两种肠道腺病毒基因型分型标本处理方法的比较
肠道腺病毒
➢结构
纤维状刺突 (antennal fiber,or fiber)：纤突对哺乳类动物的细胞有毒 性作用，腺病毒具有血凝性。
生物学性状
➢培养特性：
人类腺病毒无敏感动物，也不能在鸡胚中生长。 但能在来源于人的多种细胞培养中增殖，引起明 显CPE：细胞肿胀变圆、集聚成葡萄串状，并可 在感染的细胞核内形成嗜碱性包涵体。
致病性和免疫性
对宿主防御的逃逸
因为腺病毒复制缓慢，感染细胞容易受 到宿主防御系统的攻击，因此腺病毒有 1/4的基因组用来对付宿主的防御系统。
通过释放两种E1B蛋白来抑制细胞的凋亡， 使受感染的细胞能支持到病毒完成复制。
感染后期病毒复制组装完成时，腺病毒 产生病毒死亡蛋白给细胞致命一击彻底 释放病毒。
目前，把人腺病毒的41个血清型分为A-F 6个组：普通腺病毒；
F组（40和41型）：是从粪便中发现，用常规 细胞培养不能增殖的腺病毒，仅在选择性细 胞上生长，称为肠道腺病毒。
肠道感染病毒
主要包括肠道病毒和急性胃肠炎病毒
肠道病毒 (小RNA病毒科) 轮状病毒 肠道腺病毒 呼肠病毒科 杯状病毒 星状病毒
抵抗力
腺病毒对理化因素的抵抗力较强，耐酸 并能耐受蛋白酶及胆汁的作用。在室温 中可存活10d以上，56℃30min灭活。
➢病毒的复制
腺病毒的复制与细胞复制的两大区别 两条链的复制都是一个连续过程 腺病毒的DNA复制，不需要等待RNA引物，
DNA的复制可以从任何一端开始。
腺病毒的复制
细胞复制
➢结构
衣壳：20面体立体对称，由252个颗粒组 成,6邻体 (hexon),5邻体 (penton)。6 邻体是形成病毒衣壳20个三角形面的主 要蛋白，12个顶端是5个五邻体亚单位和 3个纤毛蛋白构成的复合物，12根纤毛以 五邻体蛋白为基底由衣壳表面伸出，纤 毛顶端形成头节区（knob）。五邻体和 纤毛的头节区可与细胞表面的病毒受体 结合
腺病毒的分子进化和流行病学
腺病毒的分子进化和流行病学腺病毒是一类广泛存在于人类、动物和植物中的病毒，由于其感染力强、传播性广、病程短暂等特点，腺病毒感染在医学和公共卫生领域一直备受关注。
本文将重点探讨腺病毒的分子进化和流行病学，以期对该病毒的防治和治疗提供一定的参考。
一、腺病毒的分子进化腺病毒是一类非包膜RNA病毒，其基因组由单股线性的RNA组成。
腺病毒包含7个不同的基因型，分别为A、B、C、D、E、F、G型。
其中，A、B、C、D型是人类最主要的腺病毒感染病原体，而E、F、G型则主要感染动物。
腺病毒的分子进化主要通过基因重组和点突变进行。
在基因重组方面，腺病毒的基因组非常灵活，可以轻松地进行基因重组以适应环境的改变。
例如，在病毒的品系亚型之间，可能会发生基因重排的现象，使得该病毒产生了新的基因型。
同时，腺病毒还可以通过点突变来适应环境的压力。
研究表明，腺病毒的基因型随着时间的推移，会发生一定的点突变，使得其在基因组上发生变化，对宿主的感染能力也发生变化。
二、腺病毒的流行病学腺病毒的流行病学研究要从其宿主和传播方式入手。
腺病毒在人类的感染很普遍，感染的方式有很多，可以通过空气、水、食物等多种方式传播。
腺病毒的感染主要分为肠道感染和呼吸道感染两种类型。
其中，肠道感染主要通过食物、饮水等途径传播，呼吸道感染则主要通过空气传播。
此外，腺病毒还可以在动物中传播，不同基因组的腺病毒可以感染不同类别、不同物种的动物，包括人类、猕猴、类人猿、啮齿类动物、鸟类等。
人类除了是腺病毒的主要宿主之一，还是许多病毒接种计划的接种对象。
总之，腺病毒的流行病学研究是极其重要的，不仅可以对腺病毒的防治起到积极的作用，还能通过对研究不同基因型、传播途径、病毒定量等方面的数据进行综合分析，探究腺病毒分子进化的规律及趋势。
三、腺病毒的防治及治疗腺病毒的防治和治疗是一个复杂的过程，需要通过多种方法来进行。
首先，要加强环境卫生和个人卫生，防止腺病毒的传播。
其次，针对不同基因型的腺病毒，可以开发不同类型的疫苗进行防治。
腺病毒与腺相关病毒的区别
腺病毒与腺相关病毒的区别腺病毒和腺相关病毒（AAV）是用于基因传递的两种不同类型的病毒载体。
这两个重组病毒系统都具有感染广泛宿主的能力，包括分裂和非分裂细胞，而无需与宿主基因组整合。
两者之间的主要区别包括：包装能力、水平，基因表达的起效和持续时间以及免疫应答。
腺病毒有约8.5千碱基的容量，具有高水平的蛋白质表达和瞬时基因表达。
表达的发作时间可早于感染后16-24小时。
腺病毒系统的局限性主要在于靶细胞的高免疫应答。
AAV的包装容量约为4.5千碱基，蛋白质表达水平相对较低，有长效基因表达的潜力。
腺病毒腺病毒有约8.5千碱基的容量，具有高水平的蛋白质表达和瞬时基因表达。
表达的发作时间可早于感染后16-24小时。
腺病毒系统的局限性主要在于靶细胞的高免疫应答。
尽管如此，由于它们对大多数组织有高效转导作用，仍被广泛用于研究中。
