石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法
1、组织的采集、固定和保存：
采取组织后，
方法一：4%多聚甲醛（4%PFA）4 C 固定 1 小时（根据组织大小和致密程度调整固定时间）或过夜
方法二：采用bouin ' s 固定RT2h（6-8d tesis ）or RT 过夜（成年tesis ）
PBS缓冲液洗三次，每次5min, 4 C保存于70%乙醇中。
2、组织的包埋、切片、展片及保存：：
固定后的样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，52-54 C石蜡包埋，常规切片，切片厚4 -10 m,贴于处理过的干净载玻片上，37 C烤片过夜，之后收集于载片
盒中，RT密封保存。
石蜡包埋：
保存于 4 C 70%乙醇中的组织样品
80% 乙醇15 min
95%乙醇15 min
100%乙醇15min 2
1/2 乙醇1/2 二甲苯15 min
二甲苯透明5-10 min
1/2 二甲苯1/2 石蜡30 min
石蜡（1）
石蜡（2）
石蜡（3）包埋
RT保存
3、石蜡组织切片的免疫组化方法：
密封保存于RT的组织切片
二甲苯（1） 20 min
二甲苯（2） 20 min
100% 乙醇20min
95% 乙醇10 min
80% 乙醇10 min
通风橱晾干，阻水笔在组织周围画圈
切片在PBS 中浸泡5 min*2
%Trito nx RT 10 min 切片在PBS 中浸泡5 min*3 3%H2O2 RT 10min 切片在PBS 中浸泡5 min*3 佻胰酶RT 10min
如果是增强型DAB 只要1min 即可RT 60min
3%H2O )
Blocki ng buffer(3%BSA+5%NGS+%Trit on x-100 in PBS) DAB 倾去 blocking buffer ，勿洗 一抗 4 C overnight in blocking buffer 取出切片复温1h ，切片在PBS 中浸泡5 min*3 二抗 in blocking buffer GAR1 200 ( GAM1 100)，RT1h 切片在PBS 中浸泡5 min*3 显色5-10min ( 50微升A+50微升B+900微升PBS+5微升
在PBS 中浸泡5 min*3
切片浸入PBS终止显色，HE衬染1s,
玻片架放入泡沫盒，流水冲洗15min,肉眼看到淡淡的紫色即可停止。
若颜色太深，可用盐酸乙醇分色1〜2秒钟(或更久)
脱水85%乙醇 5 min
95% 乙醇5 min
无水乙醇 5 min
无水乙醇5min
二甲苯(1) 10min
二甲苯(2) 10min
中性树胶封片，室温干燥保存
4 、石蜡组织切片的免疫荧光方法：
密封保存于RT的组织切片
二甲苯(1) 20 min
二甲苯（2） 20 min
100% 乙醇20min
95% 乙醇10 min
80% 乙醇10 min
通风橱晾干，阻水笔在组织周围画圈
切片在PBS中浸泡5 min*2
%Trito nx RT 10 min
切片在PBS中浸泡5 min*3
切片在PBS中浸泡5 min*3
敦胰酶RT 10min
RT 60min
PBS中浸泡5 mi n*3
Blocki ng buffer(3%BSA+5%NGS+%Trit on x-100 in PBS)
倾去blocking buffer ，勿洗
一抗 4 C overnight in blocking buffer 取出切片复
温1h，切片在PBS中浸泡5 min*3
荧光二抗in blocking buffer GAR-cy3 1: 1000, GAM-4881: 1000RT 1h
DAPI （1: 1000请根据二抗说明稀释二抗）
切片在PBS中浸泡5 min*3
moil 封片，避光4 C保存