子；300目滤网×2；眼科剪（直剪×1，弯剪×2）；枪头盒（1mL、200μL、20μL）。
需提前配制并4⁰C预冷：D-Hank’s稀释的0.1%胰酶；加双抗的PBS。
1．麻醉与消毒：麻醉1-3天新生大鼠并用75%酒精浸泡消毒。
2．解剖：剪开胸腔，立即取出跳动的心脏并放入冰冷的PBS（加双抗）中，切取心室并转移到另一新鲜冰冷PBS中，初步洗去心室内的血液后将心室剪成1-3mm3的碎块，短暂离心几次，以去除红细胞。
注：所有操作在冰上进行。
注意防止污染。
红细胞会影响心肌细胞的贴壁。
3．预处理（20min）：将切碎的组织转移至0.1%胰酶溶液（0.5ml/1心脏）的40ml 培养瓶中（含转子，），置于冰上20min，每3min摇动一次。
注：这一步中使胰酶充分浸润组织块，以利于后续消化。
4．胰酶消化（15min）：将培养瓶置于37⁰C水浴15min，150-200rpm搅拌。
注：胰酶应为D-Hank’s配置，与PBS配置的相比，更利于心肌细胞的存活和贴壁。
5．吸取上清：将上步中的培养瓶斜放静置后，小心吸取上层的细胞悬液，移至50ml离心管（预先加入5-10ml含10%FBS的DMEM培养基）中，终止胰酶作用。
收集的细胞悬液置于4⁰C冰箱。
注：尽量吸取上清，不要吸到下层粘稠的DNA或者组织块。
6．重复消化：向培养瓶中补充胰酶，重复步骤4、5，直至组织块基本消化干净。
7．收集细胞：将所有上述收集的细胞悬液1000 rpm 5min收集细胞，将细胞种植于100mm培养皿中进行预贴壁培养。
8．细胞纯化（1.5-2h）：将步骤7中所得细胞培养1.5-2h以使非心肌细胞贴壁，然后将剩余细胞悬液以5×105个/ ml的密度种植于6孔板或100mm培养皿中，加BrdU至终浓度为0.1mmol/L，培养48小时以防止非心肌细胞增殖。
48小时后，更换不添加BrdU的DMEM培养基进行培养。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞是研究心脏疾病和心肌细胞功能的重要模型细胞。
分离、鉴定和培养大鼠心肌细胞是心血管研究的基础工作之一，本文将介绍关于大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养的方法。
一、大鼠心肌细胞的分离1. 材料准备（1）取得3-5天大的小鼠；（2）取得适合的心肌分离培养试剂盒，如Worthington试剂盒；（3）取得离心机和培养箱等实验设备。
2. 心肌细胞的分离（1）将小鼠处死，取出心脏放置在含有生理盐水的培养皿中；（2）迅速将心脏移至足够的胶原酶/胶原酶B混合液中，加入2-3ml的混合液，用剪刀将心脏切成小块；（3）将含有心肌切块的培养皿放入37度水浴箱中37±1度水浴中消化，酶解30-50min，要不断观察；（4）将消化液收集至15ml离心管内，并逐渐加入适量的生理盐水；（5）将含有细胞的离心管放入离心机，1500rpm离心去沉淀心肌细胞；（6）吸去上清液，加入足够的DMEM/F-12培养基，轻轻振动混匀；二、大鼠心肌细胞的鉴定1. 细胞形态鉴定（1）将培养皿内心肌细胞移至显微镜下观察细胞形态；（2）通过显微镜观察细胞的形态、大小、颜色等；（3）正常大鼠心肌细胞呈长条形，且贴附于培养皿底部。
2. 免疫荧光染色鉴定（1）将培养皿内的细胞进行PBS溶液洗涤；（2）加入4% paraformaldehyde固定细胞，洗涤；（3）加入常用的抗心肌肌动蛋白抗体，孵育；（4）洗涤后加入FITC标记的二抗或荧光素进行荧光染色；（5）用荧光显微镜观察细胞的荧光情况，确定心肌细胞的特异性。
三、大鼠心肌细胞的培养1. 培养基的配制（1）将DMEM/F-12培养基加入10%的胎牛血清、1%的青霉素和链霉素，混匀；（2）将培养基过滤灭菌后，置于4度冰箱储存备用。
2. 心肌细胞的培养（1）将心肌细胞悬液加入到预先涂覆明胶的培养皿中；（2）将培养皿放入CO2培养箱中37度培养，第二天更换新的培养基；（3）每2-3天更换一次培养基，直至细胞形成充分的单层。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养心肌细胞是构成心脏的主要细胞类型，其功能是维持心脏的收缩和舒张运动。
由于心肌细胞自身的特殊性质，其在病理学和药理学研究中具有重要的作用。
因此，对大鼠心肌细胞的分离鉴定和培养具有重要的研究价值。
1. 材料与方法将健康的雄性SD大鼠用5%碘酒消毒，取出心脏并用PBS清洗，然后将其切成5mm×5mm的小块。
接着，将心肌块用0.25%胰酶和0.1%胆酸溶液（pH 7.4）在37℃水浴中消化30 min，然后加入完整培养基中停止消化。
用100μm的过滤网过滤后放在离心管中，500g离心5 min，取出混悬液上清液（含心肌细胞）。
