石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法
石蜡切片免疫组化染色步骤
石蜡切片免疫组化染色步骤石蜡切片免疫组化染色是一种常用的实验技术，用于研究组织、细胞和分子的结构与功能。
它通过使用抗体与特定抗原相互结合，然后使用酶、免疫荧光等标记物来检测这种结合，从而实现可视化染色和定位目标分子的目的。
下面，我们将详细介绍石蜡切片免疫组化染色的步骤。
步骤一：蜡块去蜡石蜡切片通常是由固定的组织样本制备而成，这些样本在处理过程中会被包埋在石蜡中。
因此，第一步是将蜡块去蜡。
首先，将蜡块放在温水中加热，使蜡块软化。
然后，将蜡块用刮刀从玻片上刮下。
这样可以得到蜡块去蜡后的组织样本。
步骤二：样本再固定在蜡块去蜡后，为了更好地保持组织的完整性和稳定性，通常需要对样本进行再固定。
常用的再固定方法是将样本放入4%的中性缓冲福尔马林溶液中，在室温下固定4-24小时。
固定后，将样本从福尔马林中取出，用PBS（磷酸缓冲盐溶液）洗涤数次，以去除残余的福尔马林。
步骤三：切片制备在样本再固定后，需要将样本制备成切片。
首先，将组织样本放入甲醇中脱水，然后转移到乙醚中脱脂。
脱脂后，将样本放入苯骚酸乙酯中浸泡，使样本渗透均匀。
在苯骚酸乙酯中浸泡一段时间后，将样本转移到石蜡中浸泡。
石蜡具有很好的切片性能，可以更好地保持组织的结构。
最后，将样本放入石蜡包埋机中，进行加热和固化，制备成为石蜡块。
之后，使用旋转切片机将石蜡块切成4-6微米厚的切片。
切片后，将切片浸泡在热水中，使其展开并粘附在玻片上。
步骤四：抗原修复切片制备完毕后，需要对切片进行抗原修复。
抗原修复是为了使样本中的抗原能够更好地暴露出来，增加抗体的结合效率。
常用的抗原修复方法有热处理和化学处理两种。
热处理通常是将切片浸泡在含有缓冲盐的蒸馏水中，然后加热至高温（如95摄氏度）保持一定时间。
化学处理通常是将切片浸泡在含有抗原修复试剂的溶液中，如EDTA（乙二胺四乙酸二钠）溶液。
抗原修复的时间和条件需根据具体实验的要求来确定。
步骤五：非特异性结合阻断为了减少非特异性结合，需要对切片进行非特异性结合阻断。
石蜡切片免疫组化染色步骤
石蜡切片免疫组化染色步骤石蜡切片免疫组化染色是一种常用的组织学染色技术，它能够通过染色反应检测组织中的蛋白质分子、细胞因子、细胞膜受体和细胞核因子等，为研究细胞和组织的功能以及疾病的发生机制提供了重要的工具。
下面将详细介绍石蜡切片免疫组化染色的步骤。
1.组织固定组织固定是石蜡切片免疫组化染色的第一步，它的目的是保持组织形态和结构，使得后续的染色步骤能够成功进行。
常用的固定方法有甲醛固定、醋酸盐固定和乙醇固定等。
其中，甲醛固定是最常用的方法，它可以固定组织细胞的形态和结构，同时减少细胞中的酶活性。
2.组织处理组织处理是将固定后的组织进行处理以便得到合适的切片和染色结果。
处理过程主要包括去水化、脱脂、透明化和浸渍等。
其中，去水化是将固定的组织从水中逐渐转移到无水乙醇中，以防止组织中的水分对后续蜡包埋产生干扰；脱脂是将组织中的脂肪酸等去除，以减少重组过程中的背景染色；透明化是将组织从乙醇中转移到透明剂中，以便光线穿过组织时不受阻碍；浸渍是将透明剂中的组织浸渍入蜡中，使其成为切片的固定基质。
3.蜡包埋蜡包埋是将处理后的组织浸入熔化的石蜡中，使其固定在蜡块中，并利用蜡的硬度和韧性将组织完整地包裹起来。
蜡包埋过程主要包括浸渍、浸透和固化等步骤。
其中，浸渍是将固定在透明剂中的组织浸渍入熔化的蜡中，以提高组织与蜡的亲和性；浸透是将融化的蜡逐渐浸透入组织内部的过程，以保持组织的完整性；固化是将蜡冷却固化，使其成为切片的固定基质。
