FDA大肠菌群和大肠杆菌检测方法
检测大肠杆菌的方法
检测大肠杆菌的方法
检测大肠杆菌的方法包括以下几种：
1. 化学方法：使用化学试剂检测大肠杆菌的生长产物，例如检测β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）或亚硝酸盐的产生。
2. 免疫学方法：使用抗原抗体反应来检测大肠杆菌的存在。
可以通过免疫层析试纸、酶联免疫吸附试验（ELISA）或免疫荧光染色等技术进行检测。
3. 分子生物学方法：使用DNA提取和PCR扩增技术，通过特定基因的检测来确定大肠杆菌的存在。
常用的是检测16S rRNA基因。
4. 血液培养法：将样品接种到含有适合大肠杆菌生长的培养基上，经过一段时间后观察是否有菌落形成。
5. 基于大肠杆菌特定生理和生化特征的传统方法：根据大肠杆菌在营养琼脂培养基上形成金属光泽、产生气泡、使用L-色氨酸作为唯一氮源，以及产生酸和气体等特征来进行初步检验。
这些方法可以单独或结合使用来对大肠杆菌进行检测，并能够提供快速、准确的结果。
大肠杆菌标准检测流程
大肠杆菌标准检测流程一、样品采集。
这可是检测的第一步呢，就像找宝藏得先知道宝藏大概在哪一样。
采集样品的时候得特别小心，要选对地方。
如果是检测食品里有没有大肠杆菌，那就要从食品的不同部位采集，像苹果的话，表面和果肉都得取点样，可不能只取一个地方就完事儿了。
要是检测水呢，那也得取有代表性的水样，比如说从水的表层、中层和底层都取一点混合起来，这样检测出来的结果才更靠谱。
采集样品的时候工具也要干净无菌，不然就把杂菌带进去了，那检测结果可就乱套了。
二、样品处理。
采集好样品就得处理啦。
对于固体的样品，像是食物之类的，得把它弄碎成均匀的小颗粒，就像把一块大蛋糕掰成好多小碎块一样。
然后加入一些特定的液体，这个液体能让大肠杆菌从食物颗粒里跑出来，进入到液体里，方便我们后续检测。
对于液体样品呢，要是比较浑浊的，可能还得过滤一下，把那些大的杂质去掉，留下清澈一点的液体，这样大肠杆菌在里面就更显眼啦。
三、增菌培养。
处理好的样品就可以进行增菌培养喽。
这就像是给大肠杆菌盖个小房子，还提供好多好吃的，让它们快快繁殖。
把样品放到专门的培养基里，这个培养基就像是为大肠杆菌特制的营养大餐，里面有它们生长需要的各种营养成分。
然后把这个放了样品的培养基放到合适的温度下，一般是37摄氏度左右，这个温度对大肠杆菌来说就像春天的阳光一样温暖舒适，它们就会在里面开心地繁殖起来啦。
这个过程可能得持续一段时间，几个小时到一天不等，就看大肠杆菌们的心情啦，哈哈，其实是看它们繁殖的速度啦。
四、分离培养。
等大肠杆菌繁殖得差不多了，就要把它们从一堆细菌里分离出来。
这时候就用到平板啦。
把增菌后的样品接种到平板培养基上，然后用一种特殊的方法把它们均匀地涂开，就像画画一样把细菌均匀地涂在平板上。
然后把平板放到培养箱里继续培养。
在平板上，大肠杆菌会长成一个个小菌落，每个菌落就像是一个小家庭一样，都是由一个大肠杆菌繁殖出来的。
而且大肠杆菌的菌落有它自己的特点，比如说颜色、形状、大小之类的，通过这些特点我们就能初步判断是不是大肠杆菌啦。
食品微生物检验方法(ISOFDA)
所有平板的菌落数都超过250CFU，但不足100/cm2 ，报告EAPC/ml （g）为最接近250CFU的平板菌落数的估计值，乘以相应的稀释度 。
所有平板的菌落数都超过100/cm2 ，计算平板的面积（直径为90mm 的平板面积为65cm2），估计最高稀释度每cm2的菌落数，乘以相应 平板面积作为该稀释度的菌落计数结果，报告EAPC/ml（g）为＞ 65*100* 1/d。
大肠杆菌在外界存活时间与一些主要肠道致病菌接近，它的出现预 示着某些肠道病原菌的存在，因此该菌是国际上公认的卫生监测指 示菌。近年来，有些国家在执行HACCP管理中，将大肠杆菌检测 作为微生物污染状况的监测指标和HACCP实施效果的评估指标。
鉴于食品检样中的细菌细胞是以单个、成双、链状、 葡萄状或成堆的形式存在，因而在平板上出现的菌落 可以来源于细胞块，也可以来源于单个细胞，因而平 板上所得菌落的数字不应报告活菌数，而应以单位重 量、容积或表面积内的菌落数或菌落形成单位（colony forming units，CFU）报告。