将上清液平行于低浓度FBS培养基缓慢滴加到细胞培养瓶中，放置于37℃恒温培养箱中培养。
将细胞瓶中的细胞制备成单层细胞，加入适量的鼠抗α肌动蛋白单克隆抗体进行免疫染色。
观察细胞的形态和免疫染色结果，确定大鼠心肌细胞的纯度。
同时，采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blotting等方法来检测心肌特异性基因和蛋白的表达水平。
1.3 第1代大鼠心肌细胞的培养将细胞瓶中的心肌细胞培养至80%的密度后，用0.25%胰酶溶液（pH 7.4）将细胞处理成单细胞，然后加入适量的完整培养基中，调整至适当的离心管中，进行离心操作。
沉淀细胞，再用适量的完整培养基悬浮细胞，取适量的细胞悬浮液加入到新的细胞培养瓶中，以此种方式连续传代，获得第1代大鼠心肌细胞的纯培养状态。
2. 结果通过以上方法，从大鼠心脏中成功分离出心肌细胞，得到了悬浮液。
悬浮液中的心肌细胞大小大约为10-15μm，可用影像学方法进行精细观察，获得细胞数量约为3×10^6个/ml。
通过α肌动蛋白的免疫染色和心肌特异性基因和蛋白的表达水平的检测，我们成功地鉴定出了大鼠心肌细胞的纯度，并且进一步证明了其心肌细胞的特异性。
通过培养，我们成功地获得了第1代大鼠心肌细胞的纯态，细胞生长状况良好，细胞数量增加较为显著。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养心肌细胞是构成心脏肌肉的主要细胞类型，具有重要的生理功能。
研究大鼠心肌细胞具有重要的意义，可以探究心血管疾病的发生和发展机制，以及开发相关的药物治疗。
大鼠心肌细胞的分离可通过以下步骤进行：1. 预处理：取出大鼠心脏，迅速放置在冷却的维生素-free Hanks盐溶液中。
然后，用冷却过的Hanks盐溶液洗涤心脏，去除血液和杂质。
2. 细胞分离酶处理：将心脏切成小块，并放入含有0.1%胰蛋白酶和0.1%胆汁酸的预温化酶解缓冲液中。
在37℃的恒温摇床上进行酶解处理。
3. 细胞分离：酶解后的心脏组织经过轻微的摇晃，并用玻璃棒将组织块轻轻破碎。
将破碎的组织悬浮液通过细胞筛过滤器，并用高离心力离心收集上清液。
4. 细胞沉降：将上清液经过离心，去除上清液，留下细胞沉淀。
再次加入含有0.1%胰蛋白酶的预温化酶解缓冲液，并摇动细胞沉淀，使细胞悬浮。
5. 细胞富集：采用密度梯度离心法，将细胞悬液慢慢加入含有离心液的离心管中进行离心。
心肌细胞将沉积在密度梯度的底部。
6. 细胞培养：将心肌细胞的上清液去除，留下沉积的心肌细胞，加入预先准备好的心肌培养基中。
将细胞培养于37℃恒温孵化箱中，并提供适当的营养物质。
1. 形态学鉴定：使用显微镜观察细胞的形态结构。
正常的心肌细胞呈长条状，具有交叉纹理的横纹。
如果细胞形态发生变化，如变形、伸长或成球状，则可能表示细胞出现异常。
2. 免疫细胞化学鉴定：使用免疫荧光染色或免疫组化染色的方法，检测心肌细胞特异性标记物，如肌球蛋白（myosin）等。
正常的心肌细胞应表达这些标记物。
3. 功能鉴定：利用心肌细胞的特殊功能特点，如收缩、钙离子跨膜转运等，进行鉴定。
可通过记录细胞的膜电位变化、细胞的跳动频率等指标来评估细胞功能。
心肌细胞的培养需要特别注意以下事项：1. 培养基的选择：根据不同研究需求选择适当的培养基，如DMEM、Dulbecco改良的培养基等。
培养基应添加适量的血清、营养物质和生长因子，以提供细胞所需的营养和生长环境。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞的分离鉴定和培养是一项重要的实验技术，可以用于研究心肌细胞的生理和病理过程。
下面将介绍大鼠心肌细胞的分离鉴定和培养的步骤和注意事项。
一、心肌细胞的分离鉴定：1. 材料准备：- 大鼠心脏- 胰蛋白酶- 培养基（如DMEM/F12）- FBS（胎牛血清）- 抗生素（如青霉素/链霉素）- 生长因子（如胰岛素、培养基因素等）2. 心肌细胞的分离：- 用冰盐水冲洗大鼠心脏，将心脏置于0.1%胰蛋白酶溶液中，37℃恒温水浴放置15-20分钟。
- 取出心脏，去除杂质，用小孔濾网过滤，收集滤液。
- 加入预先冷却的培养基，离心分离细胞。
- 以适当的浓度重新悬浮心肌细胞。
3. 心肌细胞的鉴定：- 用显微镜观察细胞形态，心肌细胞的特点是形状呈纺锤形，具有交叉纹理。
- 心肌细胞可以用荧光染色的方法标记心肌肌纤维，如使用α-肌动蛋白标记。
- 用特异性抗体进行免疫染色，如心肌细胞特异性标志物肌球蛋白T (cTnT)。
2. 培养心肌细胞：- 将分离得到的心肌细胞在含10% FBS培养基的培养皿中培养。
- 培养皿放置于37℃恒温培养箱中，维持5% CO2的湿润环境。
- 每2-3天更换一次培养基，并观察细胞生长情况。