4.制备切片制备切片是将包埋在蜡中的组织切成适当的厚度，以便后续的染色和观察。
制备切片的步骤主要包括切片机调节、切片和玻片浮法三个步骤。
其中，切片机调节是将切片机调整到适合的刀片和切片速度，以保证切片的质量和均匀性；切片是将包埋的组织从蜡块中切下，并将其转移到切片水槽中；玻片浮法是将切片从切片水槽中捞起，并将其平铺在预处理的玻片上。
5.脱蜡和重组脱蜡和重组是将切片上的蜡去除，并将组织重组成适合的形式，以便后续的染色步骤。
石蜡切片免疫组化操作步骤
石蜡切片免疫组织化学操作流程一、组织获取（本实验室多做脑组织，所以以脑组织为例）1.动物麻醉：所用麻醉药物（水合氯醛水溶剂）剂量为350mg/kg动物体重，常用麻醉药物浓度为5%、6%、7%、10%（麻醉浓度越大，动物进入麻醉时间越短，但麻醉致死率相应较高，本人使用7%浓度，若注射位置正确，约3min进入麻醉状态）；动物麻醉后，将其固定于灌流操作平台，仰卧位；2.动物灌流手术：以胸骨剑突为起点，沿左右两侧肋下缘剪开老鼠皮肤至腋下，再次以剑突为起点，剪开皮下肌肉层，沿同样方向剪开肌肉至腋下，避免伤到内部脏器，剪破膈膜，沿左右两侧剪断胸骨，用止血钳夹住剑突向上翻转，充分暴露心脏；用弯镊分离心脏表面黏膜；左手持止血钳轻夹起心脏，倾斜一定角度，使心尖方向与升主动脉尽量位于同一直线上，右手持灌流针，沿直线所在所在角度由左心室进针，将灌流针直接插入升主动脉（可挑动灌流针于升主动脉内观察是否正确插入，此方法操作不熟练易插错血管或是直接刺穿心脏——或者直接将灌流针插入左心室，但前方法灌流效率较高）；固定器械（器械松动或是位置变化会严重影响灌流质量，有时会因为器械位置的变动直接将心脏牵扯下来导致灌流失败，应给与充分注意）3.动物灌流：C57小鼠25-30g左右，灌流开始，可见右心耳充盈，用剪刀剪开，便于血液流出：吊瓶灌流——以生理盐水50-100ml快速冲洗血液，持续最好不要超过5min（时间过长会导致脑组织降解），待无明显血迹流出后换用4%多聚甲醛进行灌流，约100-150ml，灌流速度不宜过快，约10min，固定液较充分的固定组织；注射器灌流——生理盐水50ml快速推注，后换用4%多聚甲醛50ml缓慢推注。
灌流成功的标志——灌流开始，可见肝脏颜色迅速变浅，随着灌流进行，肝脏颜色逐渐变为乳黄色或是白色；换用4%多甲固定液后小鼠全身痉挛抽搐，组织僵硬。
4.开颅取脑：根据实验取材位置的不同，分为不同的取脑方式：应注意需要的组织区域，避免取脑过程中损坏，多从小脑后方依次向前剥离颅骨，获取脑组织（在颅骨剥开后，应注意脑膜的存在，因为会发生脑膜将皮层割裂损伤的情况）5.脑组织修块：将多余脑组织去除，便于固定充分均匀，应留出试刀或找平的部分多余组织（本人实验中因需要海马组织，故修块时沿大脑皮层后边缘切除多余小脑，人字缝前约2.5-3mm切除前脑部分）6.固定过夜：将修块完成的脑组织，浸泡于4%多聚甲醛中，固定过夜，通常不要超过18小时（固定时间越长，组织抗原损失越严重，呈数量级损失），一般控制在12小时以内为宜二、组织石蜡包埋7.组织梯度脱水透明：将过夜固定的脑组织取出置于包埋窗内，并用铅笔做好相应标记，自来水流水冲洗约10min，去除残留的杂质成分，进行梯度酒精脱水（注意：不同的组织类型，同组织类型不同组织块大小所需的每阶段脱水时间不同，需根据自身需要进行简单摸索；若盲目脱水透明，脱水透明过头，会使组织脆性增加，切片时全为粉末状，无法成形；脱水透明不够，会使组织与蜡块分离，无法获取平整组织切片）本实验中，组织样本为脑组织，组织修块后所进行的脱水流程如下：自来水冲洗完成→50%乙醇 25min→70%乙醇 25min→80%乙醇 25min→90%乙醇 25min →95%乙醇I 10min→95%乙醇II 15min→无水乙醇I 10min→无水乙醇II 15min→二甲苯I 15min→二甲苯II 15min8.