免疫固定电泳ppt
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免疫电泳
据沉淀线的数量、位置和形状，与已知的正常人沉淀线比较，
即可对样品中所含成分及其性质进行分析、鉴定。(K)
免疫电泳操作步骤：
技术评价：
结果复杂(经验判断) 可不生成沉淀线（浓度太高或太 低），或沉淀线重合
结查分析（K）
（1）Ig量及单克隆性与沉淀线致密度 关系
（2）Ig量与抗体槽距离之间的关系： 抗原抗体最适比关系
火箭电泳操作时应注意以下几点：
l．电渗小 2．电泳终点时间较难掌握 3．开启小电流后再加样，否则形 成宽底峰 4．IgG电泳应先将其甲酰化，使只 带负电荷
技术评价：
PH 8.6时，分析蛋白质抗原带 有负电荷
免球测定应先甲酰化，以增加 其净负电荷量
应用：
大多数蛋白质均可用这一方法 进行测定，但目前已被敏感度高， 特异性好的ELISA等方法代替。
－
火箭免疫电泳操作步骤：
制备含抗体的琼脂板(K)→打孔→ 加样→电泳→出现火箭形沉淀线→ 洗涤、染色、分析结果
火箭免疫电泳的定量测定
“ 峰高——浓度标准”曲线：以不同稀
释度标准抗原泳动后形成的沉淀峰为纵坐标，抗 原浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据样品的沉 淀峰长度即可计算出待测抗原的含量。
唯一的定量方法（K）
泳物质分子量大小等决定。 2．凝胶打孔及处理
用打孔器在凝胶板上打孔后，要用琼脂溶液封 底，以免样品渗漏。
3．加样
加样时琼脂板应先通上微弱电流，以免样品过 多自由扩散。
4．选择抗原与抗体比例
适当比例抗原抗体反应生成大的免疫复合物， 选择抗原和抗体的比例尽量减少前后带现象的发 生。
5．检测方法 如果沉淀线理想，通过肉眼观察即可定性。 在一些定量测定中，往往辅助以下方法来提高
蛋白质具有可解离的酸性和碱性基团，在一定 PH值条件下，使蛋白质分子带正电荷或负电荷。 在电场中，带正电荷的粒子向负极移动，而带负 电荷的粒子向正极移动，由于各种蛋白质迁移率 不同而分为不同的区带。
II.电泳的影响因素
1. 颗粒（蛋白）本身特性：两性、大小、形状 2.载体性质 ：最常用的载体是琼脂和琼脂糖凝胶 3.电场强度 4.溶液PH值及离子强度——缓冲液的作用
3.火箭免疫电泳
定义：加速度的单向扩散（J）
含有抗体的琼指
测定样本
标准曲线
火箭免疫电泳示意图
基本原理：琼脂凝胶中的抗体
不发生移动(K)，样品孔中的 抗原向正极泳动，随抗原含量 的逐渐减少，抗原泳动的基底 区越来越窄，抗原抗体分子复 合物形成的沉淀线逐渐变窄， 形成一个状如火箭的不溶性免 疫复合物沉淀峰。
鉴定方法：先将患者血清在琼脂上等作区带电 泳，之后，加抗血清，依次加抗IgG、抗IgA、 抗IgM、抗K轻链和抗L轻链。必要时还可加抗 Fab、抗Fc等特殊抗血清，作用后，洗涤，染色 后分析固定的M蛋白成分。
该方法可用于各种蛋白水平的定性检测。
四、凝胶免疫电泳的技术要点
1．电泳载体的选择 与电泳要求的具体条件如摩擦力，电渗、及电
进行区带电泳，电泳结束后，于琼脂 板旁挖一长形槽，加入相应抗血清， 抗体呈直线扩散，电泳分离后的各种 抗原呈放射状扩散，反应生成弧状沉 淀线。
将蛋白质抗原在琼脂平板上进行 电泳，使不同的抗原彼此分离。
撤去电压，在与电泳方向平行 的琼脂打槽并加入相应抗体进 行双向免疫分散。
分离成区带的各种抗原成分与相 应抗体在琼脂中扩散后相遇，在 二者比例合适处形成弧形沉淀线。
应用：
血清蛋白的分析，如多发性骨 髓瘤、 r 球蛋白缺乏症
2. 对流免疫电泳 定义：定向加速度的免疫双扩散技术（K）
电渗：指在电场中液体对于一个固定介质的相对移动。
对流免疫电泳示意图
在pH8.0的缓冲液中，蛋白质 抗原带负电荷向正极泳动；而 抗体Ig由于分子量大，暴露的 极性基团较少，在离子琼脂中 泳动缓慢，同时受电渗作用的 影响向负极泳动 在抗原抗体相 遇的最适比例处形成乳白色沉 淀线。
最适电泳缓冲液0.05M，PH8.6 巴比妥缓冲液
5.电渗（主要与载体特性有关） 电渗定义 电渗方向与电泳方向的关系