腺病毒不能整合至宿主基因组，仅能瞬时表达。
它可以对分裂期及非分裂期细胞进行感染。
其包装片段至多8 kb，浓缩滴度至多为1011-1012TU/mL，片段越大，滴度越低，表达水平还是比较高的。
腺病毒优势宿主范围广：能够感染分裂期细胞与静止期细胞；对上皮细胞有高度嗜性，尤其适用于感染原代细胞、悬浮细胞等难转染细胞类型感染效率高：优于其他病毒载体和转染系统的高感染能力，能达到近100%的效率包装容量大：最高可插入7.5 kb的外源片段表达水平高：1-2d即开始高水平表达安全系数高：去除病毒蛋白编码序列，降低细胞毒性和免疫反应；双质粒转染系统，生物安全性高无整合风险：无插入致突变性腺相关病毒AAV的包装容量约为4.5千碱基，蛋白质表达水平相对较低，有长效基因表达的潜力。
AAV的趋向性也可以通过不同的血清型增强。
AAV的主要缺点是其对目的基因的包装容量较小，并且表达起效较晚（体外2-7天，体内3-21天），然而，该传递系统所产生的免疫应答水平却非常低。
腺相关病毒可以稳定整合至宿主基因组，并且可以在特定基因产物存在的条件下整合至人类19号染色体中的特定位点。
肠道腺病毒ADVF
*肠道腺病毒核酸检测试剂盒(PCR-荧
光探针法)
*肠道腺病毒和星状病毒二重核酸检
测试剂盒(PCR-荧光探针法) FAM+ROX
A-E组:普通腺病毒。 F组（40型和41型）：肠道腺病毒 DeJong用限制性内切酶分析ADVF，发现其有两种不同电泳图 谱，名为Ad40及Ad41
呈规则的20面体结构，直径约80-110nm。衣壳含有 240个六联体（hexon）、12个五联体（penton）及 12根纤毛（fiber），除此之外还有其他一些小蛋白， 如VI、VIII、IX、IIIa和IVa2等。
1、基因及功能 Ｅ1区蛋白(甚至包括Ｅ2区蛋白)是基因组复制、 病毒包装和其他蛋白表达翻译所必需的,但其对 细胞的毒性也是很强的。
E2蛋白涉及DNA复制
E3蛋白对抗宿主的抗病毒防御系统
E4调节有效的晚期基因转录。
2、转录与复制
病毒基因组进入细胞核后，细胞转录因子首先与E1a 区上游的增强子结合，表达E1a蛋白，该蛋白的作用 是调节细胞代谢，使病毒DNA更易于在细胞中复制。 E1a蛋白还可以激活其他早期基因（E1b、E2a、E2b、 E3和E4）的启动子，其中E2b驱动另外三个与病毒复 制有关的早期基因转录单位末端蛋白前体、单链DNA 结合蛋白以及DNA聚合酶的表达，这三个基因的表达
血清学检测：抗血清价格昂贵、分型技术繁琐、 易出现假阴性结果等弊端。
已报道检测肠道腺病毒的方法有直接免疫荧光法、 PCR和限制性核酸内切酶技术及其组合检测等
Байду номын сангаас
（二）预治
预防传播的关键措施是洗手，洗手可以 避免接触被腺病毒污染的物品而传播；免饮 生水，可以防止腺病毒污染水体而扩散。
是自限性疾病，病情不重，一般可自愈。 主要是对症治疗及必要的支持疗法。有轻度 失水可口服补液，中或重度失水宜静脉补液。
腺病毒
生活周期
腺病毒的生活周期可以分为两个截然不同却又不能割裂开来的两个阶段。第一阶段包括腺病毒颗粒粘附和进 入宿主细胞，将基因组释放到宿主细胞核中，以及有选择性地转录和翻译早期基因。在这个阶段，细胞为病毒基 因组复制和腺病毒晚期基因表达并最终释放成熟的感染颗粒，即第二阶段，作好了准备。第一阶段将在6~8个小 时内完成，第二阶段则更快，只需4~6个小时。
分类
分类及自上个世纪50年代发现并成功分离腺病毒以来，已陆续发现了100余个血清型，其中人腺病毒有52种， 分为A、B、C、D、E和F六个亚群（subgroup）。基因治疗常用的人的2型及5型腺病毒在血清学分类上均属C亚群， 在DNA序列上有95%的同源性。二者的增殖能力非常强，滴度通常可以达到109pfu (plaque forming unit)/ml， 其在单个细胞中的基因组拷贝数可达104（约占细胞总DNA的10%）。病毒颗粒比较稳定，通过CsCl梯度离心可以 达到1010~1011pfu/ml，满足动物实验的要求。
防治原则
腺病毒的甲醛灭活疫苗已被用于某些人群的预防，而且将来有被用人二倍体细胞培养的减毒活疫苗所替代的 可能。但因腺病毒对动物具有致癌作用，人们对全病毒疫苗的作用与安全性存有疑虑。此外加强游泳池和浴池水 的消毒，可使水传播性结膜炎爆发的危险性降至最小，在作眼的检查时应严格无菌操作，对所用设备充分灭菌， 也可控制流行性结膜炎的发生。对腺病毒感染的治疗仍无有效药物。
许多腺病毒在肠道细胞中复制，随粪便排出，但大多血清型与胃肠道疾病无关。而40型和41型腺病毒可引起 婴幼儿与年少（4岁以下）儿童的胃肠炎，致腹痛、腹泻。C组腺病毒能引起某些婴幼儿肠套叠。