组织浸蜡：在进行二甲苯透明开始的时候，将石蜡用沸水融化，置于60度烘箱内备用（此过程中应注意将盛放石蜡的烧杯上口封闭，避免水分溅入；根据组织块的数目准备合适体积的石蜡液体，以组织块完全浸没其中为宜）；将透明完成的组织块，尽量沥干多余二甲苯，迅速转入1号烧杯的石蜡液体内（避免包埋窗内产生气泡，气泡若围绕组织块会影响浸蜡过程），依次将所有组织块迅速转入其中，要求组织块要全部浸没在石蜡中，流程如下：1号石蜡2h→2号石蜡2h→3号石蜡2h在每个阶段的浸蜡过程中，可根据时间安排适量的延长浸蜡时间，但尽量不要减少时间9.组织块包埋：包埋前，准备沸水备用；清理干净包埋槽备用；包埋开始时，将装有组织块的烧杯浸入沸水中，防止在包埋过程中，烧杯中的石蜡凝固，具体操作如下：1）用镊子夹取包埋槽在酒精灯预温，控制包埋槽的温度不要过高；2）将烧杯内的石蜡倒入包埋槽内，液面高度刚好没过包埋槽两侧平台3）取出浸泡的组织块，用小镊子过火后夹取组织块放置在包埋槽的凹陷处中心部位，根据切片要求摆放位置，注意在放置过程中避免组织块下面接触包埋槽底部的位置产生气泡，通常在放置前，可将组织块浸没在凹槽内的石蜡中翻滚，使其各面均匀接触石蜡液体，然后放置在正确的位置（此时假如包埋槽预温过高，则会导致组织块在接触槽底面后异常干燥，在整个蜡块凝固后会在干燥处出现凹洞，不利于石蜡块的长期保存）；4）将包埋窗轻轻放置在包埋槽的平台上面，尽量保证两侧高度相同，此时槽内之前的石蜡会浸没部分包埋窗的格栏，静置1-2min（避免倒入热的液体石蜡后，石蜡从包埋窗的边缘流出）；5）静置后，石蜡表面会出现凝固表层，此时再用烧杯中的石蜡填充包埋窗的凹陷处以及靠近边缘的条状凹洞，液面稍高于包埋窗边缘（靠近边缘的条状凹洞一定注意填充石蜡，关乎整个蜡块凝固后与包埋窗结合的紧密程度；石蜡凝固后体积会缩小，避免因液面过低导致的后期包埋窗内部支撑不够）6）静置至少30min，可将包埋后的蜡块从包埋槽内分离（注意分离时，应先清理包埋槽四周的多余石蜡，露出包埋窗与包埋槽接触的边缘，然后从一个角将蜡块撬离包埋槽）三、石蜡切片10.准备工作：蜡块的修整——将组织周边的石蜡在保留操作位置的情况下尽量去除（1-减少石蜡块切面与刀片的接触面积，便于受力均匀，易切出完整切片；2-石蜡切面与刀片接触面积小，会减少刀片接触到蜡块中坚硬杂质的几率，增加刀片的使用寿命；3-接触长度减少，可增加刀片使用次数，通常情况下至少多使用1次）准备器材：40度恒温水浴（温度控制在40-42之间的恒温状态，此温度可使蜡片较长时间保持切片形态，温度较低切片不易展开，温度较高，切片会在短时间内融化，易造成组织变形）切片刀片、包被载玻片、弯镊、毛刷、铅笔、切片盒冰盒（通常情况不需要，在组织脱水透明严重，切片呈粉末状态时，可用冰块冰敷石蜡切面，在短时间内可改善切片表面状态，能够帮助切出3-5片完整切片，只有在前期处理出问题时才使用进行一定程度挽救）切片大致流程：1）安装刀片；将蜡块固定于切片机上，调整蜡块表面与刀片距离，矫正蜡块表面与刀片切线平行；2）调整切片模式为trim-10um进行表面找平，并观察切片状态，调整蜡块角度，使切片左右对称，同时注意观察目标区域出现位置；3）切片调平，并出现合适目标区域，调整切片模式为sect-5um进行切片，获取所需组织切片样本；4）将完整合适的切片，夹取至水浴锅内摊平，左手持载玻片，右手持弯镊辅助，将切片贴于载玻片中，放置在水浴锅边缘进行干燥并做好相应标记；5）将干燥完成切片，按照样本分类放置在一起收于切片盒中备用6）切片完成，清理清片机；剩余组织蜡块，需要在切面表面均匀涂抹融化的石蜡，避免组织块直接与空气接触（不进行封闭，会使组织块在长期的暴露过程中，含水量发生变化，易于与支撑蜡块分离，造成后续再次切片困难）7）切片盒中切片，干燥后可在室温下长期放置，推荐切片完成后及时进行后期组织染色或组织免疫化学孵育。