3. 细胞的凋亡和增殖：- 可以通过荧光染色，如使用Dapi染色观察细胞核形态来检测细胞凋亡。
- 可以使用CCK-8法或MTT法来测定细胞增殖情况。
4. 细胞的存活和形态观察：- 可以使用乙酰胆碱酯酶染色来观察细胞存活情况。
- 使用显微镜观察细胞形态的变化和生长状态。
总结：大鼠心肌细胞的分离鉴定和培养是一项重要的实验技术，在心脏病等相关研究中有着广泛的应用。
通过使用适当的培养基和条件，合理观察和分析细胞的形态和生理活性指标，可以用于研究心肌细胞的生理功能和分子机制，为心脏疾病的治疗提供基础和参考。
新生鼠心肌细胞培养过程技巧方法
一、材料与设备(一) 实验动物出生后 1-4 天 SD 乳鼠 15 只。
(二) 实验试剂低糖 DMEM、胰酶(含 EDTA)、青链霉素、碳酸氢钠液、新生牛血清、谷氨酰胺、D-Hank's 液。
0.1%新洁尔灭、碘酒、75%酒精。
培养液：培养液(DMEM，新生牛血清，青链霉素)。
(三) 器械与仪器铝盒、眼科直剪、眼科弯剪、眼科直镊、眼科弯剪、玻璃培养皿(共 2 套，一套用于解剖取材，另一套用于剪碎心脏组织)、100 ml 广口瓶两个(分别装碘酒和酒精棉球)、500 ml 烧杯、250 ml 锥形瓶、15 ml和 50 ml 的离心管，磁力搅拌器和搅拌子(或者水浴振荡器)、150-200 目尼龙筛网和针式滤器。
二、实验流程(一) 实验步骤1. 将胰酶用 D-Hank's 液配成 0.06%的浓度，并放置于37℃水浴中温育好。
2. 解剖取材：将乳鼠放入 0.1%新洁尔灭浸泡一下后拿出，用另一把大镊子取碘酒棉球擦皮肤，再用酒精棉球脱碘。
左手捏紧乳鼠颈背部皮肤以充分展露胸部，右手取一把眼科直剪剪开皮，充分撕拉开，再用酒精棉球消毒后，取一把眼科弯剪沿胸骨柄左下缘向上剪开肋骨，然后在切口中间横剪胸骨。
这样只要左手稍顶，乳鼠的心脏就直接跳出来。
然后用眼科弯镊从心脏中部直接将心室部分剪下，放入冰浴的 D-Hank's 液中。
重复以上过程。
取材完毕后，撤掉取材的手术器械。
注：为了保证心肌细胞的活力，取心的操作过程尽量快，另外，最好把盛的心脏的培养皿放置在冰台上或者预冷的平衡盐液中。
3. 用第二套手术器械进行下列操作。
用眼科直镊和眼科弯剪把培养皿中的心脏周边的血凝块及纤维组织剔除掉，放在另一个预先装好D-Hank's液的培养皿中，把心脏组织再洗一遍后，将心脏组织放在另外一个培养皿中(或者其它合适容器中，视个人习惯)，加少许 0.06%胰酶，用眼科弯剪将心脏组织剪成 1mm3大小的碎块，将剪碎的心脏和胰酶液转入加了搅拌子的锥形瓶中，另外吸取 2-3 ml 新鲜的胰酶冲洗平皿和剪刀并转入锥形瓶中，补加胰酶至终体积10 ml，加上塞子，放在37℃水浴中(可以用一个消毒的500 ml烧杯，装好无菌的蒸馏水，加够水量，水位线稍低于250 ml锥形瓶的刻度线即可，过少则温度会不均匀，过高容易污染。
新生大鼠心肌细胞培养技巧
新生大鼠心肌细胞培养技巧原代培养心肌细胞作为一种主要的研究模型，被广泛应用于心血管研究之中.我们实验室经过长期尝试，摸索出了一些行之有效的方法，并积累了一些经验，现总结如下：1新生大鼠鼠龄的选择新生大鼠心肌细胞在出生后3 d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力.因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长.大量观测表明，选择1~3 d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养较为理想.其中尤以半日龄大鼠心肌细胞培养效果最佳.2消化酶的选择及使用新生大鼠心肌细胞的分离可采用组织块法和消化法，前者因不易获得密度均一的细胞且难控制成纤维细胞的生长而较少采用.消化法中常使用的酶有3种：胰蛋白酶、胶原酶I或Ⅱ以及透明质酸酶.透明质酸酶多与胰蛋白酶或胶原酶联合应用.胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏.胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小，且在新生大鼠心肌组织，以胶原I为主,故我们选用胶原酶I.文献报道胶原酶的工作浓度一般在0.6~1 g・L1,我们使用的为0.8 g・L1.胶原酶最好现用现配.3消化程度的把握新生大鼠心肌细胞对酶消化极为敏感.消化过度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力；消化不足，细胞聚集成团，无法分清细胞边界，难以形态学观测.消化过程中使用磁力搅拌器时应注意:(1)转速一般控制在60~80 r・min1左右.(2)每次消化的时间须结合消化酶浓度确定.(3)将粘附在搅拌子上的心肌组织吹散，使酶液充分接触组织.