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菌落总数测定几点要求
检样稀释液有时带有食品颗粒，为避免与细菌菌落发生混淆，可 作一检样稀释液与平板计数琼脂混合的平皿，不经培养，于4 ℃ 放置，以便在计数检样时用作对照。
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大肠菌群的定义
大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼 性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。
大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是根据卫生学 方面的要求，提出的与粪便污染有关的细菌，即作为 食品、水体等是否受过人畜粪便污染的指示菌，这些 细菌在生化及血清学方面并非完全一致。根据进一步 的生化试验，可将这群细菌再分为大肠艾希氏菌（俗 称大肠杆菌）、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌和 阴沟肠杆菌等。
FDA大肠菌群和大肠杆菌检测方法
大肠菌群的定义大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。
大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是根据卫生学方面的要求，提出的与粪便污染有关的细菌，即作为食品、水体等是否受过人畜粪便污染的指示菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。
根据进一步的生化试验，可将这群细菌再分为大肠艾希氏菌（俗称大肠杆菌）、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。
大肠杆菌的定义大肠杆菌（也称大肠埃希氏菌），分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属。
大肠杆菌指革兰氏阴性无芽孢杆菌、乳糖发酵产酸产气、IMViC试验（靛基质、MR、V-P、柠檬酸盐试验）为++--或-+--的细菌。
与人类有关的大肠杆菌统称为致泻性大肠杆菌，包括五种：肠毒素性大肠杆菌（ETEC）、致病性大肠杆菌（EPEC）、出血性大肠杆菌（EHEC）、侵袭性大肠杆菌（EIEC）、黏附性大肠杆菌（EAEC）。
卫生学意义大肠菌群和大肠杆菌是评价卫生质量的重要指标，作为食品中的粪便污染指标。
食品中检出大肠菌群，表明该食品有粪便污染，既可能有肠道致病菌存在，因而也就有可能通过污染的食品引起肠道传染病的流行。
大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。
大肠杆菌在外界存活时间与一些主要肠道致病菌接近，它的出现预示着某些肠道病原菌的存在，因此该菌是国际上公认的卫生监测指示菌。
近年来，有些国家在执行HACCP管理中，将大肠杆菌检测作为微生物污染状况的监测指标和HACCP实施效果的评估指标。
大肠杆菌的生物学特性基本形态：此菌为两端钝圆的短小杆菌，一般约0.5-0.8μm*1.0-3.0 μm，多单独存在或成双，但不呈长链排列。
约50%的菌株有周生鞭毛，但多数只有1-4根，一般不超过10根，故菌体动力弱。
多数菌株有菌毛，有的有荚膜或微荚膜，不形成芽孢，对普通碱性染料着色良好，革兰氏染色阴性。
培养特性：大肠杆菌合成代谢能力强，在含无机盐、铵盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。
大肠菌群及大肠杆菌检测方法
出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法Method for examination of coliform ，fecal coliform and escherichia coli in food for exportSN 0169 —92代替ZB X09 002 —861 主题内容与适用范围本标准规定了出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检验方法。
