抗心磷脂抗体检测和抗磷脂抗体综合征诊断

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谢飞　朱忠勇
磷脂是指分子中含有醇,脂肪酸和磷酸基团的一类化合物。

人体内的磷脂主要是含有甘油醇的甘油磷脂,包括心磷脂,磷脂酰丝氨酸,磷脂酰胆固醇,磷脂酰乙醇胺等。

抗磷脂抗体(antiphospholipid antibody,aP L)是一族针对带负电荷磷脂或带负电荷磷脂与蛋白复合物的异质性抗体。

抗磷脂抗体综合征(antiphospholipid syndrome,APS),是一组与抗磷脂抗体有关的自身免疫性疾病,典型的临床表现有动脉血栓,静脉血栓以及妊娠丢失。

APS患者血中检出aP L是确立APS诊断的必要条件。

根据一些aP L可以识别磷脂或磷脂与蛋白复合物的特性,采用心磷脂包被微孔板,建立E LIS A检测方法,所检测的aP L称为抗心磷脂抗体(anticardiolipin,aC L)。

此外,一些aP L在体外可以使磷脂依赖的凝血试验时间延长,故亦可采用凝固法检测,所检测的aP L称为狼疮抗凝物(lupus anticoagulant,LA)。

近年来,国外对aP L和APS的研究甚多,其检测方法也逐步规范化。

现主要就抗心磷脂抗体检测的最新进展作一综述。

一、历史回顾
1952年,C onley和Hartmann发现部分系统性红斑狼疮(S LE)患者血中存在一种能使凝血活酶时间(PTT)延长的物质,当时命名为狼疮抗凝物(LA)。

此后不久,人们认识到LA 实际上是一种可以与磷脂结合的自身抗体。

LA阳性患者中约有20%～25%可出现梅毒试验假阳性(BFP2STS),已知梅毒试验检测的抗体是可以与心磷脂结合的。

检测LA的磷脂依赖性试验,干扰因素甚多,不易标准化,重复性和敏感性较差。

1983年Harris等以心磷脂为抗原,首先采用固相免疫分析方法(放射免疫测定)检测血中的LA活性,并将所检测的抗体称为aC L,其敏感性高于以往的LA试验。

此后,Harris 等还发现aC L还可与磷脂酰丝氨酸(PS)等其他带负电荷的磷脂结合,因此,采用外延更广的名称—抗磷脂抗体(aP L),将aC L和LA都包括在内,而与抗磷脂抗体有关的疾病则统称为抗磷脂抗体综合征(APS)[1]。

aC L测定方法也从最早的放射免疫测定法,经不断改进,成为现在应用最广的经典aC L E LIS A法。

二、抗磷脂抗体与抗磷脂抗体综合征
典型的APS临床表现为动脉血栓,静脉血栓和妊娠丢失。

其他较少见的有血小板减少,溶血性贫血,短暂性脑缺血发作,多发性硬化样综合征,偏头痛,水痘,网状青斑,心瓣膜损害,暴发性APS(catastrophic APS)等。

大规模的病例对照研究结果表明,β2G P1依赖性的IgG aC L升高与缺血性卒中和心肌梗死显著相关,aC L阳性者发生缺血性卒中的风险是aC L阴性者的4倍[2,3]。

另一方面,文献分析显示,存在aC L 将使静脉血栓性疾病发生几率增加约2倍[4]。

前瞻性研究结果也提示,aC L效价升高不仅是中风的独立危险因素,而且还与认知障碍有关[5]。

近年的2个报道还表明,患者移植前存在aP L是肾移植失败的危险因素,对移植前aP L阳性患者进行早期抗凝干预将有助于提高肾移植的成功率[6,7]。

多项调查结果显示,近20%习惯性流产患者aC L阳性,正常分娩产妇只有不到2%检出aC L,而与APS有关的习惯性流产复发几率高达90%[8]。

1998年,第八次国际抗磷脂抗体讨论会在日本札幌召开,会后发布了抗磷脂抗体综合征的初步划分标准[9]。

该标准只列出了APS的典型表现,分为临床和实验室2部分,每部分各符合一项以上标准的可以确立APS的诊断。

临床标准包括:一次或多次的动脉、静脉或小血管血栓,除了表浅静脉血栓外,所有的血栓必须经影像学,多普勒或组织病理学检查证实,组织病理学检查时,血管壁上不应存在显著的炎症表现;在第10周或10周后,一次或多次形态学正常的胎儿出现无法解释的死亡,胎儿形态正常应用超声检查或直接检查胎儿证实;第34周或34周前发生的一次或多次与严重先兆子痫、严重子痫或严重胎盘功能不全有关的形态学正常的新生儿早产;第10周前发生的连续3次或更多次的无法解释的自然流产,应排除母方解剖学和激素方面的异常,以及父母双方的染色体异常。

