微生物发酵-青霉素类抗生素

苷类。）
青霉素的制备
一： 青霉素的背景 二： 青霉素的性质 三： 青霉素的生产工艺过程 四： 青霉素的应用
青霉素的背景
• 青霉素(Penicillin)又被称为盘尼西林，它是人类 发明的第一种抗生素，也是全球销量最大的抗生 素。青霉素是一种高效、低毒、临床应用广泛的 重要抗生素。它的研制成功大大增强了人类抵抗 细菌性感染的能力，带动了抗生素家族的诞生。
发酵工艺控制
• B.氮源 -主要有机氮源为玉米浆、棉籽饼粉、 花生饼粉、酵母粉、蛋白胨等。玉米浆为 较理想的氮源，含固体量少，有利于通气 及氧的传递，因而利用率较高。固体有机 氮源原料一般需粉碎至200目以下的细度。 有机氮源还可以提供一部分有机磷，供菌 体生长。无机氮如硝酸盐、尿素、硫酸铵 等可适量使用。
2.温度 ：
青霉素发酵的最适温度随所用菌株的不同可 能稍有差别 , 但一般认为应在25 °C 左右。温度 过高将明显降低发酵产率 , 同时增加葡萄糖的维 持消耗 , 降低葡萄糖至青霉素的转化率。对菌丝 生长和青霉素合成来说 , 最适温度不是一样的, 一 般前者略高于后者, 故有的发酵过程在菌丝生长阶 段采用较高的温度，以缩短生长时间, 到达生产阶 段后便适当降低温度 , 以利于青霉素的合成。
双碟培养 斜面培养 肉汤培养 镜检
等，其中以双碟培养为主。
无菌试验的方法--双碟培养
双碟培养的操作要点是：种子罐在培养过程中每8
小时取样一次，取样时在装有 9 毫升肉汤的试管内加入 2 ～ 5 毫升试样，然后在无菌室内通过无菌操作在事先铺 好琼脂培养基的双碟内画线。剩下的肉汤培养物，在 37℃培养 6 小时后复画一次，及另画一双碟作比较，发 酵罐在发酵过程中每隔 8 小时取样一次，用空白试管取样 5～15 毫升左右，于 37℃培养 6 小时后画碟时，双碟放 置 37 ℃ 培养．24 小时内的双碟，每隔2～3 小时在灯光 下检查一次，观察有无杂菌生长。 24 ～48 小时的双碟每 天检查一次，以防生长缓慢的杂菌漏检。一般杂菌在 37℃， 24 小时以内能长出来．此法的优点是比较准确， 但反应较慢（因杂菌在双碟上繁殖成菌落要有一定的时 间），并且操作也较麻烦。
细胞膜抑制
青霉素类
氨苄青霉素 邻氯青霉素
磷霉素 细胞壁合成抑制
DNA 合成抑制 喹诺酮类
RNA 合成抑制
利福霉素类
核酸合成抑制
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抗生素概述
• 5.作用机制：
• 抑制细菌细胞壁的合成（β-内酰胺类、磷霉素、 万古霉素。）
• 抑制细菌蛋白质合成（四环素、大环内酯类、氨 基糖苷类、氯霉素类。）
• 抑制细菌DNA合成（利福平。） • 抑制细菌RNA合成（放线菌素。） • 损伤细菌细胞膜（两性霉素B、粘菌素、氨基糖
--青霉素类抗生素
一 抗生素的概述 二 青霉素的制备
抗生素概述
• 1.定义 • 2.作用 • 3.来源 • 4.分类 • 5.作用机制
抗生素概述
• 1.定义：
• 是某些细菌、放线菌、真菌等微生物的次级 代谢产物，或用化学方法合成的相同化合物或结 构类似物，在低浓度下对各种病原性微生物或肿 瘤细胞有强力杀灭作用或有其他药理作用的药物。
β-环开裂,-CO2
青霉素生产工艺过程
菌种 →种子制 备 → 发酵 → 发酵液预处理 → 提取及精 制 → 成品包 装
青霉素生产工艺过程
菌种介绍：青霉是产生青霉素的重要菌种。广泛分 布于空气、土壤和各种物上，常生长在腐烂的柑桔 皮上呈青绿色。目前已发现几百种，其中产黄青霉 (Penicillum chrysogenum)、点青霉(Penicillum
发酵工艺控制
3.培养基成分的控制 :
A.碳源--发酵中常用乳酸或葡萄糖，也可 采用葡萄糖母液、糖蜜等。其中乳糖最为便宜， 但因货源较少，很多国家采用葡萄糖代替。但 当葡萄糖浓度超过一定限度时，会过分加速菌 体的呼吸，以至培养基中的溶解氧不能满足需 要，使一些中间代谢物不能完全氧化而积累在 菌体或培养基中，导致pH下降，影响某些酶 的活性，从而抑制微生物的生长河产物的合成。
对强酸不稳定，发生重排
PH=2 or HgCl2 青霉酸 + 青霉醛酸
△
青霉醛
b
O
NH S H
O
HN
O aH
OH
H+ or HgCl2
-CO2
NH O
Penilloaldehyde
CHO
O
NH S H
N Penilloic Acid H H
a
+
NH b
O
O
CHO
HOOC
OH Penaldic Acd
发酵工艺控制
6.泡沫的控制 ：
在发酵过程中产生大量泡沫, 可以用天然油脂, 如 豆油、玉米油等或用化学合成消泡剂 “ 泡敌 ” 来消泡, 应当控制其用量并要少量多次加入, 尤其在发酵前期不宜 多用, 否则会影响菌体的呼吸代谢 。