本标准适用于出口食品的检验。
2 设备和材料2.1吸管：1mL，具O.ImL刻度；5mL和10mL，具1mL刻度。
2 2 水浴箱：44.5 ±.5C。
2.3 培养箱：36±1C, 44.5 ±.5C。
2.4冰箱：0〜5 C和-15〜-20Co2.5 均质器。
2.6乳钵和研棒。
2.7 平皿：直径90mm o2.8 天平：感量0.1g o2.9显微镜。
2.10稀释瓶：100mL、200mL和500mL三角烧瓶及广口瓶。
2.11 玻璃珠：直径约5mm o2.12菌落计数器。
3 培养基及试剂3.1月桂基硫酸盐胰蛋白（LST）肉汤。
3.2煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤。
3.3 EC肉汤。
3.4 伊红美蓝琼脂（EMB）o3.5营养琼脂斜面。
3.6色氨酸肉汤。
3.7 MR-VP 培养基。
3.8 Korser氏枸椽酸盐肉汤。
3.9 结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）o3.10 Butterfield氏磷酸盐缓冲稀释液。
3.11生理盐水。
3.12革兰氏染色液。
3.13 Kovacs氏靛基质试剂。
3.14甲基红指示剂。
3.15 Voges—pros kauer（V —P）试剂。
4 样品制备4.1以无菌操作取有代表性的样品。
如有包装则用75%乙醇在开口处擦拭后取样。
若不能及时检验，应将冷冻样品置于-15C保存；非冷冻而易腐的食品，应置于4C冰箱保存。
检验前冷冻样品可于2—5C 18h内解冻，或在45C以下15min内解冻。
4.2 不同食品样品匀液的制备4.2.1 液体食品以灭菌吸管取样25mL 放入装有225mL 稀释剂的灭菌玻璃瓶（瓶内预置适当数量的玻璃珠），以30cm 幅度、于7s 内振摇25次（或以机械振荡器振摇），制成1 : 10的样品匀液。
大肠杆菌检验方法
大肠杆菌检验方法
大肠杆菌(Escherichia coli)是一种革兰氏阴性的厌氧菌，常常被用作指示性微生物来评估食品和水源的卫生质量。
以下是常见的大肠杆菌检验方法：
1. 培养基方法：将样品接种在包含大肠杆菌生长所需营养物质的培养基上，如大肠杆菌选择性琼脂培养基(MacConkey琼脂培养基)和EC培养基等。
大肠杆菌能够利用琼脂中的乳糖发酵产生酸，导致培养基呈现红色或粉红色。
此外，EC 培养基还包含了可以检测大肠杆菌β-葡萄糖苷酶的亚甲基红试剂，如果大肠杆菌存在，则培养基呈现金属光泽。
2. 确认方法：对落有培养基上的鲜艳深色菌落进行进一步确认。
典型的确认方法包括革兰染色、目测观察形态特征、氧化发酵试验和测试产气杆菌酶试验。
3. PCR检测方法：利用聚合酶链反应(PCR)技术，从样品中扩增大肠杆菌特异性基因片段（如16S rRNA基因），然后通过凝胶电泳检测扩增产物。
4. 快速方法：如免疫层析试纸法和光学组织测定法。
免疫层析试纸法利用抗大肠杆菌抗体与大肠杆菌特异性抗原结合生成可视化结果。
光学组织测定法利用大肠杆菌的β-葡萄糖苷酶水解比色底物产生颜色变化。
这些方法都可用于检测大肠杆菌在食品和水源中的存在及其数量。
在进行检验时，应严格遵守相关的操作规程和实验室操作规范，以确保结果的准确性和可靠性。
大肠菌群及大肠杆菌检测方法
大肠菌群及大肠杆菌检测方法简介大肠菌群是指人和动物肠道中存在的一群细菌的总称，其中大肠杆菌是大肠菌群中的一种重要成员。
大肠杆菌是一种革兰阴性杆菌，属于肠道的常见菌群，对人体有益，并且在环境和食品中也常见。
然而，大肠杆菌也有一些致病的菌株，如致泻性大肠杆菌，会导致食物中毒和胃肠道感染。
大肠菌群检测方法大肠菌群的检测方法主要分为培养法和分子生物学方法两大类。
培养法：传统的大肠菌群检测方法是基于培养菌株的数量来进行评估。
这种方法通过将样品培养在选择性培养基上，利用大肠杆菌产生的特殊代谢产物来进行鉴定。