腺病毒11、12型能引起儿童急性出血性膀胱炎，尿中出现病毒。37型可引起女性宫颈炎和男性尿道炎，常由 性传播感染。在免疫功能低下者可引起偶发或严重的病毒感染，尤其在器官移植病人中发生严重呼吸道感染和病 毒性肝炎，多由1、5和7型腺病毒引起。艾滋病患者可感染多种血清型腺病毒，并能出现抗原性介于中间的杂合 型毒株，而且常为致死性腺病毒感染。主要原因是腺病毒的E1A蛋白可反式激活HIV的转录，加速HIV的复制。临 床发现37%的艾滋病患者病毒性腹泻是由腺病毒所致。
【超实用干货】好结果离不开正确取样：医学方向各类微生态样本取样方法大全
【超实用干货】好结果离不开正确取样：医学方向各类微生态样本取样方法大全目的是为了能让大家更好的认识肠道菌群对人体健康的重要性和关注自身的肠道菌群营养健康。
既然肠道菌群如此重要，那我们就得更加全面准确的去认识它了解它弄清它作用机制，要达到客观准确的结果，前提首先得有个高质量的样品，所以取样是大家普遍关心的问题。
今天，给大家准备了医学类微生态样本的取样方法，超实用干货！取样前准备工作1、提前完善好实验设计和方案我们研究什么方向（疾病人群VS健康人群肠道菌群差异；干预方案前后肠道菌群变化和症状关联；不同疾病亚型之间肠道菌群差异；时间轴研究等；或者以上几个方向都包含）？取样对象（人还是动物）？取什么样（粪便or组织or唾液or皮肤等）？要达到什么目的（找到疾病关联生物标志物；找到有效的疾病干预方案；找到新的治疗靶点；不同时期微生物动态变化等）？对照样本选择（非常重要，不多说）？最后确定下来取样策略（确定了就一定要持之以恒的做下去，到最后一定会有意想不到的惊喜与收获）2、收集临床或环境指标特别是做临床研究一定要收集临床指标，这样最后再进行关联分析的时候才能对结果进行更准确的解释3、提前收集多份样本进行备份，分阶段逐步深入研究比如我们先进行菌群多样性研究，找到一些差异菌群后，我们想进一步了解它们的基因功能和相关代谢通路，那我们就要选多样性研究好的几个样本进行宏基因组测序，甚至其他组学研究（代谢组学、宏转录组、宏蛋白组）。
所以样本需根据自己的研究内容进行备份，以备不时之需。
4、取样器材准备做临床16S多样性测序和宏基因组测序的样本可以用专业的采样盒进行采样保存（实验室可提供），采样盒方法主要是为了方便临床研究开展和受试者取样；除了采样盒也可以采用常规方法取样，只是对于临床研究开展起来会很麻烦不太可能实现；微生物代谢组学研究须使用常规采样方法。
采样盒取样很简单方便在此就不进行介绍（放个图），接下来主要介绍常规取样方法。
腺病毒55型对人肠道细胞感染性的实验研究
四川大学学报（医学版）2021，52 ( 2 ) : 202 - 206J Sichuan Univ ( Med Sci) doi: 10.12182/20210160506腺病毒55型对人肠道细胞感染性的实验研究+何怡藉〃，王文博3,胡宗海2,熊杰2,刘媛2A1.成都中医药大学医学技术学院（成都611137);2.西部战区总医院检验科（成都610083);3.西部战区疾病预防控制中心（成都610021 >【摘要】目的明确腺病毒55型(HAdV-55)对人肠道细胞的感染性。
方法体外培养人结直肠腺癌细胞Caco-2,以HAdV-3、7、14和55感染，免疫荧光法检测感染细胞内病毒蛋白的表达，荧光定量PCR方法检测不同时间点细胞内和上清 中病毒DNA水平，采用腺病毒敏感细胞株HEp-2感染实验检测Caco-2细胞上清中感染性病毒颗粒水平。
结果免疫荧光 检测结果显示，感染48h后，Caco-2细胞内HAdV-55病毒蛋白表达为阳性。
HAdV-3、7、14、55在Caco-2细胞内均能持续复 制和增殖，感染细胞内和上清中病毒DNA水平随感染时间的增加而升高，并且HAdV-55病毒DNA水平明显高于HAdV-3、7和14型。
Caco-2上清中HAdV-55感染性病毒颗粒高于HAdV-3、7和14,差异有统计学意义(P<0.05)。
采用低剂量病毒 〔lx半数组织培养感染剂量(TCID,。
)〕感染Caco-2细胞,HAdV-55感染孔细胞病变效应(CPE)比HAdV-3、7和14感染孔细胞 显著。
结论人呼吸道病毒HAdV-55对肠道细胞易感，感染水平高于其他常见的呼吸道感染腺病毒3、7和14型。
【关键词】呼吸道病毒腺病毒55型肠道细胞感染性致细胞病变效应Infectivity of Human Adenovirus Type 55 to Human Intestinal Cells HE Yi-bei1'2, WANG Wen-bo3, HUZong-hai2t XIONG Jie2, LIU Yuan2A.1. College of M edical Technology, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China; 2. Department of Clinical Laboratory, the General Hospital of Western Theater