加消沫剂以控制泡沫，必要时还加入酸、碱以调 节发酵液的pH。
发酵液预处理
无菌试验的方法--斜面/肉汤培养
nototum)等都能大量产生青霉素
种子制备：种子制备是指孢子接入种子罐后， 在罐中繁殖成大量菌丝的过程，其目的是使孢 子发芽、繁殖和获得足够数量的菌丝，以便接 种到发酵罐当中去。种子制备所使用的培养基 及其它工艺条件，都要有利于孢子发芽和菌丝
繁殖。
发酵条件下的生长过程
第1期：分生孢子萌发，形成芽管，原生质 未分 化，具有小泡。 第2期：菌丝繁殖，原生质体具有嗜碱性， 类脂肪小颗粒。 第3期：形成脂肪包涵体，机理贮藏物，没 有空泡，嗜碱性很强。 第4期：脂肪包涵体形成小滴并减少，中小 空泡，原生质体嗜碱性减弱，开始产生抗生 素。
青霉素理化性质
酸性
一般的羧酸 Pka 4-6
PG
Pka 2.7
RCONH
6
4
5S
CH3
HH
7
O
N1
3 CH3 2 COOH
H
2S，5R，6R
临床用其钠盐、钾盐或普鲁卡因盐，增强水溶性。 粉针剂，有效期2年 临床用粉针剂，现用现配
不稳定性
• β –内酰胺环是青霉素中最 不稳定的部分，原因是
1、四元环和五元环稠合， 环的张力大
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抗生素概述
• 2.作用：
• 抗细菌感染 • 治疗肿瘤 • 抗病原虫 • 免疫抑制剂 • 刺激植物生长
• 3.来源：
• 生物合成（发酵） • 化学合成（全合成和半合成）
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抗生素概述
• 4.分类：
氨基糖苷类
头孢菌素类 头霉素类
大环内酯类
麦迪霉素 红霉素
四环素类
氯霉素 蛋白质合成抑制
多粘菌素 B
发酵工艺控制
• C.无机盐-碳酸钙用来中和发酵过程中产生的杂酸， 并控制发酵液的pH值，为菌体提供营养的无机磷 源一般采用磷酸二氢钾。另外加入硫代硫酸钠或 硫酸钠以提供青霉素分子中所需的硫。由于现在 还有一些工厂采用铁罐发酵，在发酵过程中铁离 子便逐渐进入发酵液。发酵时间愈长，则铁离子 愈多。铁离子在50µg/ml以上便会影响青霉素的 合成。采用铁络合剂以抑制铁离子的影响，但实 际对青霉素产量并无改进。所以青霉素的发酵罐 采用不锈钢制造为宜，其他重金属离子如铜、汞、 锌等能催化青霉素的分解反应。
1940年，英国Florey和Chain进一步研 究此菌，并从培养液中制出了干燥的青 霉素制品。经实验和临床试验证明，它 毒性很小，并对一些革兰氏阳性菌所引
起的许多疾病有卓越疗效。
青霉素类抗生素
来源：霉菌属的青霉菌发酵液中提取，天然青霉素有5种
G、V、N、K、X、其中PG的活性最高、产量最高 。
• 发酵液中的杂质如高价无机离子（Fe2+、Ca2+、 Mg2+）和蛋白质在离子交换的过程中对提炼影响 甚大，不利于树脂对抗生素的吸收。如用溶媒萃 取法提炼时，蛋白质的存在会产生乳化，使溶媒 合水相分离困难。对高价离子的去除，可采用草 酸或磷酸。如加草酸则它与钙离子生成的草酸钙 还能促使蛋白质凝固以提高发酵滤液的质量。如 加磷酸（或磷酸盐），既能降低钙离子浓度，也 利于去除镁离子。加黄血盐及硫酸锌，则前者有 利于去除铁离子，后者有利于凝固蛋白质。此外， 两者还有协同作用。他们所产生的复盐对蛋白质 有吸附作用。
第5期：形成大空泡，有中性染色大颗粒，菌丝呈桶 状，脂肪包涵体消失，青霉素产量最高。 第6期：出现个别自溶细胞，细胞内无颗粒，仍然桶 状。释放游离氨，pH上升。 第7期：菌丝完全自溶，仅有空细胞壁。
1－4期为菌丝生长期，3期的菌体适宜为种子。 4－5期为生产期，生产能力最强，通过工 程措施，延长此期，获得高产。 在第六期到来之前结束发酵。
发酵工艺控制
• D.前体-添加苯乙酸或者苯乙酰胺，可以借酰基转 移的作用，将苯乙酸转入青霉素分子，提高青霉 素G的生产强度，。因此前体的加入成为青霉素 发酵的关键问题之一。但苯乙酸对发酵有影响， 一般以苯乙酰胺较好。也有人采用苯乙酸月桂醇 酯，其优点是在发酵中月桂醇酯水解，苯乙酸结 合进青霉素成品。而月桂酸作为细菌营养剂及发 酵液消沫剂，且其毒性比苯乙酸小，但价格较贵。 前体要在发酵开始20h后加入，并在整个发酵过 程中控制在50µg/ml左右。前体用量大于0.1%时， 青霉素的生物合成均下降。所以一般发酵液中前 体浓度以始终维持在0.1%为宜。
HH H
N
S CH3
O
N
O
CH3
COOH HO
HH H
N
S CH3
O
N
O
CH 3
CO O H
HH H
N O
S CH3
O
N
O
CH3
CO OH
青霉素G
青霉素X 青霉素V
N H 2 H O