J 电泳迁移率：指在同一电场条件下，各种带电
粒子在单位时间内移动的距离。 6.电源
三、介绍几种经典的免疫电泳技术
1.免疫电泳
定 义：区带电泳 + 免疫双扩散(K)
基本原理：在电场作用下，将标本于琼脂凝胶中
检测的敏感度。 (1) 染色 (2) 光密度测定法 (3) 放射性自显影
5.免疫固定电泳(K)
（immunofixation electrophoresis。IFE）
（IgA 型MM）
基本原理：
将抗血清直接加于电泳后 蛋白质区带表面，抗原与 对应抗体直接发生沉淀反 应，未结合的游离抗原或 抗体洗去，则出现被结合 而固定的某种蛋白。
海伦娜免疫固定仪
应用：
免疫固定电泳最常用于M蛋白的鉴定。
对流免疫电泳操源自文库步骤：
Ab
Ag
制琼脂板→打孔→加样 →电泳
出现沉淀线→洗涤、染 色、分析结果
技术评价：
高电渗为特点，但电渗过强会使蛋白质向阴极移
动（K）
对流免疫电泳简便、快速、敏感度较高 抗原、抗体比例要求严格 抗原或抗体PI相近或迁移率非常接近，不宜做对 流免疫电泳
应用：
可用于乙肝病人血清鉴定；甲 胎蛋白的测定，但近年多以ELISA 替代。
免疫电泳技术
四川大学华西医院临床免疫室
武永康
本课内容
一、免疫电泳技术的发展 二、免疫电泳技术的相关概念 三、介绍几种经典的免疫电泳技术（重点） 四、凝胶免疫电泳技术要点 五、免疫增殖性疾病及免疫检测
免疫电泳技术
一、免疫电泳技术的发展
1953年Grabar和Williams将凝胶扩散置于 直流电场中，让电流来加速抗原与抗体的扩散 并规定其运动方向，并与免疫沉淀反应相结合， 从而加快了沉淀反应的速度，建立了免疫电泳 技术，之后又衍生出对流免疫电泳、火箭电泳、 及免疫固定电泳等新方法。
二、免疫电泳技术的相关概念
（一）免疫电泳技术的定义
琼脂电泳与免疫扩散沉淀技术相结合的一门技术。(K)
1．电泳优点
（1）将蛋白电泳分开 （2）加快反应速度
2．沉淀反应
免疫电泳
分析
immunoelectrophoresis
（二）电泳的基本原理及其影响因素
I．基本原理
电泳（electrophoresis）:带电颗粒在电场中 通过液体介质的移动，称为电泳。
据沉淀线的数量、位置和形状，与已知的正常人沉淀线比较，
即可对样品中所含成分及其性质进行分析、鉴定。(K)
免疫电泳操作步骤：
技术评价：
结果复杂(经验判断) 可不生成沉淀线（浓度太高或太 低），或沉淀线重合
结查分析（K）
（1）Ig量及单克隆性与沉淀线致密度 关系
（2）Ig量与抗体槽距离之间的关系： 抗原抗体最适比关系
火箭电泳操作时应注意以下几点：
l．电渗小 2．电泳终点时间较难掌握 3．开启小电流后再加样，否则形 成宽底峰 4．IgG电泳应先将其甲酰化，使只 带负电荷
技术评价：
PH 8.6时，分析蛋白质抗原带 有负电荷
免球测定应先甲酰化，以增加 其净负电荷量
应用：
大多数蛋白质均可用这一方法 进行测定，但目前已被敏感度高， 特异性好的ELISA等方法代替。
－
火箭免疫电泳操作步骤：
制备含抗体的琼脂板(K)→打孔→ 加样→电泳→出现火箭形沉淀线→ 洗涤、染色、分析结果
火箭免疫电泳的定量测定
“ 峰高——浓度标准”曲线：以不同稀
释度标准抗原泳动后形成的沉淀峰为纵坐标，抗 原浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据样品的沉 淀峰长度即可计算出待测抗原的含量。
唯一的定量方法（K）
泳物质分子量大小等决定。 2．凝胶打孔及处理
用打孔器在凝胶板上打孔后，要用琼脂溶液封 底，以免样品渗漏。
3．加样
加样时琼脂板应先通上微弱电流，以免样品过 多自由扩散。
4．选择抗原与抗体比例
适当比例抗原抗体反应生成大的免疫复合物， 选择抗原和抗体的比例尽量减少前后带现象的发 生。
5．检测方法 如果沉淀线理想，通过肉眼观察即可定性。 在一些定量测定中，往往辅助以下方法来提高
蛋白质具有可解离的酸性和碱性基团，在一定 PH值条件下，使蛋白质分子带正电荷或负电荷。 在电场中，带正电荷的粒子向负极移动，而带负 电荷的粒子向正极移动，由于各种蛋白质迁移率 不同而分为不同的区带。
II.电泳的影响因素
