山东农业大学生化-期末复习

有些内容较多，可以根据情况筛选主要内容作答。

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1单体酶:一般只有一条肽链组成的酶，如羧肽酶A，也有少数由多条肽链组成，如胰凝乳蛋白酶由3条肽链组成，链间以二硫键相连构成一个共价整体。

寡聚酶：有两个或两个以上亚基组成的酶，亚基间靠次级键结合，彼此容易分开，如大多数调节酶。

2单纯酶：分子中只含有氨基酸的酶，如胃蛋白酶等水解酶。

复合酶：又称全酶，由酶蛋白（脱辅酶）和非蛋白质（辅因子）两部分组成，非蛋白质部分包括辅助因子（多为金属离子）、辅酶、辅基。

如脱氢酶，转氨酶等。

3全酶：又称复合酶或结合酶，同上。

辅酶：与脱辅酶结合比较松弛的小分子有机物质，通过透析方法可以除去，如辅酶Ⅰ和辅酶Ⅱ等。

辅基：以共价键和脱辅酶紧密结合，不能通过透析除去，需要经过一定的化学处理才能与蛋白质分开，如细胞色素氧化酶中的铁卟啉。

辅酶或辅基的区别只在于它们与脱辅酶结合的牢固程度不同，并无严格界限，它们在酶催化中通常起着电子、原子、和某些化学基团的传递作用。

4多酶复合体：由几种酶靠非共价键彼此嵌合而成，其相对分子量很高，如脂肪酸合成酶复合体有7种酶和一个酰基携带蛋白组成。

5组成酶：是细胞以恒定速率和恒定数量生成的酶类，是细胞中天然存在的，其含量较稳定，一般不受外界影响。

诱导酶：是细胞中进入特定的诱导酶后，被诱导生成的，其有无和含量的多少受外界条件的影响。

6酶的比活力：也称比活性，代表酶的纯度，指每毫克蛋白所含的酶的活力单位数，对于同一种酶而言，酶的比活力越高，纯度越高。

7酶的纯化倍数：酶纯化过程中每一步骤所得的比活力与第一步骤的比活力之比值，起始时的纯化倍数定为1。

8酶纯化的回收率：纯化过程中每一步骤所得的总活力与第一步骤的总活力之比值，以百分比表示。

9酸碱催化：通过瞬时的向反应物提供质子或从反应物接受质子以稳定过渡态，加速反应的一类催化机制。

分为广义酸碱催化和狭义酸碱催化两种。

10共价催化：又称亲核催化或亲电子催化，在催化时，亲核催化剂或亲电子催化剂能分别放出电子或汲取电子并作用于底物的缺电子中心或负电中心，迅速形成不稳定的共价中间复合物，降低反应活化能，使反应
加速。

11变构酶：具有变构调节作用的酶成为变构酶，具有协同效应，其【S】对V的动力学曲线不是双曲线，而是S形曲线（正协同）或表观双曲线（负协同），都不符合米氏方程。

变构调节：酶分子的非催化部位与某些化合物可逆的非共价结合后发生构象的改变，进而改变酶活性状态，成为别构调节。

（共价调节酶）在其它酶的作用下，对其结构进行可逆的共价修饰，使之处于活性与非活性的互变状态，从而调节酶的活性。

最常见的是可逆磷酸化修饰。

12化学修饰酶：通过对酶分子的化学修饰改变酶的性能，以适用于医药的应用及研究工作的要求。

化学修饰的途径可以通过对酶分子表面进行修饰，也可对酶分子的内部修饰，其主要方法有：化学修饰酶的功能基、交联反应及大分子修饰作用。

13同工酶：是指同一种属中由不同基因或等位基因编码的多肽链所组成的酶，能催化相同的化学反应，但其蛋白质分子结构理化性质和免疫性等方面都存在明显差异的一组酶。

如乳酸脱氢酶有5种同工酶。

14酶反应的初速率：指在酶促反应过程中，初始底物浓度被消耗5%以内的速度。

15酶的转换数：当酶被底物完全饱和时，每单位时间内每个酶分子所能转换的底物分子数，这个常数叫做转换数（TN）,通称为催化常数（Kcat）.Kcat值越大表示酶的催化效率越高。