石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法
石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法
一、石蜡切片免疫组化技术
石蜡切片免疫组化方法是一种流行的染色技术，它利用抗原特异性抗
体结合抗原将一种特定蛋白质标记出来，然后对组织交叉剥离切片进行染色，得到对特定抗原的特异性染色，进而可以测定组织中其中一蛋白质的
分布情况及其表达水平。
石蜡切片免疫组化方法主要分为热稳定抗原抗体
保护法、热稳定化学法和抗原保护法三种。
1.热稳定抗原抗体保护法
热稳定抗原抗体保护法又称抗原连接法，它是最常用的一种免疫组化
技术，依赖高温对抗原的特殊保护作用。
其原理是经过化学固定的组织切片，在石蜡上产生隆起；然后用高温阳性抗体（双抗体）将抗原完全覆盖，并产生痕迹，这样便可清楚地观察抗原的分布情况；此外，在有抗原保护
的条件下，抗原保护的组织切片可以用客体抗体染色。
2.热稳定化学法
热稳定化学法是一种特殊的抗原保护法，也是最常用的石蜡免疫染色
技术。
组织多色免疫荧光方法
组织多色免疫荧光方法
组织多色免疫荧光方法是一种利用免疫荧光技术，在同一张切片上同时或依次对多个蛋白分子进行染色，展示组织原位多个蛋白标志物的空间分布的技术。
具体步骤如下：
1. 切片脱蜡：将石蜡切片依次放入二甲苯Ⅰ（20min）-二甲苯Ⅱ（20min）-二甲苯Ⅲ（20min）-无水乙醇Ⅰ（5min）-无水乙醇Ⅱ（5min）-95%酒
精（5min）-90%酒精（5min）-80%酒精（5min）-70%酒精（5min），然后蒸馏水浸洗5min。
2. 抗原修复：采用电陶炉加热对切片进行抗原修复，将配置好的修复液（Tris-EDTA缓冲液，）放置于烧杯中高火煮沸，再将脱蜡水化后的组织切片置于烧杯中的耐高温塑料切片架上，液面要浸过切片组织一定高度，此时开始计时，修复时间为15min，此过程中勿使组织干片（修复液要足量）。
到时间后将烧杯从电陶炉面板移出，室温放置40min左右冷却降温，当修
复液降至室温后取出玻片，用PBS（）冲洗3遍，每次3min（冲洗过程中切勿对着组织冲洗，以免弄破组织）。
3. 多标方案建立：根据实验设计，建立多标方案。
4. 制片：按照多标方案进行制片。
5. 多靶标蛋白染色：在同一张切片上同时或依次对多个蛋白分子进行染色。
6. 拍照与扫描：对染色后的切片进行拍照和扫描。
7. HALO病理图像定量分析：利用HALO病理图像分析平台对光谱图像进行定量研究和空间位置关系分析。
以上步骤仅供参考，建议咨询专业人士获取准确信息。
石蜡切片病理、免疫组化及免疫荧光方案
石蜡切片病理、免疫组化及免疫荧光方案石蜡标本固定、脱水、包埋方法大鼠自心脏灌注4%多聚甲醛内固定1-2h后取材：取脑出血血肿处脑组织（厚度约3mm），置于塑料盒中并浸泡在4%多聚甲醛中固定，室温中固定时间12-48h，固定好的组织脱水前应流水冲洗30min-1h左右除去固定液，取固定好的脑组织标本脱水、包埋。