(4)适宜温度为35~37℃.(5)当组织由红转白呈半透明状态时，应停止消化.4接种的细胞密度心肌细胞接种密度不仅影响细胞间的相互接触，进而影响细胞对肥大刺激的反应，而且影响长期培养细胞的成活率.接种细胞的绝对数量应经精确计算.一般而言，应根据实验的观测目的决定单位面积上的细胞数量.例如，如作形态学观测,六孔板中每孔的接种细胞数量应控制在1×105~2×105个；若需收获心肌细胞作mRNA或蛋白表达水平的观测，则每孔的接种密度可增加到5×105~6×105个.5细胞的分散度与接种的均匀性分离出的心肌细胞，在溶液中Ca2+作用下较容易出现集聚现象.因此，在进行差速贴壁前后，均应反复多次地轻柔吹打使心肌细胞成单个分散状态.接种后，应小心使心肌细胞均匀地分布于培养板上,避免细胞向培养孔的中央集聚.此外，可将培养板放入孵箱后用滴管轻轻吹打各孔中央部位2~3次，但应格外注意避免污染.6对成纤维细胞的抑制与血清种类的选择成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁且具有分裂增殖能力，经差速贴壁后仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中，若处理不当，很容易生长成优势细胞.溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长.但是，如果使用胎牛血清培养细胞，由于胎牛血清所含的促细胞有丝分裂的因子较多，BrdU 很难完全抑制成纤维细胞的生长.改用小牛血清则可克服这种现象的出现，获得高达90％以上的心肌细胞.7换液时间进行心肌细胞形态学观测时，接种密度较低，贴壁的心肌细胞数量减少，为避免成活心肌细胞随换液而被丢弃，应在接种48 h后换液.这样不仅使贴壁的心肌细胞数量明显增加，而且BrdU作用时间较长，对成纤维细胞的抑制作用更确实.此外，去血清后可用ITS和0.1 g ・L1BSA对心肌细胞进行营养支持，对心肌细胞贴壁率与凋亡率均不产生明显影响.8抗污染措施除应注意无菌操作等常规技术方法外，还应特别注意以下几点：(1)获取心脏时避免剪破消化道.比较稳妥的办法是在剑突上一肋处入剪，这样做不涉及腹腔，也就减少了污染机会.(2)如条件允许，应避免乳鼠心肌细胞与其他细胞在同一孵箱内共同培养，以防止发生交叉污染.(3)对于培养心肌细胞的观察、照相每次时间不可过长，否则既会导致培养液pH改变，又能增加污染机率.9培养液pH值适宜的pH范围在7.2~7.4之间，配制及使用培养液时应注意：(1) pH值会在过滤后上升0.1~0.3.(2)培养液中加入血清后pH值会有降低，降低程度与血清品质和含量有关.(3)应及时换液.(4)配制好的培养液不宜长时间贮存在4℃.这是因为培养液中的CO2会溢出，使培养液pH上升.每次配好的培养液尽量在2 wk内用完，否则应部分置于－20℃保存，使用前应补充谷氨酰胺和NaHCO3，再次过滤后方可使用.1，取心脏：起初取心脏的听说可以“剪开胸骨，就可以挤出来”但是找不到合适的剪开点。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞是心脏组织中最主要的细胞类型，其具有重要的研究价值和应用前景。
本文将介绍大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养的方法和技巧，以供需要的研究者参考。
一、大鼠心肌细胞的分离1. 质子化心肌细胞将雄性大鼠（体重200-250g）置于无菌条件下，去毛、消毒，然后迅速取出心脏，置于含有生理盐水的培养皿中。
使用显微镊子和显微刀将心脏分割成小块，使得心肌组织充分暴露。
将小块心肌组织转移至含有0.05%的胰酶和0.1%的胰蛋白酶的新鲜培养液中，温育30分钟至1小时。
温育完成后，用含有10%胎牛血清的DMEM培养基冲洗心肌组织，过滤去除残留的纤维和细胞碎片。
对心肌组织进行胶原酶-胰蛋白酶消化，离心沉淀后获取心肌细胞。
2. 分离和纯化获得的心肌细胞需要经过一定的分离和纯化步骤，以消除其他非心肌细胞的干扰。
常用的分离方法包括稳定梯度离心法、摇床培养法和免疫分选法。
通过适当的分离方法，可以获得较为纯净的大鼠心肌细胞用于后续研究。
1. 形态学鉴定通过显微镜观察大鼠心肌细胞的形态结构，包括细胞形状、大小、核与细胞浆的比例等，进行初步的鉴定。
正常的心肌细胞呈长条状，具有跨膜结构，胞质内含有丰富的线粒体和肌纤维等特征。
2. 免疫细胞化学鉴定通过特异性抗体对心肌细胞进行染色和标记，观察其对特定标记蛋白的表达情况。
常用的标记蛋白包括肌动蛋白、肌球蛋白、心肌肌球蛋白等。
通过免疫细胞化学鉴定，可以明确心肌细胞的特异性。
1. 培养基的选择大鼠心肌细胞的培养通常选用DMEM（Dulbecco's modified eagle's medium）培养基，添加10%的胎牛血清和适量的抗生素。