Command, Chengdu 610083, China; 3. Center f or Disease Control and Prevention of Western Theater Command, Chengdu 610021, ChinaA Correspondingauthor,E-mail:*********************【Abstract】Objective To examine the infectivity of human adenovirus type 55 (HAdV-55) in human intestinal cells. Methods Caco-2 cells were cultured in vitro,and infected with HAdV-3, 7, 14 and 55. The expression of viral proteins in infected cells was detected with immunofluorescence method. The intracellular and supernatant viral DNA levels were determined with fluorescent quantitative PCR at different points of time. The level of infectious virus particles in the supernatant of Caco-2 cells was determined with adenovirus sensitive HEp-2 infection assay.Results Immunofluorescence assay showed positive result for the expression of HAdV-55 virus protein in Caco-2 cells48 h post infection. HAdV-3, 7, 14, and 55 showed sustained replication and proliferation in Caco-2 cells. The level ofviral DNA in infected cells and the supernatant increased with the infection time, and the viral DNA level of HAdV-55 was significantly higher than those of HAdV-3, 7 and 14. The infectious virus particles of HAdV-55 in Caco-2 supernatant were more than those of HAdV-3, 7 and 14, showing statistically significant difference (P<0.05). Caco-2 cells were infected with low doses of virus (1x TCID5〇), and the cytopathic effect (CPE) of HAdV-55 infection wells was more significant than that of HAdV-3, 7 and 14 infection wells. Conclusion This study found that human intestinal cells were susceptible to HAdV-55, and the infection level was higher than that of other common respiratory infections caused by adenovirus types 3, 7 and 14.【Keywords】Adenovirus Type 55 Intestinal cell Infectivity Cytopathic effect腺病毒是引起人呼吸道感染的主要病原体之一，感 染人的腺病毒分为A~G7个血清学组。
腺病毒的一些常见问题及解答----整理自丁香园
汇总了腺病毒的一些常见问题及解答！1.目前，对于基因治疗的载体选择，很难有一个统一的结论，文章也很多，我将在如下给出。
本人认为，无论选择哪种载体，关键在于此载体在局部的表达效率。
无论是采用IN VIVO 或者EX VIVO的方法，因为我们最终的目的是要在局部表达我的目的基因，并且使其具有一定的作用。
而对于载体的副作用，目前较为公认的就是病毒载体转染效率高，但副作用大；质粒载体毒性小，但转染效率比较低。