具体步骤按以下方法进行：此方法参考《组织病理学技术》周庚寅北京大学出版社 2006年⏹70%： 1h-2h⏹80%： 1h-2h⏹90%： 1h-2h⏹95%： 1h-2h⏹95%： 1h-2h⏹无水Ⅰ：30min-60min⏹无水Ⅱ：30min-60min⏹二甲苯及水水酒精 1：1混合液 30min⏹二甲苯Ⅰ：30min⏹二甲苯Ⅱ：30min⏹石蜡Ⅰ： 1h⏹石蜡Ⅱ： 1h⏹石蜡Ⅲ： 1h包埋：在病理科包埋方法基础上灵活改进：在包埋铁模具上进行，融蜡-放置组织于中央-扣包埋盒4℃冷却10min-撬蜡。
注意事项：1、固定液的种类：10%中性甲醛，4%的多聚甲醛最合适，在37°或室温中固定12-48h能很好保存抗原和抗体的反应能力，实验室用的更多的是在4℃冰箱中固定24h-3d。
有人建议中性甲醛40摄氏度固定2~3小时，流水冲洗20min-30min，这样可以缩短制片的时间。
2、熔蜡温度65 ℃左右；3、严格按照预定实验步骤进行，保证脱水及透明完全，透明后见云雾状说明脱水不完全，需退回无水酒精中返工。
4、经一级二甲苯透明后检查组织是否透明，二级二甲苯透明时间以具体时间而定。
5、注意及时更换梯度酒精及二甲苯（1月）。
组织石蜡切片摘自《免疫组织化学实验技术及应用》 P12 化学工业出版社20061.载玻片的处理：采用现成的APES处理过的硅化载玻片。
2.石蜡切片注意事项：1、用于免疫组化的蜡温应为56~58℃，切片水温为40℃左右，应先置于冷水中（冷水中可参入酒精有利快速展片-见相关方法），然后再移入热水中，这样可以使切片顺利展平；2、烤片时要注意：一般在62℃烤片30-60min，抗原较强的组织可在60摄氏度烤3~8h，抗原较弱的组织可于37℃的恒温箱内过夜；3、切片如需长期保存，可置于4℃或室温下，千万不可脱蜡后4℃保存，因脱蜡后失去了对抗原决定族的保护。
组织切片免疫荧光染色的具体步骤
组织切片免疫荧光染色的具体步骤1 直接免疫荧光法的操作步骤标本的处理：石蜡切片经脱蜡、梯度酒精脱水后，进行抗原修复，然后用0.01M PBST漂洗5min × 3/次;• 2%BSA或10%BSA 37 C湿盒内封闭30min•抗体染色：C孵育30min；︒–在标本片上滴加适当稀释的荧光标记抗体(1：8或1：16稀释）,放在湿盒中，37• 0.0lmol/L PBS（pH 7。
4) 漂洗5min × 3/次，不时震荡(洗去多余游离的荧光素标记的抗体)。
•缓冲甘油封片–分析纯无荧光的甘油9份+ pH 9.2,0。
2M碳酸盐缓冲液1份配制。
•镜检：在荧光显微镜下观察。
•优点:方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。
•缺点：敏感性偏低;而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体.若检测多种抗原需制备多种相应的荧光标记抗体。
直接免疫荧光法的注意事项μ•对荧光标记的抗体的稀释:要保证抗体的蛋白有一定的浓度；•一般稀释度不应超过1:20,抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。
•染色温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化；–染色时间：从10 min到数小时，一般30 min；C的低温，延长染色时间。
︒C可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用0—2︒C)，高于37︒–染色温度:多采用室温(25C 30 min效果好的多。
︒–低温染色过夜较37•试验时需设置下列对照:–自发荧光对照(空白对照)：标本加0。
01mol/L，pH7.4的PBS代替一抗。