培养基的pH值应调整在7.2-7.4之间，以及含有必要的营养物质和生长因子。
2. 细胞密度和培养条件将鉴定过的心肌细胞悬浮于培养基中，调整成合适的细胞密度后，接种于预先涂覆明胶质或明胶胱聚糖混合物的培养皿中。
新生Wistar大鼠心肌细胞的分离培养与鉴定
细胞特异性 蛋白（ Ｔ Ｔ 抗 体和 仪肌动蛋 白（ ａｔ ） 克隆抗体 分别对 培养 的心肌细胞 进行免 疫荧光及 免疫 ｃｎ ） —ｃ ｎ 单 ｉ 组织化学鉴定 ， 结果均呈 阳性 。 关键词 大鼠 ， 新生 心肌 细胞 分离培养
随着 心血 管疾 病 在基 础医 学及 临床 医学 研究
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１ ０ ｒｍｉ离 心 １ ｍ ｎ ０／ ｎ ０ ０ ｉ。细 胞 沉 淀用 含 ２ ％ Ｆ Ｓ ０ Ｂ 的 Ｄ Ｍ Ｆ ２培养 液悬 浮 、 ＭＥ ／ １ 吹散 ， 细胞 计 数 ， 调整 密 度至 １ ｍ 。将 细胞 接种 于 预先 涂 布有 １ 个／ ｌ Ｘ０ Ｉ 鼠尾 胶原 蛋 白 的 １ 细胞 培 养 板 内 ， 型 ２孔 同时 每
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新 生 Ｗｉａ 大 鼠心 肌 细胞 的分 离 培 养 与鉴 定 ｓｒ ｔ
陈 克研 王 洋
摘要
王承利
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本实验取新生 ２ ｈ内的 Ｗｉａ 大 鼠心肌组织 ， ４ ｓｒ ｔ 无菌剪碎 后采用胰 酶消化 法分离 细胞 ， 用含 ２ ％胎 ０
培养 组织 来 源 的种属 ， 离培 养其 原代 心肌 细胞 ， 分
为预 防及 治疗 心血 管疾 病 药物 的研 发 等提供 良好
的实 验体 系 。 １ 材料 与 方法
１ １材 料 ．
孔加 １ ￣ ｏ／ 的 阿 糖 胞 苷 ２ ， ３℃ 、 ％ ０ ｍ ｌＬ ０ ｌ置 ７ ５ Ｃ ：培 养 箱 内 培 养 。２ ｈ后 用 含 １％ Ｆ Ｓ的 Ｏ ４ ０ Ｂ
新生大鼠心肌细胞原代培养实验具体步骤及方法
新生大鼠心肌细胞原代培养实验具体步骤及方法将大鼠的心肌细胞从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA）处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。
一、实验材料准备1. 动物出生后1-4 天SD 乳鼠15 只。
2. 试剂低糖DMEM、胰酶(含EDTA)、青链霉素、碳酸氢钠液、新生牛血清、谷氨酰胺、D-Hank's 液。
0.1%新洁尔灭、碘酒、75%酒精，培养液(DMEM，新生牛血清，青链霉素)。
3. 手术器械和仪器铝盒、眼科直剪、眼科弯剪、眼科直镊、眼科弯剪、玻璃培养皿(共2 套，一套用于解剖取材，另一套用于剪碎心脏组织)、100 ml 广口瓶两个(分别装碘酒和酒精棉球)、500 ml 烧杯、250 ml 锥形瓶、15 ml和50 ml 的离心管，磁力搅拌器和搅拌子(或者水浴振荡器)、150-200 目尼龙筛网和针式滤器。
二、方法1. 将胰酶用D-Hank's 液配成0.06%的浓度，并放置于37℃水浴中温育好。
2. 解剖取材：将乳鼠放入0.1%新洁尔灭浸泡一下后拿出，用另一把大镊子取碘酒棉球擦皮肤，再用酒精棉球脱碘。
左手捏紧乳鼠颈背部皮肤以充分展露胸部，右手取一把眼科直剪剪开皮，充分撕拉开，再用酒精棉球消毒后，取一把眼科弯剪沿胸骨柄左下缘向上剪开肋骨，然后在切口中间横剪胸骨。
这样只要左手稍顶，乳鼠的心脏就直接跳出来。
然后用眼科弯镊从心脏中部直接将心室部分剪下，放入冰浴的D-Hank's 液中。
重复以上过程。
取材完毕后，撤掉取材的手术器械。
注：为了保证心肌细胞的活力，取心的操作过程尽量快，另外，最好把盛的心脏的培养皿放置在冰台上或者预冷的平衡盐液中。
3. 用第二套手术器械进行下列操作。
用眼科直镊和眼科弯剪把培养皿中的心脏周边的血凝块及纤维组织剔除掉，放在另一个预先装好D-Hank's液的培养皿中，把心脏组织再洗一遍后，将心脏组织放在另外一个培养皿中(或者其它合适容器中，视个人习惯)，加少许0.06%胰酶，用眼科弯剪将心脏组织剪成1mm3大小的碎块，将剪碎的心脏和胰酶液转入加了搅拌子的锥形瓶中，另外吸取2-3 ml新鲜的胰酶冲洗平皿和剪刀并转入锥形瓶中，补加胰酶至终体积10 ml，加上塞子，放在37℃水浴中(可以用一个消毒的500 ml烧杯，装好无菌的蒸馏水，加够水量，水位线稍低于250 ml锥形瓶的刻度线即可，过少则温度会不均匀，过高容易污染。
新生SD大鼠心肌细胞培养方法的简化与改进