这一方法简单易行，成本较低，但存在一些局限性，如培养时间长，只能检测活菌，对于非培养性细菌较为困难。
分子生物学方法：分子生物学方法包括PCR和实时荧光定量PCR等技术，不依赖细菌的生长特性，能够快速准确地检测大肠菌群。
PCR是通过扩增大肠菌群的16SrRNA基因，然后通过电泳等方法进行检测和定量。
实时荧光定量PCR是一种更快速、灵敏和准确的检测方法，利用荧光探针技术可以实时监测扩增反应的过程，并定量测定大肠菌群的数量。
这种方法具有高度特异性和灵敏性，可以检测非活菌和少量菌。
大肠杆菌的检测方法主要分为传统培养法和分子生物学方法两种。
传统培养法：大肠杆菌的传统培养方法是将样品在选择性培养基上进行培养，利用大肠杆菌产生的代谢产物进行鉴定，并通过菌落数进行定量。
这种方法操作简单，成本较低，但存在一些问题，如需要较长时间培养（通常需要24-48小时），偶尔出现培养落阳性假阳性结果。
此外，该方法只能检测到特定培养条件下的大肠杆菌，并不能检测到非培养性或者少量存在的大肠杆菌。
分子生物学方法：分子生物学方法是通过扩增大肠杆菌特异基因或基因片段来进行检测。
常见的方法有PCR和实时荧光定量PCR。
PCR方法通过扩增大肠杆菌特异基因（如uidA基因）来进行检测，并通过电泳等方法进行鉴定。
实时荧光定量PCR是一种更快速灵敏准确的方法，可以实时监测扩增反应的过程，并定量测定大肠杆菌的数量。
检测大肠菌群的方法
检测大肠菌群的方法
大肠菌群的检测方法可以包括以下几个方面：
1. 培养方法：可以采用传统的培养方法，将样本在含有特定培养基的培养皿上进行培养，并在适当条件下培养出大肠菌群。
然后通过形态特征、生理特性以及生物化学反应等来鉴定大肠菌群。
2. 分子生物学方法：包括PCR、实时荧光PCR、测序等技术。
通过特定引物扩增大肠菌群的特异基因片段，比如16S rRNA基因或者其他特定的核酸片段，然后通过序列比对和进化关系分析来确定大肠菌群的存在和数量。
3. 免疫学方法：可以使用特异性抗体进行检测，如免疫荧光染色、酶联免疫吸附试验（ELISA）等方法，通过检测特定抗原的存在来判断大肠菌群的存在。
4. 生化方法：通过检测样品中特定的代谢产物来间接判断大肠菌群的存在，比如检测大肠菌产生的气体（如氢气、二氧化碳等）、产酸性物质等。
这些方法可以根据具体的需求和实验条件选择合适的方法进行大肠菌群的检测。
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大肠菌群的定义
大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。
大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是根据卫生学方面的要求，提出的与粪便污染有关的细菌，即作为食品、水体等是否受过人畜粪便污染的指示菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。
根据进一步的生化试验，可将这群细菌再分为大肠艾希氏菌（俗称大肠杆菌）、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。
大肠杆菌的定义
大肠杆菌（也称大肠埃希氏菌），分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属。
大肠杆菌指革兰氏阴性无芽孢杆菌、乳糖发酵产酸产气、IMViC试验（靛基质、MR、V-P、柠檬酸盐试验）为++--或-+--的细菌。
与人类有关的大肠杆菌统称为致泻性大肠杆菌，包括五种：肠毒素性大肠杆菌（ETEC）、致病性大肠杆菌（EPEC）、出血性大肠杆菌（EHEC）、侵袭性大肠杆菌（EIEC）、黏附性大肠杆菌（EAEC）。
卫生学意义
大肠菌群和大肠杆菌是评价卫生质量的重要指标，作为食品中的粪便污染指标。
食品中检出大肠菌群，表明该食品有粪便污染，既可能有肠道致病菌存在，因而也就有可能通过污染的食品引起肠道传染病的流行。
大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。