–阳性对照：用已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。
–特异性对照(抑制试验)：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体.•若标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光,阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。
•一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象；•经荧光染色的标本最好在当天观察,随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。
石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法
石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法1、组织的采集、固定和保存：采取组织后，方法一：4%多聚甲醛（4%PFA）4︒C 固定1小时（根据组织大小和致密程度调整固定时间）或过夜方法二：采用bouin’s固定RT 2h（6-8d tesis）or RT 过夜（成年 tesis）PBS缓冲液洗三次，每次5min，4︒C保存于70%乙醇中。
2、组织的包埋、切片、展片及保存：：固定后的样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，52-54︒C石蜡包埋，常规切片，切片厚4 -10μm，贴于处理过的干净载玻片上，37︒C烤片过夜，之后收集于载片盒中，RT密封保存。
石蜡包埋：保存于4︒C 70%乙醇中的组织样品↓80%乙醇 15 min↓95%乙醇 15 min↓100%乙醇 15min ⨯ 2↓1/2乙醇1/2二甲苯 15 min↓二甲苯透明 5-10 min↓1/2二甲苯1/2石蜡 30 min↓石蜡（1） 1.5hr↓石蜡（2） 1.5-2.5hr↓石蜡（3）包埋↓RT保存3、石蜡组织切片的免疫组化方法：密封保存于RT的组织切片↓二甲苯(1) 20 min↓二甲苯(2) 20 min↓100%乙醇 20min↓95%乙醇 10 min↓80%乙醇 10 min↓通风橱晾干，阻水笔在组织周围画圈↓切片在PBS中浸泡 5 min*2↓0.4%Tritonx RT 10 min↓切片在PBS中浸泡 5 min*33%H2O2 RT 10min切片在PBS中浸泡 5 min*30.25%胰酶RT 10min切片在PBS中浸泡 5 min*3Blocking buffer(3%BSA+5%NGS+0.2%Tritonx-100 in PBS) RT 60min倾去blocking buffer，勿洗一抗4︒C overnight in blocking buffer取出切片复温1h，切片在PBS中浸泡 5 min*3二抗in blocking buffer GAR1：200 （GAM1：100），RT 1h切片在PBS中浸泡 5 min*3DAB显色5-10min（50微升A+50微升B+900微升PBS+5微升3%H2O2）如果是增强型DAB只要1min即可。
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石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法
1、组织的采集、固定和保存：
采取组织后，