新生SD大鼠心肌细胞培养方法的简化与改进摘要：目的：改良sd大鼠乳鼠心肌细胞培养的条件和方法，以分离得到更高纯度和存活率的心肌细胞。
方法：取出生1～3d内sd 大鼠的心室组织，采用胰蛋白酶和i型胶原酶多次消化心肌，差速贴壁培养2h，加brdu抑制成纤维细胞进行纯化培养，并在生物倒置显微镜下观察形态学变化，培养72h后，用免疫组化法检测纯度。
培养5、7、15、20、30d时，用台盼蓝染色法检测存活率。
结果：培养24h左右的细胞之间形成交联并有搏动，培养72h的心肌细胞的纯度为98.2%，培养15d内存活率大于95.0%。
结论：本实验应用改良并简化的心肌细胞培养方法可得到纯度和存活率较高的原代乳鼠心肌细胞，适合进一步推广。
关键词：sd大鼠乳鼠心肌细胞原代培养doi：10.3969/j.issn.1671-8801.2013.07.023【中图分类号】r4 【文献标识码】a 【文章编号】1671-8801（2013）07-0025-02体外培养的大鼠心肌细胞保留了基本结构和功能，不受体内神经、体液等的影响，被广泛用于心血管生物学、细胞电生理、药理毒理学等研究，足够纯度和活力的心肌细胞是保证完成这些实验的基础[1]。
文献报道的心肌细胞培养的方法很多，但都较为复杂，导致培养得到的心肌细胞纯度、活力各不相同[2]。
本研究结合前人的经验，对新生sd大鼠的心肌细胞原代培养方法进行了简化，以期培养出纯度较高、活力较强的大鼠心肌细胞。
1 材料和方法1.1 材料。
1.1.1 实验动物。
出生1～3d的sd大鼠，雌雄不拘，由南昌大学实验动物科学部提供。
1.1.2 材料与试剂。
dmem/f12干粉培养基（df培养基）、小牛血清、d-hank’s液，5-溴脱氧尿嘧啶（brdu）、i型胶原酶购自sigma 公司；小鼠抗大鼠α-横纹肌肌动蛋白单克隆抗体（α-sa），山羊抗小鼠igg购于武汉博士德微生物工程有限公司。
其余试剂均为国产分析纯。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养方法在心血管疾病研究和药物筛选中具有重要作用。
这篇文章将介绍大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养方法。
1. 材料与设备准备
- 器械：离心机、组织匀浆机、悬浮涡轮混匀器
- 药品：酶解液（含胰蛋白酶和胶原酶）、消毒液、培养基（如DMEM/F12）、胎牛血清、抗生素（如青霉素和链霉素）、细胞凝集抑制剂（如孟氏液）
- 物品：无菌培养皿、平板、离心管、滤纸等
2. 大鼠心肌细胞的分离
- 大鼠心脏取材，用消毒液彻底清洗
- 心脏取出放在无菌的平板上，用滤纸吸干水分，放置在组织匀浆机上
- 用组织匀浆机匀浆心脏，得到心肌匀浆液
- 将心肌匀浆液加入含有酶解液的离心管中，离心10分钟，去除上清液
- 将离心管中的沉淀加入培养基中，用悬浮涡轮混匀器混匀，得到心肌细胞悬浮液
3. 大鼠心肌细胞的鉴定
- 取适量心肌细胞悬浮液加入显微镜载玻片上
- 用显微镜观察细胞形态和数量
- 心肌细胞形态为长条形或四边形，具有横纹，细胞数量众多
4. 大鼠心肌细胞的培养
- 将心肌细胞悬浮液转移到无菌培养皿中
- 加入含有胎牛血清、抗生素和细胞凝集抑制剂的培养基
- 放入培养箱中，维持适宜的温度和湿度
- 每2-3天更换培养基，使细胞保持健康生长
总结：大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养过程中，要注意器械和物品的无菌处理，保持培养环境的适宜温度和湿度，以及定期更换培养基。
通过以上方法可以获得纯度较高的大鼠心肌细胞，用于进一步的研究和实验。
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基金项目:新疆石河子大学科学技术研究发展计划项目(ZRK X2006 Q04)新生大鼠心肌细胞培养技术新疆石河子大学医学院(832002) 李润琴 慕晓玲摘 要 目的 探讨新生大鼠心肌细胞的分离、培养方法。
方法 取1~3d 龄新生大鼠的心室肌细胞,用胶原酶!分离心肌细胞,离心收集心肌细胞,差速贴壁法纯化后培养于DM EM 培养基。
显微镜下鉴定心肌细胞的纯度和形态结构,锥虫蓝染色检查心肌细胞成活率。
结果 心肌细胞纯度为96%,平均成活率95 43%,并出现同簇细胞的同步跳动。
结论 该方法简单有效,为研究心肌细胞的人员提供了一种实验手段。