同时，对于目前所常用的一些带有报告基因的表达载体如BD公司所开发的系列载体，pEGFP、pDsRed、pEYFP和pECFP等：aaaclontechaaa这些载体如果用于细胞水平的检测，也许会更加的方便、直观，但是，如果用于体内的基因治疗，那就不是一个理想的载体了。
而传统的表达载体如INVITROGEN公司（aaainvitrogenaaa)的pCDNA载体系列，会更好一些。
同时，为了获得更加高效的表达，一些公司也开发出了具有信号肽的表达载体，以增加外源基因的分泌表达。
bbb:///vcore/Plasmids/pUMVC6a.htmbbb:///vcore/Plasmids/pUMVC7.htm正如一个疾病的治疗一样，治疗的方法越多，就证明还没有一个最有效地治疗手段。
基因治疗的载体也是同样，很难说哪个载体具有高转染、高表达、低毒性的全部优点。
以上是本人的一点愚见，还请各位同道指正。
2.转染过小鼠肝癌细胞H22，请赐教：用什么方法可以达到最佳效果，脂质体、电转还是重组病毒？如果用脂质体，哪家的最好？H22细胞为悬浮细胞，用病毒（逆转录病毒和腺病毒）最为理想，一是转染效率高，二是不用筛选直接用于实验。
但逆转录病毒的转染效率并不能达到100%，且影响因素多，而腺病毒感染效率高，几乎可达100%，但只能短期表达（7－10天），随着细胞传代，外源基因会逐渐丢失。
当然，H22也可用脂质体进行转染，筛选应在96孔板上进行，由于培养液少、细胞相对静止，两周后可见细胞克隆生长，在倒置显微镜下用吸管吸取克隆，进行扩大培养。
腺相关病毒、腺病毒、慢病毒、逆转录病毒的区别优缺点及应用场景
腺相关病毒、腺病毒、慢病毒、逆转录病毒的区别优缺点及应用场景前言：病毒系统知识点get，四种主流基因转导病毒工具：腺相关病毒、腺病毒、慢病毒、逆转录病毒的区别优缺点及应用场景随着病毒生物学的发展，种类繁多的病毒载体已越来越成为向各种实验系统（如细胞系、原代细胞、组织脏器等）转运核酸的重要工具。
除了在实验室的组织培养和动物模型生产中发挥重要作用，它们还被用于治疗遗传性疾病的临床试验中。
目前主流的病毒载体系统主要包括慢病毒（LV）、（γ-）逆转录病毒（RV）、腺病毒（Ad）和腺相关病毒（AAV）。
我们分述之。
慢病毒和逆转录病毒均属于逆转录病毒科。
其典型特征为其RNA 基因组能逆转录为 cDNA 副本，cDNA 副本又能稳定整合至宿主细胞基因组中（这就是常说的稳转）。
逆转录病毒通常分两种：简单的（有时又称为致癌病毒或γ- 逆转录病毒，如鼠白血病病毒）和复杂的（如慢病毒）。
这些亚型间主要的差异在于复杂的逆转录病毒存在一些附属基因和调控基因，而简单的则没有（下文有进一步的讨论）。
这两类病毒颗粒都含有两份正链RNA，RNA 上附有病毒反转录酶（RT），它们位于病毒的内核（图1）。
位于内核的还有结构蛋白和酶，包括核壳（NC）、衣壳（CA）、整合酶（IN）和蛋白酶（PR）。
内核由一圈外周蛋白层包围，外周蛋白包括基质蛋白（MA），基质蛋白又被来源于宿主细胞细胞膜插有包膜糖蛋白的腹膜所包围。
图1. 简单和复杂逆转录病毒粒子结构。
病毒颗粒含有两份正链RNA，RNA 上附有反转录酶（RT），它们位于病毒的内核。
除此之外，内核还包含核壳（NC）、衣壳（CA）、整合酶（IN）和蛋白酶（PR）。
内核由一圈基质蛋白（MA）所包围，基质蛋白又被来源于宿主细胞细胞膜插有包膜糖蛋白（ENV）的腹膜所包围。
图片来源：汉恒生物实验室常用的慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷1型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。
腺病毒感染诊疗指南PPT课件
根据病毒血清型和临床表现的不同， 腺病毒感染可分为多个类型，如呼吸 道型、胃肠道型、泌尿道型和眼型等 。
02 诊断方法与标准
实验室检测
01
02
03
病毒分离培养
通过细胞培养方法，从患 者标本中分离出腺病毒， 并进行病毒鉴定。
抗原检测
利用特异性抗体进行免疫 荧光或免疫酶染色，检测 患者标本中的腺病毒抗原 。
病毒颗粒呈二十面体对称，直径约为 70-90纳米。
传播途径及易感人群
传播途径
主要通过飞沫传播，也可通过接 触污染物体表面传播。
易感人群
人群普遍易感，但婴幼儿、老年 人及免疫功能低下者更易感染。
临床表现与分型
临床表现
腺病毒感染可引起呼吸道、胃肠道、 泌尿道及眼部等多种疾病，常见症状 包括发热、咳嗽、呼吸困难、腹泻、 呕吐、尿痛、结膜炎等。
未来发展趋势预测
加强腺病毒疫苗研发
发展新型抗病毒药物
随着疫苗技术的不断进步，未来将有更多 针对腺病毒的疫苗问世，提高人群的免疫 水平。
针对腺病毒的抗病毒药物研发将持续进行 ，未来可能出现更加高效、低毒的抗病毒 药物。
完善诊疗规范
加强国际合作与交流
随着临床经验的不断积累，腺病毒感染的 诊疗规范将更加完善，提高患者的治愈率 和生活质量。