16酶的必需基团：
17酶的亲和标记：Ks型不可逆抑制剂具有底物类似结构同时还带有一个活泼的化学修饰基团，可通过对酶的亲和力来对酶进行修饰标记，抑制酶的活性，称为亲和标记。

18 Ks型不可逆抑制剂：属于专一性不可逆抑制剂，又称为亲和标记试剂，具有与底物类似的结构，还带有一个活泼的化学基团，可通过对酶的亲和力来对酶进行修饰标记，抑制酶活性，专一性有一定的限度。

Kcat型不可逆抑制剂:也属于专一性不可逆抑制剂，又称为自杀性底物。

不但具有与天然底物类似的结构，且本身也是酶的底物，还有一个潜伏的反应基团，可作用于酶活性部位的必需基团或辅基上，使酶不可逆失活，专一性极高。

19过渡态底物类似物：化学结构类似于过渡态底物的物质，其对酶的亲和力远大于底物，可作为酶的竞争性抑制剂，引起酶的强烈抑制，这类物质称为过渡态底物类似物。

20 K型效应物：凡是改变底物的K0.5而不改变反应Vmax的效应物成为K 型效应物。

（如竞争性抑制剂）
V型效应物：凡是改变Vmax而不改变底物K0.5的效应物称为V型效应物。

（如非竞争型抑制剂）
21 酶工程：主要研究酶的生产、纯化、固定化技术、酶分子结构的修饰和改造以及在工农业、医药卫生和理论研究等方面的应用。

22生物酶工程：是酶学和以DNA重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物，因此，又可称为高级酶工程。

主要把包括3个方面内容：用基因工程技术大量生产酶（克隆酶）；对酶基因进行修饰，产生遗传修饰酶（突变酶）；设计新酶基因，合成自然界不曾有的新酶。

化学酶工程：又称为初级酶工程，是指天然酶、化学修饰酶、固定化酶及人工模拟酶的研究和应用。

23固定化酶：是20试剂60年代发展起来的一项新技术。

通常酶催化反应都是在水溶液中进行的，而固定化酶是将水溶性酶用物理或化学方法处理，使之成为不溶于水的，但仍具有酶活性的状态。

经过固定化的酶不仅具有高的催化效率和专一性，而且提高了对酸碱和温度的稳定性，增加了酶的使用寿命。

24模拟酶：模拟酶的生物催化功能，用化学半合成法或化学全合成法合成的人工酶催化剂称为模拟酶。

二问答题
1何谓酶活力？测定酶活力的原理？测定酶活力的方法?并简述这些方法的测定原理。

答：酶活力又叫酶活性，是指酶催化某一化学反应的能力，酶活力的大小可以用在一定条件下所催化的某一化学反应的速率来表示，两者呈线性关系。

测定酶活力就是测定酶促反应的速率。

酶催化的反应速率可用单位时间内底物的减少量或产物的增加量来表示，但在酶活力测定实验中底物往往是过量的，因此底物的减少量只占总量的极小部分，测定时不易准确，而相反产物从无到有，只要方法够灵敏，就可以准确测定，因此在实际测定中一般以测定产物的增加量为准。

产物生成量对反应时间作图，曲线的斜率表示该相应时间的反应速率，但随着时间延长由于底物浓度降低、产物对酶的抑制或激活等使酶促反应速率降低，这时的反应速率不能代表真实的酶活力，因此测定酶活力，应测定酶促反应的初速率。

测定酶活力的方法常用的有以下几类：
（1）分光光度法：主要利用底物和产物在紫外或可见光部分的光吸收的不同，选择一适当波长，测定反应过程中反应进行的情况，而且一些原来没有光吸收变化的酶反应也可以通过酶偶联分析法来进行测定。