实验室标准包括:采用标准化的测定β2糖蛋白1(β2G P1)依赖性的aC L E LIS A,2次或更多次(每次间隔至少6周)检出中或高滴度的IgG和/或IgM aC L;依次根据以下ISTH指导文件(1995)中所规定的步骤和方法,2次或更多次(每次间隔至少6周)在血浆中检出LA:(1)磷脂依赖性的凝血过筛试验延长,如APTT、K CT、dRVVT、稀释的PT和T axtarin time;(2)与乏血小板正常血浆混合无法纠正以上延长的时间;(3)补充外源磷脂可以缩短或纠正以上延长的时间;(4)排除其他的凝血系统异常,如存在因子VIII 抑制物或肝素。

鉴于血栓和流产复发的高风险以及aP L试验结果对临床治疗的指导意义,英国血液学会在其2000年发布的抗磷脂抗体综合征诊疗指南中,建议扩大筛查的范围:S LE、低龄(如<50岁)卒中或外周动脉栓塞患者,连续3次或3次以上的妊娠丢失患者皆应该检测aP L;无明显原因的静脉血栓患者,以及虽存在其他危险因素但静脉血栓反复发作的患者,
作者单位:350025福州,解放军医学检验中心
无吸烟史、高血压、糖尿病或高脂血症等危险因素的年龄较大的动脉栓塞患者,只有过2次流产史或者有过3次或3次以上不连续流产史的患者,孕中/晚期内正常形态胎儿不明原因死亡的患者,怀疑APS的早期严重先兆子　或严重胎盘功能不全患者均可考虑进行aP L检测[10]。

三、抗心磷脂抗体的检测
1.检测原理:当前,检测aC L多采用E LIS A法。

早期研究人员即发现,aC L E LIS A采用牛血清作为封闭液和稀释液时,可以更好地诊断APS,这个谜团直到1990年才解开。

这一年,多个研究小组同时发现,APS患者的aC L与心磷脂的结合需要血清中一种磷脂结合蛋白2β2糖蛋白1(β2G P1)参与,而牛血清中恰恰含有β2G P1[1]。

Matsuura还发现,自身免
疫性疾病(如S LE)aC L与包被心磷脂的结合可以因β2G P1的存在而增强,即称其为β2G P1依赖性aC L;相反,梅毒患者血清中的aC L与心磷脂的结合却可被β2G P1抑制,因此又将这些aC L称为非β2G P1依赖性aC L[11]。

目前认为APS与β2G P1依赖性aC L有关,而与非β2G P1依赖性aC L无关。

根据这些发现,一些研究者在心磷脂包被抗原和/或稀释液/包被液中添加外源β2G P1,以提高aC LE LIS A诊断的特异性和敏感性。

经典的aC LE LIS A所采用的试剂以及所检测的血清标本中含有β2G P1,因而可检测β2G P1依赖性的aC L。

β
2
G P1、磷脂及aC L之间的关系目前存在3种假说:一种可能是β2G P1与磷脂结合后,发生构象改变,暴露出隐藏(aC L识别)的抗原表位;另一种可能是aC L本身亲和力较低,β2G P1或其他aC L靶蛋白与带负电荷表面(如心磷脂等带负电荷磷脂或一些E LIS A板)结合后,使得抗原位点浓集,促进aC L与高密度靶抗原稳定结合;还有一种解释是,包被的心磷脂暴露空气后迅速氧化,其降解产物与蛋白(BS A和
β
2
G P1等)交联形成了新的表位,而部分aC L则是由磷脂氧化降解产物与蛋白交联后形成的新抗原表位诱导产生的。

这些假说都有实验证据支持,相互之间并不完全排斥,这可能反映了aC L的异质性[10,12]。

2.aC L E LIS A标准化:自aC L E LIS A问世以来,许多实验室和厂商根据该原理创立了自己的方法。

多数方法都在经典方法的基础上进行了各种改良,试剂和微孔板的选用往往各不相同,这使得各实验室测定结果很难相互比较。

1995年发表的1份多中心调查报告显示,市售的aC LE LIS A试剂盒IgG aC L和IgM aC L测定的符合率分别只有59%和51%[13]。

最近,由24个欧洲实验室参与的多中心调查中,只有6个实验室10个血清样品IgG aC L测定值相互间完全一致[14]。

这表明,aC L E LIS A方法亟待标准化。

aC LE LIS A标准化工作,始于1986年的第一次国际aC L 标准化讨论会,到目前为止,已举行4次。

在第一次会议上, Harris博士提出的G P L(G phospholipid units)和MP L(M phospholipid units)分别被确定作为IgG aC L和IgM aC L的定量单位。

同时,Harris博士实验室制备的标准品被分发至各实验室,以协助建立aC L测定方法。

第二次aC L国际标准化讨论会则确定采用Harris博士提出的aC L半定量表示方法,即根据aC L测定绝对值,将aC L划分为强、中度、弱阳性和阴性4个档次,这样可以使各实验室之间的测定结果具有较好的一致性[1]。

