免疫固定电泳操作规程

免疫固定电泳操作规程

项目名称

免疫固定电泳( HYDRAGEL IMMUNOFIXATION)

检验方法名称

琼脂糖凝胶免疫固定电泳

方法学原理

血清蛋白电泳中岀现的异常条带主要存在于B -球蛋白和丫 -球蛋白区域，通常疑为单克隆蛋

白质并且提示丙球蛋白血症。为鉴别异常条带，可运用免疫固定技术。免疫固定电泳是一种简单的技术，电泳后的蛋白质与相应抗体形成复合物和被固定在相应的位置上，通过下列四个步骤： 1．蛋白质在琼脂糖凝胶内进行电泳分离。

2．电泳后已分离的蛋白质被固定并产生免疫沉淀：应用固定剂和抗血清加于凝胶表面的泳道上，并让固定剂和抗血清在凝胶内渗透扩散。

3．使用吸水纸和清洗将未沉淀的蛋白质去除，已被沉淀的蛋白质贮留在凝胶内。 4．将蛋白质染色，并将这些免疫沉淀区带的位置与蛋白质经电泳后观察到的异常蛋白区带进行比较。

为了精确识别单克隆区带，样品同时在六条泳道上进行测试。经电泳后，ELP作为参考泳道

以显示电泳后的蛋白质。其余五条泳道用于鉴定单克隆成分。通过它(们)与抗血清，丫

(IgG)、

a (IgA)、卩(IgM)重链和K、入轻链(游离和非游离)反应与否进行鉴别。该技术简单、快速、图象清晰，易于解释结果。

方法学溯源

自 1930 年由 Tiselius 发现了移界电泳( moving boundary eectrophoresis )，而后，这种技术的各种局限性已逐渐被区带电泳( zone elecrrophoresis )所克服，区带电泳的条件和支持介质的选择是电泳成败的关键。通过免疫化学手段观察其电泳特性及抗原特性是鉴定某一蛋白成分最好的方法，免疫固定电泳技术是目前应用最广泛的方法之一。

仪器

型号： SEBIA HYDRASYS (PN1210)

分析和计算参数：

处理量：约 18 个样本 / 小时

所需样本量： 10ul

检验时间：约 55 分钟

重复性：有良好的批内和批间重复性

电泳参数：电压 0 — 300V (可选至 3000V)

电流 0－ 500mA

功率 0— 100W

试剂及配套品试剂

HYDRAGEL 1 IF式剂盒

HYDRAGEL 2 IF式剂盒

HYDRAGEL 4 IF式剂盒

HYDRAGEL 9 IF式剂盒

商标：SEBIA

包装规格：10测试/20测试/40测试/90测试

货号：PN4301/ PN4302/ PN4304/PN4309

脱色液

(1)商标：SEBIA

(2)包装规格：Pack for 10 x 100ml

(3)货号：PN4540

(4)成分：柠檬酸

3 •洗涤液

商标：SEBIA

包装规格：Pack for 10 x 80ml

货号：PN4541

成分：叠氮钠

4 .稀释剂

商标：SEBIA

包装规格：Pack for 1 x 5ml

货号：PN4587

配套品：IF试剂抗体

(1) 商标：SEBIA

(2 ) 包装规格：Pack for 5 x 1ml

(3) PN4315

操作步骤

㈠开机，启动电泳仪。

㈡将1只(用于1, 2IF), 2只(用于4IF)或3只佣于9IF)点样梳置于整表面，有数字的一端向上，在2分钟内完成每块加样梳的加样，每孔加 10ul样品，然后齿梳向上把加样梳放于湿盒内5分钟。

㈢选择相应的“ IF”电泳程序，

㈣从包装袋内取出缓冲条，将其固定在电极支架背侧的钉上，再取出凝胶，用薄滤纸快速轻轻

地吸去凝胶表面多余的液体，在温控板表面下1/3处加200ul蒸馏水或去离子水，将凝胶片底边

紧靠框架底边，边缘对齐边线，略弯曲凝胶片慢慢放平，注意凝胶片下面勿岀现气泡。

㈤自然放下支架，从湿盒中取岀加样梳并去除齿梳下的保护支架，1、2IF的点样梳置于支架 6 号位，4IF的2只点样梳则分别置于 3号和9号，9IF的3只点样梳则分别置于 2, 6号和10 号, 注意点样梳上的数字必须面对操作者，关上电泳舱盖，按下键盘左侧的绿色箭头“START键，

电泳开始，确保仪器右侧的空气通道不被堵塞。

㈥电泳仪自动发出蜂鸣声，提示电泳结束，进行免疫固定操作。打开电泳盖，将加样梳和缓冲条

丢弃，移走两支架，用湿纸巾擦拭电极丝，将抗体加样条装入抗体加样架上，按如下要求将动物

血清抗体加入抗体加样条：

•ydrasys 1 IF用6孔抗体加样条：每孔加8卩l抗体

•ydrasys 2/4IF用15孔抗体加样条:2人份每孔加8卩l抗体，4人份每孔加12卩l抗体

•ydrasys 9 IF用18孔抗体加样条：每孔加8卩l抗体

固定好抗体加样架，将抗体加到凝胶片上。然后关上电泳舱盖，按“Start ”键开始免疫固定。

㈦10分钟后，电泳仪自动发岀蜂鸣声，提示“PAPER BLOTTING ，移走抗体加样架，弃

去抗体加样条，放一厚滤纸光面向下盖于于凝胶表面，左手固定好滤纸，右手手指用力的摩擦滤

纸表面，注意勿将滤纸移动，关闭电泳舱盖，按“Start "键开始凝胶表面多余抗体的吸收。

㈧3分钟后，电泳仪自动发岀蜂鸣声，打开电泳舱盖，移去滤纸，关闭舱盖，按“Start”键开始凝胶片的干燥。

㈨6分钟后，电泳仪自动发岀蜂鸣声，打开电泳舱盖，取岀凝胶片，用湿纸巾擦拭温控板，将

胶片固定于凝胶支架上放入染色空间中，在检查洗液瓶中是否有400ml洗液，染色液瓶内是否

有300ml染色液，脱色液瓶内是否有1000ml脱色液以及是否排空了废液瓶后，菜单上选择染色

指令，按“ Start ”键开始染色。

㈩在染色、脱色以及干燥步骤完成后，电泳仪自动发岀蜂鸣声，取岀凝胶支架，将烘干的胶片取下。

临床意义

对多发性骨髓瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症、分泌型骨髓瘤、轻链病、重链病等研究有重大意

义。

1 .正常人体内有正常的免疫球蛋白分布，故免疫固定电泳图谱可见均匀分布的IgG/A/M

2.在IgG/A/M及Kappar、lammda的泳道上发现浓集的条带即为病理性的。

标本要求

㈠取新鲜血清进行分析，根据临床实验室对各种试验所使用的操作程序进行血清样本的采集，样本置于冰箱内(2〜8C)可保存一周，若冰冻可延长保存时间至少一个月。冰冻的血清样本加入dl的叠氮钠可以增加其存放稳定性。

㈡为避免抗原过剩引起的带现象，血清于加样前应先作如下稀释，并混匀。

㈢特殊情况