（2）荧光法：主要根据底物或产物的荧光性质的差别来进行测定。

(3)同位素测定法：用放射性同位素的底物，经酶作用后所得到的产物，通过适当的分离，测定产物的脉冲数即可换算出酶的活力单位。

（4）电化学法：最常用的是玻璃电极，配合一高灵敏度的PH计，跟踪反应过程中H+变化的情况，用PH的变化来测定酶的反应速率;也可以用恒定PH测定法，在酶反应过程中，所引起的H+变化，用不断加入的碱或酸来保持其PH恒定，用加入的酸或碱的速率来表示反应速率。

此外还有一些测定酶活力的方法，如旋光法、量气法、量热法和层析法等。

2 温度，PH影响酶活力的机理是什么
答：.温度对酶活力的影响表现在两个方面，一方面是当温度刚升高时，与一般化学反应一样，反应速率加快，温度每升高10度，酶反应速率就为原来的2倍；另一方面由于酶是蛋白质，随着温度升高，使酶蛋白逐渐变性而失活，引起酶反应速率降低。

酶所表现的最适温度是这两种影响的综合结果。

PH影响酶活力的原因可能有以下几个方面：
（1）过酸或过碱可以使酶的空间结构破坏，引起酶构象的改变，酶活性丧失。

（2）当PH值改变不是很剧烈时，酶虽未变性，但活力受到影响。

PH影响了底物的解离状态，或者使底物不能与酶结
合，或者结合后不能生成产物；PH影响酶分子活性部位
上有关基因的解离，从而影响与底物的结合或翠花，是
酶活性降低;也可能影响到中间络合物ES的解离状态，不
利于催化生成产物。

（3）PH影响维持酶分子空间结构的有关基因解离，从而影响了酶活性部位的构象，进而影响酶的活性。

3何为酶活性部位？酶活性部位有何特点？研究酶活性的方法有哪些?说明其研究原理。

答：酶的特殊催化能力只局限在大分子的一定区域，也就是说，只有少数特异的氨基酸残基参与底物的结合或催化作用。

这些特异的氨基酸残基比较集中的区域，即与酶活力直接相关的区域，称为酶的活性部位或活性中心。

通常又将酶的活性部位分为结合部位和催化部位，前负责与底物的结合，决定酶的专一性；后者负责催化底物键的断裂形成新键，决定酶的催化能。

酶活性部位的特点：（1）活性部位在酶分子的总体中只占相当小的部分，通常只占整个酶分子体积的1%-2%。

（2）酶的活性部位是一个三维实体。

（3）酶的活性部位并不是和底物的形状正好互补的，而是在酶和底物结合的过程中，底物分子或酶分子，有时是两者的构象同时
发生了一定的变化后才互补的，这时催化基团的位置也正好在所催化底物键的断裂和即将生成键的适当位置。

这个动态的辨认过程称为诱导契合。

（4）酶的活性部位是位于酶分子表面的一个裂缝内。

底物分子（或一部分）结合到裂缝内并发生催化作用。

（5）底物通过次级键较弱的力结合到酶上。

酶与底物结合成ES复合物主要靠次级键：氢键、盐键、范德华力和疏水相互作用。

（6）酶活性部位具有柔性或可运动性。

研究酶活性部位的方法有以下几种：
（1）酶分子侧链基团的化学修饰法 A非特异性共价修饰某些化学试剂能和酶蛋白中氨基酸残基的侧链基团反应
而引起共价结合、氧化或还原等修饰反应，使基团的
结构和性质发生改变。