腺病毒感染诊疗指南
汇报人：xxx
2024-01-27
目录
Contents
• 腺病毒概述 • 诊断方法与标准 • 治疗原则与策略 • 并发症预防与处理措施 • 患者教育与心理支持 • 总结回顾与展望未来发展趋势
01 腺病毒概述
腺病毒结构与特性
腺病毒是一种无包膜的双链DNA病毒 ，属于腺病毒科。
腺病毒质量检定方法
一、无菌检查 (2)（一）薄膜过滤法 (3)（二）直接接种法 (3)二、支原体检查 (4)第一法细胞培养法 (4)第二法指示细胞培养法（DNA染色法） (5)三、细胞内、外源病毒因子检查 (7)1 细胞形态观察及红细胞吸附试验（简称血吸附试验） (7)2 不同细胞传代培养法检测病毒因子 (7)3 接种动物和鸡胚法检测病毒因子 (8)4 逆转录病毒及其他内源性病毒或病毒核酸的检测 (8)1）逆转录酶活性测定 (8)2）透射电镜检查 (11)3）感染性试验 (11)5 特殊外源病毒因子的检测 (11)四、致瘤性检查 (11)五、感染效率和病毒的产量等的测定 (12)六、细胞鉴别（染色体检查） (12)七、病毒敏感性检查 (13)八、细胞功能检查 (13)九、重组腺病毒滴度的测定 (14)十、病毒比滴度（比活性IU）测定 (16)十一、E1A区、E2B区、AA V及插入基因的检测 (16)一）E1A区的检测 (16)二）E2B区的检测 (17)三）AA V的检测 (18)四）插入基因的检测 (18)十二、病毒外源因子检查 (19)十三、内毒素测定 (19)供试品溶液的制备 (19)确定最大有效稀释倍数（MVD） (20)方法1 凝胶法 (20)鲎试剂灵敏度复核试验 (21)干扰试验 (21)检查法 (23)十四效力试验插入基因表达活性测定，插入基因的生物学活性测定 (24)十五复制型病毒（RCA）检测A549细胞检测法 (24)十六腺相关病毒的检测采用PCR法 (26)十七残留量测定应根据生产工艺及成品的添加成份，对有潜在危险性的成份进行残留量检测： (27)1残余宿主DNA含量测定 (27)2残余牛血清白蛋白含量测定 (27)3残余核酸酶含量测定 (28)十八重组病毒制品的稳定性试验 (28)一、无菌检查《药典》（2010版第三部）附录ⅫA无菌检查法①试验材料1、细胞培养上清液2、硫乙醇酸盐流体培养基酪胨（胰酶水解）15.0g 酵母浸出粉 5.0g 葡萄糖 5.0g氯化钠 2.5g L-胱氨酸0.5g 新配制的0.1%刃天青溶液 1.0ml硫乙醇酸钠（或硫乙醇酸）0.5g (0.3ml）琼脂0.75g 水1000ml除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调pH值为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调pH值使灭菌后为7.1±0.2。
急性胃肠炎病毒(杯状病毒、星状病毒、肠道腺病毒)
急性胃肠炎病毒（杯状病毒、星状病毒、肠道腺病毒）一、杯状病毒人类杯状病毒（human caliciviruses, HuCV）属于杯状病毒科、杯状病毒属，据形态学、遗传学和抗原性的不同分为两类，一类是诺瓦克样病毒（norwalk like virus,NV)，另一类是萨帕罗病毒（sappovirus,SV)。
人类杯状病毒为球形，直径仅为27～38 nm，电镜下Norwalk病毒表面凹痕参差不齐，而Sappor。
病毒带有32个杯状凹陷的表面。
核心为单正链RNA，惟独一种衣壳蛋白，核衣壳呈二十面体立体对称，无包膜。
人类杯状病毒目前尚不能在体外细胞中培养，也无敏激动物模型。
该病毒置于50℃ 30 min、经紫外线照耀可以被灭活，耐。
人类杯状病毒通过粪-口途径传扬，感染后引起小肠绒毛轻度萎缩和黏膜上皮细胞破坏。
埋伏期为24 h，骤然发病，发热、恶心、呕吐、腹痛、腹泻，预后良好。
Norwalk病毒是世界上引起非细菌性胃肠炎爆发流行最重要的病原体之一，以冬季多见，可累及任何年龄，0～3月龄婴儿中有20％为Norwalk病毒抗体阳性，20岁以上人群中有50％为Norwalk病毒抗体阳性，但抗体的庇护作用不显然。
该病毒感染为自限性，预后良好。
目前试验室诊断主要通过电镜和免疫电镜技术检测患者粪便中的病毒颗粒，但敏感度较低，仅30％～50％患者粪便中可能检出病毒。
因为分子诊断学的进展，可应用基因重组病毒表达的Norwalk病毒衣壳抗原，通过ELISA检测患者相应抗体，也可用RT-PCR 法检测粪便和污染海产品（如牡蛎等）中的Norwalk病毒的核酸。
二、星状病毒星状病毒（astrovirus）属于星状病毒科（Astrovirus）星状病毒属，包括人、哺乳动物和鸟类星状病毒。
人星状病毒（human astrovirus）于1975年从婴幼儿腹泻粪便中分别得到。