目前Harris博士所在实验室制备的aC L E LIS A标准品(Harris′s standard,哈氏标准品)已经被世界范围内的绝大多数实验室和试剂生产商所采用,成为aC L E LIS A的“金标准”。

在一次多中心问卷调查中,30个欧洲中心实验室中有26个采用哈氏标准[13]。

目前国内市场上已经有该标准品出售。

但是,有一些试剂盒和实验室采用(对哈氏标准品定标的)二级乃至多级标准品,或者采用其他标准品,导致其标准曲线的斜率和哈氏标准品显著不同,这是实验室间结果不一致的重要因素之一。

尽管4次国际aC L标准化讨论会工作卓有成效,但目前相关的官方机构(如世界卫生组织和美国疾病防治中心等)还没有推出aC LE LIS A标准。

美国及欧洲的一些组织目前正在进行有关的工作,如美国病理医师学会(C AP)要求美国国内实验室参加aC L测定室间质控,作为实验室认证依据。

由欧洲13个国家的实验室参与的“欧洲抗磷脂抗体论坛”,正委托T incani教授牵头实施aC LE LIS A标准化工作。

我们认为,在权威标准出台前,有关a心磷脂和aC L E LIS A的研究报道,应在文中详细描述aC L E LIS A技术细节,包括微孔板,包被抗原,缓冲液,封闭液,外源添加物等,以使不同的研究结果之间具有可比较性。

同时,我国国内aC L E LIS A的标准化工作也应该尽早开始,以纠正目前国内aC L E LIS A应用和研究的混乱局面。

3.磷脂aC L EIS A的替代试验:经典aC L E LIS A方法的敏感性较高,但特异性较差,正常人、感染性疾病(如梅毒,Q热和AI DS)患者和一些药物(如氯丙嗪)使用者偶可检出aC L。

近年来,研究人员采用磷脂酰丝氨酸,带负电荷磷脂复合物或β2G P1作为包被抗原以替代传统的心磷脂。

这些新方法中,特异性和敏感性都较好的有以混合磷脂为包被抗原的APh L E LIS A试剂盒,采用流式细胞术同时测定aC L和抗PS 抗体的aC L/aPS FACS 试剂盒和抗β2G P1抗体测定法。

前二者均由Harris博士所在Louisville AP L诊断公司开发,并获FDA批准用于体外诊断。

1996年9月,第4次aC L国际标准化讨论会对这些新方法和经典aC LE LIS A法的诊断效能进行了比较。

结果发现,所比较的方法均有较高的敏感性(90%～100%),但特异性则相差较大。

APh L E LIS A试剂盒特异性可达100%,抗β2G P1抗体测定试剂盒和aC L/aPS FACS 次之,而经典aC LE LIS A法则特异性较差[15]。

Merkel等对438个结缔组织病患者,33个APS患者和200个正常人分别采用经典aC L E LIS A法和APh L E LIS A两种方法进行检测,结果发现,APh L 敏感性和特异性分别为9019%和9915%[16]。

Abreu等对54个APS患者和184个非APS患者进行了检测,经典aC L E LIS A法、抗β2G P1抗体和APh L E LIS A3种方法的敏感性和特异性分别为,100%/60%,74%/82%和98%/ 9919%[17]。

在另一个比较研究中,APh L E LIS A的特异性为
9613%,显著高于经典aC LE LIS A 法(73%)和抗β2G P1抗体(70%)[18]。

这些都表明APh L E LIS A 是一种特异性和敏感性
均较好的APS 诊断试剂盒,可以代替aC LE LIS A 用于APS 的一线筛查[18]。

四、抗磷脂抗体综合征实验室诊断策略
多数APS 患者aC L 和LA 同时阳性,但仍有10%～16%的APS 患者只检出LA ,另有25%只有a 心磷脂阳性[1]。

1999年发布的APS 初步划分标准(札幌标准),确定将aC LE LIS A 和LA 测定作为aP L 的检测试验[9]。

根据该标准,
如果患者有APS 典型症状,且LA 阳性或者IgG aC L 中度/强阳性,可确立APS 的诊断。

但在更多情况下,APS 的界定相当困难,例如:患者APS 临床表现典型,但aC L 弱阳性或LA 阴性;或者患者的临床表现不典型,如血小板减少,网状青斑,但LA 或aC L 阳性。

此时,采用APh L E LIS A 和抗β2G P1抗体将有助于APS 的正确诊断。

最近,Harris 博士和Pierangeli 博士针对临床表现提示APS 的情况,推荐采用以下实验室诊断策略(图1)[18]。

图1　APS 实验室诊断策略(Harris 博士惠许引用)
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(收稿日期:2002205209)
(本文编辑:张莉)。