方法一：4%多聚甲醛（4%PFA）4 C 固定 1 小时（根据组织大小和致密程度调整固定时间）或过夜
方法二：采用bouin ' s 固定RT2h（6-8d tesis ）or RT 过夜（成年tesis ）
PBS缓冲液洗三次，每次5min, 4 C保存于70%乙醇中。
2、组织的包埋、切片、展片及保存：：
固定后的样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，52-54 C石蜡包埋，常规切片，切片厚4 -10 m,贴于处理过的干净载玻片上，37 C烤片过夜，之后收集于载片
盒中，RT密封保存。
石蜡包埋：
保存于 4 C 70%乙醇中的组织样品
80% 乙醇15 min
95%乙醇15 min
100%乙醇15min 2
1/2 乙醇1/2 二甲苯15 min
二甲苯透明5-10 min
1/2 二甲苯1/2 石蜡30 min
石蜡（1）
石蜡（2）
石蜡（3）包埋
RT保存
3、石蜡组织切片的免疫组化方法：
密封保存于RT的组织切片
二甲苯（1） 20 min
二甲苯（2） 20 min
100% 乙醇20min
95% 乙醇10 min
80% 乙醇10 min
通风橱晾干，阻水笔在组织周围画圈
切片在PBS 中浸泡5 min*2
%Trito nx RT 10 min 切片在PBS 中浸泡5 min*3 3%H2O2 RT 10min 切片在PBS 中浸泡5 min*3 佻胰酶RT 10min
如果是增强型DAB 只要1min 即可RT 60min
3%H2O )
Blocki ng buffer(3%BSA+5%NGS+%Trit on x-100 in PBS) DAB 倾去 blocking buffer ，勿洗 一抗 4 C overnight in blocking buffer 取出切片复温1h ，切片在PBS 中浸泡5 min*3 二抗 in blocking buffer GAR1 200 ( GAM1 100)，RT1h 切片在PBS 中浸泡5 min*3 显色5-10min ( 50微升A+50微升B+900微升PBS+5微升
在PBS 中浸泡5 min*3
切片浸入PBS终止显色，HE衬染1s,
玻片架放入泡沫盒，流水冲洗15min,肉眼看到淡淡的紫色即可停止。
若颜色太深，可用盐酸乙醇分色1〜2秒钟(或更久)
脱水85%乙醇 5 min
95% 乙醇5 min
无水乙醇 5 min
无水乙醇5min
二甲苯(1) 10min
二甲苯(2) 10min
中性树胶封片，室温干燥保存
4 、石蜡组织切片的免疫荧光方法：
密封保存于RT的组织切片
二甲苯(1) 20 min
二甲苯（2） 20 min
100% 乙醇20min
95% 乙醇10 min
80% 乙醇10 min
通风橱晾干，阻水笔在组织周围画圈
切片在PBS中浸泡5 min*2
%Trito nx RT 10 min
切片在PBS中浸泡5 min*3
切片在PBS中浸泡5 min*3
敦胰酶RT 10min
RT 60min
PBS中浸泡5 mi n*3
Blocki ng buffer(3%BSA+5%NGS+%Trit on x-100 in PBS)
倾去blocking buffer ，勿洗
一抗 4 C overnight in blocking buffer 取出切片复
温1h，切片在PBS中浸泡5 min*3
荧光二抗in blocking buffer GAR-cy3 1: 1000, GAM-4881: 1000RT 1h
DAPI （1: 1000请根据二抗说明稀释二抗）
切片在PBS中浸泡5 min*3
moil 封片，避光4 C保存。