免疫固定电泳操作规程

免疫固定电泳操作规程

一．项目名称

免疫固定电泳(ＨYＤRＡＧＥL IMMUＮＯFIXAＴION)

二．检验方法名称

琼脂糖凝胶免疫固定电泳

三．方法学原理

血清蛋白电泳中出现得异常条带主要存在于β—球蛋白与γ—球蛋白区域,通常疑为单克隆蛋白质并且提示丙球蛋白血症。为鉴别异常条带,可运用免疫固定技术。免疫固定电泳就是一种简单得技术,电泳后得蛋白质与相应抗体形成复合物与被固定在相应得位置上,通过下列四个步骤:

1。蛋白质在琼脂糖凝胶内进行电泳分离。

2。电泳后已分离得蛋白质被固定并产生免疫沉淀:应用固定剂与抗血清加于凝胶表面得泳道上,并让固定剂与抗血清在凝胶内渗透扩散、

３。使用吸水纸与清洗将未沉淀得蛋白质去除,已被沉淀得蛋白质贮留在凝胶内。

4、将蛋白质染色,并将这些免疫沉淀区带得位置与蛋白质经电泳后观察到得异常蛋白区带

进行比较。

为了精确识别单克隆区带,样品同时在六条泳道上进行测试。经电泳后,ELP作为参考泳道以显示电泳后得蛋白质。其余五条泳道用于鉴定单克隆成分。通过它(们)与抗血清,γ(IｇG)、α(ＩｇA)、μ(IgM)重链与κ、λ轻链(游离与非游离)反应与否进行鉴别、该技术简单、快速、图象清晰,易于解释结果。

四．方法学溯源

自1930年由Tｉｓｅlius发现了移界电泳(moviｎg bounｄａry ｅectrophoresis),而后,这种技术得各种局限性已逐渐被区带电泳(zoｎe eｌecrｒophoresiｓ)所克服,区带电泳得条件与支持介质得选择就是电泳成败得关键。通过免疫化学手段观察其电泳特性及抗原特性就是鉴定某一蛋白成分最好得方法,免疫固定电泳技术就是目前应用最广泛得方法之一。

五．仪器

（一）型号:ＳＥBIA HＹＤRASYＳ(PＮ12１0)

（二）分析与计算参数:

1．处理量:约18个样本/小时

2．所需样本量:10ul

3．检验时间:约55分钟

4．重复性:有良好得批内与批间重复性

5．电泳参数:电压0—30０V(可选至３０00V)

电流0—500mＡ

功率0-１00Ｗ

六．试剂及配套品

（一）试剂

1．HＹDＲＡGEＬ1 IF试剂盒

HＹDＲAＧＥL 2IF试剂盒

HYDRＡGEL 4IF试剂盒

HYＤＲAGＥL 9 ＩＦ试剂盒

（1）商标:ＳＥBIA

（2）包装规格:10测试/2０测试／40测试/90测试

（3）货号:ＰN４301/ＰN４３0２／PN4３04/ＰN４３０９

2．脱色液

(1) 商标:SＥＢIA

(2)包装规格:Ｐａcｋfｏr １０×100ml

(3) 货号:PＮ4５40

(４) 成分:柠檬酸

3、洗涤液

（1）商标:ＳEBＩA

（2）包装规格:Paｃk foｒ10×80ｍl

（3）货号:ＰＮ4541

（4）成分:叠氮钠

4.稀释剂

（1）商标:SEＢIA

（2）包装规格:Paｃｋfｏr1×５ml

（3）货号:PN458７

（二）配套品:ＩＦ试剂抗体

(1) 商标:SEBIA

(2 ) 包装规格:Pａcｋfor 5×1mｌ

(３)PＮ4３15

七．操作步骤

㈠开机,启动电泳仪。

㈡将1只(用于1,２IＦ),2只(用于4ＩＦ)或３只(用于9IF)点样梳置于整表面,有数字得一端向上,在2分钟内完成每块加样梳得加样,每孔加1０ul样品,然后齿梳向上把加样梳放于湿盒内5分钟、

㈢选择相应得“IF”电泳程序,

㈣从包装袋内取出缓冲条,将其固定在电极支架背侧得钉上,再取出凝胶,用薄滤纸快速轻轻地吸去凝胶表面多余得液体,在温控板表面下１/3处加２00ul蒸馏水或去离子水,将凝胶片底边紧靠框架底边,边缘对齐边线,略弯曲凝胶片慢慢放平,注意凝胶片下面勿出现气泡。