关键词 细胞培养技术; 心肌; 大鼠Culture method of the myocardial cell in Neonate Rats LI Run qin,M U X iao lin.M edical College of Shi hez i Uni versity ,X inj iang 832002,ChinaAbstract Objective T o find an easy way to separ ate and cultur e myocardial cells of neonate rats.Methods T o obtain ventr icular myocardium of neonate rats about 1~3years o ld.We separate myo cardial cell w ith collag enase I,and collect myocar dial cell w ith centrifug alization.M yocar dial cell was cultur ed in DM EM and was separated by the t ime of adherence.W e observed the structure of myocar dial cell from lig ht microscope and stained living my ocardial cell with trypan blue.Results W e find 96percent cells ar e myocardial cells and 95.43percent ar e alive.A ll the myocardial cells were jumping synchronously.C onclusion T his is an effective w ay to study myocardial cells.Key words Cell culture techniques; M yocardial; Rats原代培养心肌细胞作为一种主要的研究模型,被广泛地应用于心血管疾病的研究中。
我们经过长期摸索总结出一套简便、有效的大鼠心肌细胞的培养技术,为研究心肌细胞的人员提供一种实验手段[1]。
1 材料和方法1 1 主要试剂和仪器1 1 1 试剂:小牛血清:购自Sigma 公司。
DM EM (Dulbcc co ∀s M odified Eagle M edium)合成培养基:购自Sigma 公司,含10%的小牛血清,100万U 青霉素,100万U 链霉素。
胶原酶!0 8g/L:购自Sig ma 公司(现用现配)。
磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered saline,PBS ):购自Sigma 公司。
锥虫蓝:购自G ibco 公司,加无菌三蒸水配成浓度0 04%备用。
1 12 仪器:超净工作台,CO 2培养箱,倒置相差显微镜,离心机等。
所有手术器械高压灭菌。
玻璃品均强酸浸泡过夜,流水冲洗20遍,蒸馏水冲洗3遍,烤干后高压灭菌备用。
1 2 实验动物Wistar 大鼠,1~3d 龄,新生大鼠心肌细胞在出生后3d 内具有部分增殖能力,大鼠出生时间越短,其心肌细胞分离后成活率越高,越容易贴壁生长。
1 3 心肌细胞的制备和培养取一窝1~3d 龄新生大鼠,不用麻醉和处死,用手固定住四肢,75%的酒精消毒皮肤,无菌眼科剪在剑突上一肋处入剪(注意避免剪破消化道预防污染)。
开口0 5cm,心脏自然跳出,将心尖部组织剪下迅速置于预冷的不含Ca 2+、M g 2+的PBS 中,反复冲洗3遍,洗去残留的血细胞,将其剪成0 5~1mm 3大小的组织块,放入锥形瓶中[2],加入8mL 0 8g/L 的胶原酶!,在37#水浴,磁力搅拌器转速为100r/min,消化10min 。
将黏附在搅拌子上的心肌组织吹散,当组织液由红转白呈半透明状态时,应停止消化。
用吸管吸取第一次消化后的上清液弃去,再次以同上的方法消化3次,收集以后每次的消化后的上清液,加适量含10%的小牛血清的DM EM 培养基,终止胶原酶!对心肌细胞的继续作用。
将收集到的上清液在500r/min 的离心机上离心10min,弃去上清液,用PBS 吹散沉淀细胞,同条件下再次离心,弃上清,然后加含10%的小牛血清,100万U 青霉素,100万U 链霉素,p H =7 2的DM EM 培养基制成细胞悬液接种于培养瓶中,放入37#,5%CO 2培养箱中静置培养90min 后,轻轻振摇后倾出尚未贴壁的心肌细胞,重新接种。
将纯化的心肌细胞以1 5∃106/mL 接种于预先用50mg /L 多聚赖氨酸涂布的25mL 培养瓶中,每瓶3mL ,放入37#,5%CO 2培养箱中培养,每48h 更换1次培养基,取培养72h 的单层细胞进行实验。
1 4 心肌细胞质量评价1 4 1 心肌细胞纯度鉴定[3]:显微镜下观察、计数纯化后的细胞,心肌细胞成圆型,成纤维细胞成梭形,计算心肌细胞纯度=心肌细胞数/(心肌细胞数+成纤维细胞数)∃100%。