病毒呈球形，直径为28～30 nm，电镜下可见病毒颗粒表面有5～6个角，呈有鉴别意义的星状形状。
肠道病毒标本的采集、运送、保存和实验室检测指南
肠道病毒标本的采集、运送、保存和实验室检测指南为及时、科学地采集和运送手足口病标本，规范实验室检测程序和检测方法，提高检测质量，特制定本指南。
一、采样液1．pH7.4～7.6 HANK氏平衡盐（含0.5%的牛血清白蛋白）。
2．pH7.4～7.6的Eagle’s MEM培养液（含0.5%的牛血清白蛋白）。
二、标本种类及采集1．咽拭子：用聚丙烯纤维头的塑料杆拭子同时擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，将拭子头浸入含3ml采样液的采样管中。
2．患者粪便：采集5～10g粪便置于15ml空采样管中。
3．血清标本：须采集急性期、恢复期双份血清。
用真空负压采血管采集血液标本5ml，室温静置30分钟，1500～2000rpm离心10分钟，收集血清于2ml无菌螺口塑料管中。
标本采集好后，应在采样管上做好标记，并注明标本的种类，同时及时填写采样表，要求信息完整。
三、标本保存及运送标本应在冷藏的条件下尽快进行送实验室检测，24小时内能检测的标本可置于4℃保存，24小时内无法检测的标本则应置于-70℃或以下保存。
如无－70℃保存条件，则于－20℃冰箱暂存。
血清可在4℃存放3天、-20℃以下长期保存。
标本运送期间应避免反复冻融。
四、标本的实验室检测1．核酸检测：方法包括RT-PCR和Real-Time RT-PCR，首先使用肠道病毒通用引物进行快速筛查，得到阳性结果后使用EV71、CoxA16等引物和探针进行分型。
2．病毒分离及鉴定：采用RD、Hep2和Vero细胞进行病毒的分离，第一代7日内仍然为阴性的标本需继续盲传一代。
病毒鉴定采用中和试验（NT）和间接免疫荧光法（IFA）。
3．血清学检测：采用组合血清进行血清中和试验，双份血清具4倍增长才具有诊断意义。
腺病毒分型与诊断方法研究进展
病毒分离技术通常被认为是腺病毒感染诊断的金标 准【２ Ｊ，临床标本接种敏感细胞，如Ｇｒａｈａｍ２９３，Ａ５４９，Ｈｅｐ－２等 细胞．通过细胞培养观察ＣＰＥ，分离腺病毒。通过病毒增殖， 还可以为进一步的分子生物学试验提供更多病原学信息。 腺病毒血清分型主要依据中和试验，血凝抑制试验，前者通 过直接检测腺病毒六邻体蛋白的抗原决定簇，而后者则根据 五邻体蛋白的抗原决定簇的检测结果而判定血清型。这些 方法通常需要３天到３星期的时间得到肯定结果，这依赖于 标本的来源和标本中病毒的含量，同时结果的解释还依靠有 经验的专业人员，费时费力而且有时会产生模棱两可的结 果。另外，得到结果的时间太长也不利于临床的治疗和隔 离。
一段时间内，放射性免疫和酶免疫实验因其高度敏感性 而取代操作繁琐的补体结合实验，但因放射性物质的环境危 害未能推广使用幢１。直接免疫荧光（ＤＦＡ）快速诊断技术也 为多数临床实验室所接受。在我国，有人研制了某些型特异 性的腺病毒的单克隆抗体，因为存在试剂的标准化等问题， 这些试剂没有广泛应用。用于腺病毒感染患者床边诊断的 免疫层析（ＩＣ）试剂盒在日本已经面市并做了评估。与常规 Ｉ＇ＣＲ、ｒｅａｌ．ｔｉｍｅ ＰＣＲ和病毒分离方法比较，结果发现。ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ和Ｉ＇ＣＲ方法最敏感，病毒分离次之，Ｉｃ敏感性最低。但 是实验证明，Ｉｃ是一种有用的床边诊断方法，腺病毒感染仅 凭临床表现很难诊断，实验很大程度上依赖于标本的采 集ｂ］。要非常注意标本的收集、运输和保存各环节。ｌＣ应用 的是Ａｄ２的六邻体蛋白的单克隆抗体，所以对３、７型的敏感 性低于Ａｄ４。
上述研究表明，ＰＣＲ扩增六邻体蛋白基因和基因序列 测定有可能取代以往传统的血清分型方法，但是该方法也 有其局限性：尽管９８％的标本分型一致。但是。只根据六邻 体基因的高变异区对分离株进行分型，有可能会遗漏一些与 宿主免疫应答和毒力密切相关的毒株的其他重要的遗传学 差异。例如，五邻体蛋白含有细胞受体的结合位点，这些位 点的改变可能影响腺病毒的组织嗜性；同样，编码某些早期 蛋白的基因有可能影响腺病毒在细胞中的传播，所以该方 法还应该结合腺病毒分子分型的其他方法以降低腺病毒重 组体漏检的风险。 ３．３ ＰＣＲ结合基因芯片技术
液相芯片技术检测儿童急性呼吸道感染病原体的研究
液相芯片技术检测儿童急性呼吸道感染病原体的研究曹广进; 张福真; 汉聪慧; 胡亮杉; 李凌; 曹东林【期刊名称】《《检验医学与临床》》【年(卷),期】2019(016)009【总页数】5页(P1179-1183)【关键词】液相芯片技术; 呼吸道病原体; 应急检测【作者】曹广进; 张福真; 汉聪慧; 胡亮杉; 李凌; 曹东林【作者单位】南方医科大学公共卫生学院三级生物安全实验室广州510515; 广东省第二人民医院临床检验中心广州510317【正文语种】中文【中图分类】R183.3突发公共卫生事件的应急处理是医护人员工作的重点，其中能够对重大传染病的病原体核酸进行快速检测，更是应急处理的关键。
