链霉素损伤耳蜗毛细胞的机制研究

链霉素损伤耳蜗毛细胞的机制研究

第一部分 PARP-1介导的AIF转位参与链霉素导致耳蜗毛细胞损伤的机制研

究研究目的:氨基糖苷类药物导致的毛细胞损伤是感音神经性听力损失研究的重

要内容。以链霉素为代表的耳毒性药物在临床上仍然有着重要的应用。

目前药物性毛细胞损伤的确切机制尚未完全阐明,传统观点认为其是由含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspases)介导的细胞凋亡过程,但是也有观点认为非Caspases依赖的程序性细胞死亡通路也在其中起着重要的作用。本研究希

望通过建立耳蜗毛细胞链霉素损伤模型,探讨一种重要的线粒体来源的细胞死亡

调控因子——凋亡诱导因子(AIF),在毛细胞死亡过程中的作用并明确其调控机制,完善链霉素相关听力损失的防治理论基础并寻求新的治疗靶点。

研究方法:体外原代培养乳大鼠耳蜗基底膜毛细胞和连续培养HEI-OC1细胞,加入硫酸链霉素(以下简称链霉素)建立毛细胞体外损伤模型,加入链霉素和PARP-1抑制剂3-AB建立毛细胞保护模型。通过Myosin Ⅶla免疫荧光染色和共聚焦显微镜观察毛细胞,确定链霉素处理24h后基底膜毛细胞的数目及形态并选

择合适浓度的链霉素进行后续处理;MTT法检测HEI-OC1细胞链霉素处理后的相

对存活率以确定后续实验链霉素浓度,检测3-AB(1 mM)对毛细胞损伤的保护作用;免疫荧光染色结合共聚焦显微镜观察毛细胞内AIF核转位和PARP-1的激活情况;利用线粒体分离技术和Western-blot分析AIF在细胞内线粒体和细胞质中的含

量改变;qRT-PCR和Western-blot检测HEI-OC1细胞内PARP-1 m RNA和蛋白的表达情况。

研究结果:与对照组相比,不同浓度链霉素(1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml)处理24h后基底膜均出现萎缩,Myosin Ⅶa免疫荧光显示毛细胞不同程度的减少、排