如果某基团修饰后不引起酶活
力的变化，可以初步认为，此基团可能是非必需基
团；反之如修饰后引起酶活力的降低或丧失，则此基
团可能是酶的必需基团。

B 特异性共价修饰某一种化
学试剂专一的修饰酶活性部位的某一氨基酸残基，使
酶失活。

通过水解分离标记的肽段，即可判断出被修
饰的酶活性部位的氨基酸残基。

C 亲和标记法人工合
成一些与底物结构相似的共价修饰剂，利用酶对底物
的特殊亲和力将酶加以修饰标记，称为亲和标记。

（2）动力学参数测定法活性部位氨基酸残基的解离状态和酶的活性直接相关，因此通过动力学方法求得有关参
数后，就可对酶的活性部位的化学性质作出判断。

从
pKm或logVmax相对PH的关系，可得到参与反应有关
的解离基团的pK值，便可i知道哪个氨基酸残基与酶活
性有关。

（3）X射线晶体结构分析法 X射线晶体结构分析法可以解析酶分子的三维结构，有助于了解酶活性部位氨基酸
残基所处的相对位置与实际状态，以及与活性部位有
关的其它基团。

（4）定点诱变法根据蛋白质结构研究的结果，可以利用
定点诱变技术，改变编码蛋白质基因的DNA顺序，研
究酶活性部位的必需氨基酸。

4使酶具有高催化效率的因素（即酶的催化机理）及作用机制。

答：影响酶高催化效率的有关因素讨论如下：
（1）底物和酶的邻近效应与定向效应酶和底物复合物的形成过程既是专一性的识别过程，更重要的是分子间反应变为分子内反应的过程，
在这一过程中包括两种效应：邻近效应和定向效应。

邻近效应是指酶与底物结合形成中间复合物以后，使底物和底物（如双分子反应）之间，酶的催化基团与底物之间结合与同一分子而使有效浓度得以极大的提高，从而使翻译速率大大增加的一种效应。

定向效应是指反应物的反应基团之间和酶的催化基团与底物的反应基团之间的正确取位产生的效应。

（2）底物的形变和诱导契合当酶遇到其专一性底物时，酶中的某些基团或离子可以使底物分子内敏感键中的某些基团的电子云密度增高或降低，产生电子张力，使敏感键的一端更加敏感，底物份子发生形变，底物比较接近它的过渡态，降低了反应活化能，使反应易于发生。

（3）酸碱催化是通过瞬时的向反应物提供质子或从反应物接受质子以稳定过渡态，加速反应的一类催化机制，可分为广义酸碱催化和狭义酸碱催化两种。

影响酸碱催化反应速率的因素有两个，及酸或碱的强度（pK值）及质子传递的速率。

（4）共价催化又称为亲核催化或亲电子催化，在催化时，亲核催化剂或亲电子催化剂能分别放出电子或汲取电子并作用于底物的缺电子中心或负电中心，迅速形成不稳定的共价中间复合物，降低反应活化能，使反应加速。

（5）金属离子催化金属离子通过3种主要途径参加催化过程：A 通过结合底物为反应定向；B 通过可逆地改变金属离子的氧化态调节氧化还原反应；C 通过静电稳定或屏蔽负电荷。

（6）催化和协同效应在酶催化反应中，常常是几个基元催化反应配合在一起共同起作用。

例如胰凝乳蛋白酶是通过Asp102、His57、Ser195组成的电荷中继网催化肽键水解，包括亲核催化和碱催化共同作用。

（7）活性部位微环境的影响在酶分子的表面有一个裂缝，而活性部位就位于疏水环境的裂缝里。

化学基团的反应活性和化学反应的速率在非极性介质与水性介质有显著差别。

当底物分子与酶的活性部位相结合，就被埋没在疏水环境中，这里底物分子与催化基团之间的作用力将比活性部位极性环境的作用力要强得多。

这一疏水的微环境大大有利于酶的催化作用。

5试述酶活性与一级结构和高级结构的关系。

答：
6酶的Km值有何意义及作用？如何求得Km？
答：Km称为米氏常数，它代表了当酶反应速率达到最大反应速率一半时的底物浓度，单位是mol/l,与底物浓度的单位一样。