近年来，WHO报道在全球范围内急性呼吸道疾病是传染性疾病发病和死亡的主要原因。
每年大约有400万人死于急性呼吸道疾病，其中婴儿、儿童和老年人的病死率非常高，绝大部分分布在中低收入国家。
而导致急性呼吸道疾病最常见的病原体是病毒，或者是细菌与病毒的混合感染。
目前已发现超过20种呼吸道病毒能够引起急性呼吸道疾病，而且病毒容易发生突变，从而产生了易感人群不能抵抗的新型病毒，同时这类新型病毒大多都具有高致病性的，导致近几年来高致病性病毒引起的急性呼吸道疾病的病例报道时有发生[1-3]。
因为急性呼吸道疾病的临床症状不典型，所以如何通过实验室快速检测呼吸道病原体是诊断的关键。
液相芯片技术是一种使用悬浮在液体中的荧光编码微球作为反应及信号检测载体的，集流式细胞术、激光技术、高速数字信号处理和计算机等技术于一体的高通量分子生物检测技术[4]。
液相芯片技术在20世纪90年代中期得到蓬勃发展，美国Luminex公司研发了XMAP技术，并获得了美国食品药品监督管理局(FDA)可用于临床诊断的认证[5]。
液相芯片技术具有高通量、高灵敏度和高特异度等优点。
本文应用液相芯片技术对74例咽拭子临床标本进行检测，同时与实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术进行比较，评价液相芯片技术在呼吸道病原体快速检测的应用前景。
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［ ］ Ｍｅｅｓ Ｒ，Ｐ ｐｎｅｌ ｕ Ａ，ｈｉｅ ｅ ａ． ｕｅｃ ｌ ｉ ｉ ５ ｙｒ Ｂ ａａ ｉ ａ Ｇ Ｓ ｅ ｒ ｔ １Ｔ ｂｒｕｏ ｓ ｎ ｏｏ ｎ Ｐ， ｓ
病 毒基 因 型分 型方 法 。方 法
提取病变细胞 的 Ｄ Ａ进行 Ｐ Ｒ扩 增 ， 后克隆 、 Ｎ Ｃ 然 测序 ， 确定病毒基 因型 ； 方法二 ： 直接 提取粪便 悬液
过滤上清 Ｄ Ａ进行巢式 Ｐ Ｒ扩增 ， Ｐ Ｒ阳性者进行克隆 、 序以及基 因型分型 。结果 １４份样 Ｎ Ｃ 对 Ｃ 测 １
Hale Waihona Puke ｎｎ ｏｖｎｉ ａ ｒｇｍ ｎ． ｒｎｐａｔ ｉ ，００，９ １ ：４６ ． ｏｃｎｅｔ ｎｌ ｅｉ ｅ ｓＴａｓｌｎａ ｏ ２０ ６ （ ）６ －９ ｏ ｔｎ ［ ］ Ａ ｕ ｄ Ｍ， ｅｍｒ Ｇ ｖｌａＪ ｅａ． ｌ ｉ ｌ ｒｓｎａｉ ｎ ６ ｇａ ｏ Ｊ Ｈ ｒ ｏ Ａ， ａａ ，ｔ １Ｃｉ ｃ ｅｅｔｔｎａｄ Ｊ ｄ ｎ ａｐ ｏ
本 中， 两种方法均有 １ ２份样本 检出腺病 毒 ，阳性 率为 １ ． ％ （２ １４ 。序列 分析显 示 ， 种方法 检 ０ ５ １／ １ ） 两 出的腺病毒型别一致 。这 １ ２份样本分别属于人腺病毒 ５型 （ ３份 ） ７型 （ 、 ２份 ） １ 、２型 （ ３份 ） ４ 及 ８型 （ ） ４份 。结论 虽然两种方法 的敏感性 、 异性一样 ， 特 但方法二是直接提取粪便悬液过 滤上清基 因组 Ｄ Ａ进行巢式 Ｐ Ｒ扩增 ， Ｎ Ｃ 而无需 如方法 一中所进 行的 ３次体外 病毒分离 实验 ， 节省 了实验 的时 间及
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两种肠 道腺 病 毒 基 因型 分 型标 本处 理 方 法 的 比较
阳莉 卢 建溪 王 强 黄建 华
【 摘要 】 目的
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通过对两种肠道腺病毒基 因型分型方法进行 比较 ， 以寻找 出简便快速 的肠道腺
采 集 １４例 非 腹 泻 人 群 的粪 便 样 本 ， 法 一 ： Ａ ４ １ 方 在 ５９细胞 中 进 行 培 养 ，
中华 临 床 医师 杂 志 （ 电子 版 ）００年 １ ２１ Ｏ月第 ４卷第 ｌ ０期 （ 文 献 复 习 ） 中 国普 通 外 科 杂 志 ，０７，６ ８ ：５ －５ ． 并 ． ２０ １ （ ）７ ０７３ ［ ４］ Ｃ ａ Ｌ Ｍ， ｇＫ ｅ ａ．ｍ ｌ ａｏ ｓｆｒｍ ｎｇｍ ｎ ｏ ｈ ｎＡＣ，ｏＣ Ｎ Ｋ，ｔ １Ｉ ｐｉ ｔ ｎ ｏ ａａｅ ｅｔ ｆ ｃｉ
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（ 稿 日期 ：０ ００ －５ 收 ２ １ －３１ ）
（ 本文编辑 ：郝 锐）
张毅 ， 林栋栋 ， 伏志 ， 肝移植 受者感 染结核的诊治探讨［／ Ｄ］ 中华 临床 医师杂志 ： 等． ＪＣ ． 电子版 ，０ ０４（０ ：９ ３１８ ２ １ ， １ ） １８ －９ ５