㈤自然放下支架,从湿盒中取出加样梳并去除齿梳下得保护支架,1、2IF得点样梳置于支架６号位,４IF得２只点样梳则分别置于3号与9号,9IＦ得3只点样梳则分别置于2,６号与１０号,注意点样梳上得数字必须面对操作者,关上电泳舱盖,按下键盘左侧得绿色箭头“ＳT ＡRT"键,电泳开始,确保仪器右侧得空气通道不被堵塞。

㈥电泳仪自动发出蜂鸣声,提示电泳结束,进行免疫固定操作、打开电泳盖,将加样梳与缓冲条丢弃,移走两支架,用湿纸巾擦拭电极丝,将抗体加样条装入抗体加样架上,按如下要求将动物血清抗体加入抗体加样条:

··Hydrａsys 1 IF用6孔抗体加样条:每孔加8μｌ抗体

··Hydrａsys 2/4IF用１５孔抗体加样条:2人份每孔加８μl抗体,4人份每孔加12μｌ抗体··Hydrａｓyｓ 9 IF用18孔抗体加样条: 每孔加8μl抗体

固定好抗体加样架,将抗体加到凝胶片上、然后关上电泳舱盖,按“Stａｒｔ”键开始免疫固定。

㈦10分钟后,电泳仪自动发出蜂鸣声,提示“PAＰER BLＯTTIＮＧ” ,移走抗体加样架,

弃去抗体加样条,放一厚滤纸光面向下盖于于凝胶表面, 左手固定好滤纸,右手手指用力得摩擦滤纸表面,注意勿将滤纸移动,关闭电泳舱盖,按“Ｓtarｔ”键开始凝胶表面多余抗体得吸收。

㈧3分钟后,电泳仪自动发出蜂鸣声,打开电泳舱盖,移去滤纸,关闭舱盖,按“Stａrｔ"键开始凝胶片得干燥。

㈨ 6分钟后,电泳仪自动发出蜂鸣声,打开电泳舱盖,取出凝胶片,用湿纸巾擦拭温控板,将胶片固定于凝胶支架上放入染色空间中,在检查洗液瓶中就是否有4０0ｍl洗液,染色液瓶内就是否有300ml染色液,脱色液瓶内就是否有1000ml脱色液以及就是否排空了废液瓶后,菜单上选择染色指令,按“Sｔart”键开始染色。

㈩在染色、脱色以及干燥步骤完成后,电泳仪自动发出蜂鸣声,取出凝胶支架,将烘干得胶片取下。

八．临床意义

对多发性骨髓瘤、Ｗaｌdenstrｏｍ巨球蛋白血症、分泌型骨髓瘤、轻链病、重链病等研究有重大意义、

1。正常人体内有正常得免疫球蛋白分布,故免疫固定电泳图谱可见均匀分布得IgG/A/M 2。在ＩgG/Ａ/M及Kａpｐａｒ、lamｍda得泳道上发现浓集得条带即为病理性得。九．标本要求

㈠取新鲜血清进行分析,根据临床实验室对各种试验所使用得操作程序进行血清样本得采集,样本置于冰箱内(２~８℃)可保存一周,若冰冻可延长保存时间至少一个月、冰冻得血清样本加入0.02g/dｌ得叠氮钠可以增加其存放稳定性。

㈡为避免抗原过剩引起得带现象,血清于加样前应先作如下稀释,并混匀、

㈢特Array殊情况

·当总免

疫球蛋

白得水

平＞20ｇ/L,稀释剂量加倍(除了ELP泳道)

·当总免疫球蛋白水平＜5g／L,稀释剂量减半(除了ＥLP泳道)

·冷藏或冰冻后,某些样本(尤其就是含有冷球蛋白或冷凝胶)可能变得粘稠或混浊。这种样本

可能由于扩散障碍而存在点样问题。在这样情况下,加２5ul液化剂于７5ml血清中,混匀

15秒、然后按规定程序继续进行。

·某些单克隆蛋白质可能因多聚体而导致所有得免疫固定泳道上均出现单克隆片段。在这样

情况下(i)准备1％β－巯基乙醇(这种还原剂可在室温于未封闭微管内保存1周)(iｉ)加25ul