Km值的意义（1）Km是酶的一个特征常熟，Km的大小只与酶的性质有关，而与酶浓度无关。

Km值随特定的底物、反应的温度、PH及
离子强度而改变。

故对某一酶促反应而言，在一定条件下都有特定的Km值，可用来鉴别酶。

（2）Km值可以判断酶的专一性和天然底物。

有的酶可作用于几种底物，因此就有几个Km值，其中Km值最小的底物称为该酶的最适底物也就是天然底物。

1/Km可近似的表示酶对底物亲和力的大小，1/Km 愈大，表明亲和力愈大，显然，最适底物时酶的亲和力最大，Km最小。

（3）当k3＜＜k2时，Km=k2/k1,即Km=Ks。

换言之ES的分解为反应的限制速率时，Km等于ES复合物的解离常数，可以作为酶和底物结合紧密程度的一个度量，表示酶和底物结合的亲和力大小。

（4）若已知某个酶的Km值，利用米氏方程V=(Vmax+
【S】)/(Km+【S】)就可以计算出某一底物浓度时，其反应速率相当于Vmax的百分率。

（5）Km值可以帮助推断某一代谢反应的方向和途径。

催化可逆反应的酶，对正逆两向底物的Km值往往是不同的，测定两边Km值的差别以及细胞内正逆两向底物的浓度，就可以大致推测该酶催化正逆两向反应的速率，这对了解该酶在细胞内的主要催化方向及生理功能有重要意义。

米氏常数可根据实验数据通过作图法直接求得。

其中最常用的是双倒数作图法，将米氏方程两侧取双倒数得到下面方程式
1/v=Km/Vma x·1/【S】+1/Vmax,以1/V对1/【S】作图，得出一直线。

其横轴截距为-1/Km,纵轴截距为1/Vmax。

7如何鉴定可逆抑制作用和不可逆抑制作用？
答：根据抑制剂与酶的作用方式及抑制作用是否可逆，可把抑制作用分为两大类，可逆抑制作用和不可逆抑制作用，有两种方法可供鉴别。

（1）物理法可逆抑制剂与酶以非共价键结合而引起酶活力降低或丧失，能用透析、超滤或凝胶过滤等物理方法除去抑制剂
而使酶复活；而不可逆抑制剂与酶的必需基团以共价键结合
而引起酶活力丧失，不能用透析、超滤等物理方法除去抑制
剂而使酶复活。

（2）动力学法在测定酶活力系统中加入一定量的抑制剂，然后测定不同酶浓度的反应初速率，以初速率对酶浓度作图。

在
测活系统中不加抑制剂时，初速率对酶浓度作图得到一条通
过原点的直线；A当测活系统中加入一定量的不可逆抑制剂
时，抑制剂使一定量的酶失活，只有加入的酶量大于不可逆
抑制剂的量时，才表现出酶活力，不可逆抑制剂的作用相当
于把原点向右移动；在测活系统中加入一定量的可逆抑制剂
后，由于抑制剂的量是恒定的，因此得到一条通过原点，但
斜率较低于无抑制剂的直线。

B如果在不同抑制剂浓度下，
每一个抑制剂浓度都作一条初速度和酶浓度关系曲线，不可
逆抑制剂可以得到一组不通过原点的平行线，而可逆抑制剂
得到一组通过原点但斜率不同的直线。

这样可逆抑制作用和
不可逆抑制作用从图上就可清楚区分开来。

图见王镜岩生化
P370。

8试述酶的抑制作用类型、特点及抑制原理。

答：根据抑制剂与酶的作用方式及抑制作用是否可逆，可把抑制作用分为两大类，可逆抑制作用和不可逆抑制作用。

1 不可逆抑制作用抑制剂与酶的必需基团以共价键结合而引起酶活力丧失，不能用透析、超滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活。

2 可逆抑制作用抑制剂与酶以非共价键结合而引起酶活力降低或丧失，能用透析、超滤或凝胶过滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活。

根据可逆抑制剂与底物的关系，可逆抑制作用分为3类：
A 竞争性抑制剂大多数竞争性抑制剂I的结构与底物I结构类似，因此能与酶E的活性部位结合，与酶形成可逆的EI复合物，但EI不能分解形成P,影响了底物与酶的正常结合，酶反应速率降低。