1. 颗粒（蛋白）本身特性：两性、大小、形状 2.载体性质 ：最常用的载体是琼脂和琼脂糖凝胶 3.电场强度 4.溶液PH值及离子强度——缓冲液的作用
3.火箭免疫电泳
定义：加速度的单向扩散（J）
含有抗体的琼指
测定样本
标准曲线
火箭免疫电泳示意图
基本原理：琼脂凝胶中的抗体
不发生移动(K)，样品孔中的 抗原向正极泳动，随抗原含量 的逐渐减少，抗原泳动的基底 区越来越窄，抗原抗体分子复 合物形成的沉淀线逐渐变窄， 形成一个状如火箭的不溶性免 疫复合物沉淀峰。
鉴定方法：先将患者血清在琼脂上等作区带电 泳，之后，加抗血清，依次加抗IgG、抗IgA、 抗IgM、抗K轻链和抗L轻链。必要时还可加抗 Fab、抗Fc等特殊抗血清，作用后，洗涤，染色 后分析固定的M蛋白成分。
该方法可用于各种蛋白水平的定性检测。
四、凝胶免疫电泳的技术要点
1．电泳载体的选择 与电泳要求的具体条件如摩擦力，电渗、及电
进行区带电泳，电泳结束后，于琼脂 板旁挖一长形槽，加入相应抗血清， 抗体呈直线扩散，电泳分离后的各种 抗原呈放射状扩散，反应生成弧状沉 淀线。
将蛋白质抗原在琼脂平板上进行 电泳，使不同的抗原彼此分离。
撤去电压，在与电泳方向平行 的琼脂打槽并加入相应抗体进 行双向免疫分散。
分离成区带的各种抗原成分与相 应抗体在琼脂中扩散后相遇，在 二者比例合适处形成弧形沉淀线。
应用：
血清蛋白的分析，如多发性骨 髓瘤、 r 球蛋白缺乏症
2. 对流免疫电泳 定义：定向加速度的免疫双扩散技术（K）
电渗：指在电场中液体对于一个固定介质的相对移动。
对流免疫电泳示意图
在pH8.0的缓冲液中，蛋白质 抗原带负电荷向正极泳动；而 抗体Ig由于分子量大，暴露的 极性基团较少，在离子琼脂中 泳动缓慢，同时受电渗作用的 影响向负极泳动 在抗原抗体相 遇的最适比例处形成乳白色沉 淀线。
最适电泳缓冲液0.05M，PH8.6 巴比妥缓冲液
5.电渗（主要与载体特性有关） 电渗定义 电渗方向与电泳方向的关系
J 电泳迁移率：指在同一电场条件下，各种带电
粒子在单位时间内移动的距离。 6.电源
三、介绍几种经典的免疫电泳技术
1.免疫电泳
定 义：区带电泳 + 免疫双扩散(K)
基本原理：在电场作用下，将标本于琼脂凝胶中
检测的敏感度。 (1) 染色 (2) 光密度测定法 (3) 放射性自显影
5.免疫固定电泳(K)
（immunofixation electrophoresis。IFE）
（IgA 型MM）
基本原理：
将抗血清直接加于电泳后 蛋白质区带表面，抗原与 对应抗体直接发生沉淀反 应，未结合的游离抗原或 抗体洗去，则出现被结合 而固定的某种蛋白。
海伦娜免疫固定仪
应用：
免疫固定电泳最常用于M蛋白的鉴定。
对流免疫电泳操源自文库步骤：
Ab
Ag
制琼脂板→打孔→加样 →电泳
出现沉淀线→洗涤、染 色、分析结果
技术评价：
高电渗为特点，但电渗过强会使蛋白质向阴极移
动（K）
对流免疫电泳简便、快速、敏感度较高 抗原、抗体比例要求严格 抗原或抗体PI相近或迁移率非常接近，不宜做对 流免疫电泳
应用：
可用于乙肝病人血清鉴定；甲 胎蛋白的测定，但近年多以ELISA 替代。
免疫电泳技术
四川大学华西医院临床免疫室
武永康
本课内容
一、免疫电泳技术的发展 二、免疫电泳技术的相关概念 三、介绍几种经典的免疫电泳技术（重点） 四、凝胶免疫电泳技术要点 五、免疫增殖性疾病及免疫检测
免疫电泳技术
一、免疫电泳技术的发展
1953年Grabar和Williams将凝胶扩散置于 直流电场中，让电流来加速抗原与抗体的扩散 并规定其运动方向，并与免疫沉淀反应相结合， 从而加快了沉淀反应的速度，建立了免疫电泳 技术，之后又衍生出对流免疫电泳、火箭电泳、 及免疫固定电泳等新方法。
二、免疫电泳技术的相关概念
（一）免疫电泳技术的定义
琼脂电泳与免疫扩散沉淀技术相结合的一门技术。(K)
1．电泳优点
（1）将蛋白电泳分开 （2）加快反应速度
2．沉淀反应
免疫电泳
分析
immunoelectrophoresis
（二）电泳的基本原理及其影响因素
I．基本原理
电泳（electrophoresis）:带电颗粒在电场中 通过液体介质的移动，称为电泳。