大肠杆菌在外界存活时间与一些主要肠道致病菌接近，它的出现预示着某些肠道病原菌的存在，因此该菌是国际上公认的卫生监测指示菌。
近年来，有些国家在执行HACCP管理中，将大肠杆菌检测作为微生物污染状况的监测指标和HACCP实施效果的评估指标。
大肠杆菌的生物学特性
基本形态：
此菌为两端钝圆的短小杆菌，一般约0.5-0.8μm*1.0-3.0 μm，多单独存在或成双，但不呈长链排列。
约50%的菌株有周生鞭毛，但多数只有1-4根，一般不超过10根，故菌体动力弱。
多数菌株有菌毛，有的有荚膜或微荚膜，不形成芽孢，对普通碱性染料着色良好，革兰氏染色阴性。
培养特性：
大肠杆菌合成代谢能力强，在含无机盐、铵盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。
最适生长温度为37℃，在42-44 ℃条件下仍能生长，生长温度范围15-46 ℃。
大肠菌群及大肠杆菌测定
——MPN法检验流程（FDA BAM）
1、检样50g+450ml稀释液
2、适当十倍稀释样品
3、选择3个适宜的连续稀释度的样品稀释液，每个稀释度接种三管LST肉汤（每管9mlLST肉汤并加有导管），每管接种1mL。
在35℃下，培养24 ± 2h ~48 ± 2h。
4、（1）没有产气管→报告阴性
（2）有产气管：①接种BGLB肉汤管→查MPN表报告结果（大肠菌群）
②接种EC肉汤→在44.5±0.5 ℃ （水浴培养）24 ± 2h ~48 ± 2h。
→产气管接种EMB平板（35℃、18~24h），从EMB平板上挑取5个可疑菌
转接到PCA斜面，进行革兰氏染色、IMVC生化鉴定、接种LST复检产气
→查MPN表报告结果（大肠菌群）。
大肠菌群测定——MPN法检验几点说明
MPN检索表：
MPN检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀释度，则表内数字应相应降低或增加10倍。
初发酵和证实试验：
1）两步法进行了两次乳糖发酵试验。
初发酵和证实实验所用培养基不同，但都是为了证实培养物是否符合大肠菌群的定义，即“在37℃分解乳糖产酸产气”。
2）初发酵阳性管，不能肯定就是大肠菌群细菌，经过证实试验后，有时可能成为阴性。
有数据表明，食品中大肠菌群检验步骤的符合率，初发酵与证实试验相差较大。
因此，在实际检测工作中，证实试验是必需的。
产气量与倒管：
在乳糖发酵试验工作中，经常可以看到在发酵倒管内极微少的气泡（有时比小米粒还小），有时可以遇到在初发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮的小气泡。
实验表明，大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。
如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生，而应作进一步试验。
大肠杆菌测定——EMB选择性分离鉴别
EMB平板典型大肠杆菌菌落特征：
中心黑色或紫红色，有或无绿色金属光泽
大肠杆菌测定——EMB选择性分离鉴别
EMB是一种弱选择性培养基，一些球菌也可在该培养基上生长；l高压灭菌可使得美蓝还原从而使培养基的颜色呈不均一橘黄色，轻轻摇动培养基可以恢复原有的正常紫色，倾注平板前应先摇匀；
大肠杆菌在该培养基上并不一定总是呈现绿色的金属光泽；
该培养基受可见光易使其中的成分氧化，储存及培养细菌时都应在避光条件。
大肠杆菌测定——革兰氏染色
基本步骤：
将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染1min，水洗；
滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗；
滴加95%乙醇脱色约15～30s,直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗；
滴加番红复染液，复染1min，水洗、待干、镜检。
结果：革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。