1 42 心肌细胞成活率检查:于心肌细胞培养24h后取细胞悬液以0 04%锥虫蓝适当稀释,混匀后吸取一滴于血球计数器上,置显微镜下观察细胞形态,杆状着色为死亡的心肌细胞,杆状未着色为存活的心肌细胞。
每瓶计数500个心肌细胞,计算心肌细胞的成活率=(成活的心肌细胞/ 500)∃100%。
1 4 3 心肌细胞形态学观察:光镜观察,常规倒置显微镜观察细胞形态。
2 结 果2 1 纯度鉴定结果:用差速贴壁法纯化后计数1000个细胞,圆形心肌细胞960个,梭形成纤维细胞40个,心肌细胞纯度为96%。
2 2 心肌细胞成活率:见表1。
表1 心肌细胞成活率培养瓶存活数死亡数总计成活率(%)平均成活率(%) 14752550095.024802050096.034762450095.244742650094.854782250095.664802050096.095.432 3 心肌细胞形态学观察:未贴壁前心肌细胞为圆形或椭圆形。
4h后开始贴壁生长,并不断分裂增殖,逐渐呈梭形,多角形,核多为一个或两个,呈圆形,核仁清楚。
24h后细胞呈杆状,长宽比约4~6&1,形成同心圆放射状细胞簇。
第3天形成单层细胞铺满瓶底,并出现同簇细胞的同步跳动,搏动频率、节律、强度稳定,80~120次/min左右。
3 讨 论自从1960年H arary首次对Wistar乳鼠的心肌细胞进行培养,并成功地维持其自发性节律搏动长达40d以来,国内外学者致力于心肌细胞的研究,体外培养的心肌细胞具有简便、定量、重复性好以及不受神经体液因素影响等特点,可以开展心肌细胞的生长发育、生理、代谢、病理、药理等方面的基础研究[4 7],我们参照国内外文献方法,成功地完成了新生大鼠的心肌细胞培养,成活率95 43%。
我们在心肌细胞培养过程中总结如下。
3 1 心肌细胞的分离:∋新生大鼠鼠龄的选择:新生大鼠在出生后3d内具有部分增殖能力,成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞,不再具有分裂增殖的能力,因此,大鼠出生时间越短,其心肌细胞分离成活率越高,越容易贴壁生长,大量实验观察,尤其半日龄大鼠心肌细胞培养效果最佳。
(手术操作过程应该严格消毒,注意无菌操作,避免损伤消化道,动作迅速,尽量缩短心肌缺血缺氧时间。
)分离心肌细胞通常用胰蛋白酶和胶原酶,胰蛋白酶作用较强,容易造成心肌细胞损害,通常使用浓度为0 05%~0 25%,分次消化。
胶原酶作用较缓和,能消化细胞间质中的胶原纤维,对心肌细胞损伤较小,且在新生大鼠心肌组织中以胶原!为主,故我们选用胶原酶![8],现配现用。
分次消化可减轻胶原酶或胰蛋白酶对单细胞的破坏作用。
消化温度在35~37#左右,过高温度会增加胶原酶或胰蛋白酶的毒性,温度过低会降低胶原酶或胰蛋白酶的活性。
∗心肌细胞的收集:无论何种酶消化的心肌细胞,第1次消化后静置的上清液均应弃去,因其含有残留血细胞和从组织边缘消化下来的坏死心肌细胞。
收集消化后液体进行离心时,转速多为60~750r/m in,因为离心时速度太快可对心肌细胞造成损伤,本研究采用500r/min获得成功。
+换液时间:为避免成活的心肌细胞随换液被丢弃,多采用48h后换液。
3 2 心肌细胞的纯化:体外培养的心肌细胞中通常存在两类细胞,心肌细胞和成纤维细胞。
由于成纤维细胞增殖迅速,培养3~5d后在数目上可大大超过心肌细胞数目,而对心肌细胞的生长和收缩功能有很大影响,因此体外培养心肌细胞的纯化方法就显得很重要。
目前国内外常用的纯化分离方法有:∋差速贴壁法:根据心肌细胞和成纤维细胞在培养器皿表面贴壁生长的速度不同而分离的方法。
此方法具有操作简便、时间短、对细胞影响小、分离纯度高等优点,国外实验室多采用这种方法。
纯化后培养的心肌细胞较混合培养的细胞搏动时间长,开始搏动的时间提前,易形成同步,且收缩力强。
但该法的不足之处在于不适用于心肌细胞长期培养实验,因培养数天后成纤维细胞的比例就大大增大,本实验采用差速贴壁分离法纯化心肌细胞,纯度为96%。
(化学试剂抑制法:是某些化学物质对成纤维细胞有抑制作用,而对心肌细胞则无明显影响。
非心肌细胞分化较快,有丝分裂率较高,在培养基中加入有丝分裂抑制剂如:溴脱氧尿苷(Brdu)、阿糖胞苷(Ara C)等抑制剂,抑制成纤维细胞DNA和蛋白质合成,达到抑制成纤维细胞增生的目的。
但其对心肌细胞或多或少也会有一定的影响,这是不足之处。
3 3 心肌细胞的培养:∋接种的细胞密度:心肌细胞接种密度不仅影响细胞间的相互接触,而且影响长期培养细胞的成活率。
一般根据实验的观测目的决定单位面积上的细胞数量,范围多在5∃107~5∃109/L。
细胞数目过多易发生营养不良;细胞数目过少,心肌细胞不能相互接触,心肌细胞间无法进行信息交流,心肌细胞收缩不易同步,收缩持续时间变短。
本研究接种密度1 5∃109/L,获得成功。