其抑制程度取决于底物与抑制剂的相对浓度，这种抑制作用可通过增加底物浓度而解除。

米氏方程中Vmax不变Km增加。

B 非竞争性抑制剂酶与抑制剂结合后，还可以与底物结合，酶与底物结合后，还可以与抑制剂结合，但中间的三元复合物不能进一步分解为产物，因此酶活力降低。

抑制剂与酶活性部位以外的基团相结合，其结构与底物无共同之处，两者没有竞争作用，这种抑制作用不能用增加底物浓度来解除。

Vma x↘K m不变。

C 反竞争性抑制酶只有与底物结合后，才能与抑制剂结合，但三元中间物不能分解为产物因此反应速率降低。

抑制剂与底物分子结构不同，抑制剂只与ES复合物结合，抑制程度取决于抑制剂I和ES两者的浓度。

Vma x↘K m↘。

9细胞内酶活性调节和控制的方式有哪些？
答：细胞内酶活性调节和控制方式有多种，主要有：
1）调节酶的浓度主要有两种方式：一种是诱导或抑制酶的合成；一种是调节酶的讲解。

2）通过激素调节酶活性激素通过与细胞膜或细胞内受体相结合而引起一系列生物学效应，以此来调节酶活性。

3）反馈抑制调节酶活性许多小分子物质的合成是由一连串的反应组成的，催化此物质生成的第一步的酶，往往被它们终
端产物一直，这种抑制叫反馈抑制。

4）抑制剂和激活剂对酶活性的调节酶受大分子抑制剂或小分子物质（如一些反应产物）抑制，从而影响酶的活性。

5）别构调控酶分子的非催化部位与某些化合物可逆的非共价结合后发生构象的改变，进而改变酶活性状态，有些别构剂
可使酶活性增加，有些可使酶活性降低。

6）酶原的激活体内合成的蛋白质，有时不具有生物活性，经过蛋白水解酶专一用后，构象发生改变，形成酶的活性部
位，变成活性酶。

这种调控作用的特点是由无活性状态转变
为活性状态是不可逆的，通过专一性的蛋白水解作用来活化
酶和蛋白质，在生物体系中是经常发生的。

7）可逆的共价修饰这种调控作用是通过公家修饰酶进行的。

共价调节酶通过其它酶对其多肽链上某些基团进行可逆的共
价修饰，使处于活性与非活性的互变状态，从而调节酶活
性。

8）同工酶同工酶不仅存在与同一个体的不同组织中，甚至同一组织、同一细胞的不同亚结构中。

10变构酶的特点有哪些？
答：1）别构酶一般都是寡聚酶，通过次级键由多亚基构成。

在其上，有分别负责结合和催化底物的活性中心，，也有和调节物（效应物）结合的调节中心（别构中心）。

在同粗别构酶中活性部位和调节部位是相同的。

2）别构酶的动力学：因别构酶有协同效应，故其V-【S】的动力学曲线不是双曲线，而是S形曲线（正协同）或表观双曲线（负协同），两者均不符合米氏方程。

3）凡是改变底物的K0.5而不改变反应Vmax的效应物成为K型效应物。

凡是改变Vmax而不改变底物K0.5的效应物称为V型效应物。

4）别构酶经加热或用化学试剂等处理后，可引起别构酶解离，失去调节活性，称为脱敏反应，脱敏后的酶表现为米氏酶的动力双曲线。

1蛋白质的盐溶：在低浓度的中性盐溶液中，大多数蛋白质的溶解度增加，这种现象成为盐溶作用。

盐溶作用主要是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间的相互作用却加强，因而溶解度增高。

盐析：向蛋白质溶液中加入大量的中性盐类，如硫酸铵，蛋白质的溶解度逐渐下降以致从溶液中沉淀出来，这称为盐析作用。

主要是由于大量中性盐的加入，使水分子的活度降低，原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水，导致蛋白质水合程度减少，从而使蛋白。