色谱技术的研究进展

色谱技术的研究进展

吕晓敏

摘要简要介绍了色谱技术的历史发展，对几种常见的色谱技术和近期发展起来的一些新型色谱技术的研究进展及应用进行了综述，阐述了不同特性色谱技术的发展方向。

关键词色谱技术，进展，应用

引言

色谱技术是几十年来分析化学中最富活力的领域之一。作为一种物理化学分离分析的方法，色谱技术是从混合物中分离组分的重要方法之一，能够分离物化性能差别很小的化合物。当混合物各组成部分的化学或物理性质十分接近，而其他分离技术很难或根本无法应用时，色谱技术愈加显示出其实际有效的优越性。色谱技术最初仅仅是作为一种分离手段，直到20世纪50年代，随着生物技术的迅猛发展，人们才开始把这种分离手段与检测系统连接起来，成为在环境、生化药物、精细化工产品分析等生命科学和制备化学领域中广泛应用的物质分离分析的一种重要手段。目前几乎在所有的领域都涉及到色谱法及其相关技术的应用,色谱技术的应用日益普遍,色谱技术在科学研究和工业生产中发挥着越来越重要的作用。本文介绍了色谱技术的发展及其应用，并对常见的色谱技术和近期发展起来的几种新型的色谱分离技术及不同特性色谱技术的研究进展进行了综述。

1 色谱技术的历史发展[1]

1903年,俄国植物学家M. S. Tswett 发表了题为“一种新型吸附现象及在生化分析上的应用”的研究论文，文中第一次提出了应用吸附原理分离植物色素的新方法。1906年，他命名这种方法为色谱法。这种简易的分离技术，奠定了传统色谱法基础。但由于当时Tswett色谱技术分离速度慢、效率低，长时间内并没有受到当时科学界的重视。

1931年,德国的Kuhn 采用类似Tswett 色谱技术方法分离了胡萝卜素等60多种

色素，在维生素和胡萝卜素的离析与结构分析中取得了重大研究成果，并因此获得了1938年诺贝尔化学奖。也正因为他的出色工作使色谱法迅速为各国科学家们所关注，色谱方法才被广泛应用。

1940年，Martin 和Synge 提出了液液分配色谱法。1952年，James和Martin 发明了气相色谱法，并因此获得了1952年的诺贝尔化学奖。1944年Consden发明的纸色谱和1949 Macllean发明的薄层色谱也一直是用于物质初步分离的简便、快捷的工具。1957年,Golay开创了毛细管气相色谱法。

20世纪60年代末,高压泵和键合固定相应用于液相色谱，导致高效液相色谱的出现。20世纪80年代初，毛细管超临界色谱得到发展，20世纪90年代末得到广泛应用。与此同时，20世纪80年代初由Jorgenson等发展的毛细管电泳，在20世纪90年代得到越来越广泛的应用，在此基础上相继发展了毛细管等电聚焦、毛细管凝胶电泳、毛细管离子电泳及毛细管手性分离等技术。20世纪90年代出现的电色谱，由于其拥有HPLC和CE优点，成为研究的热点。目前，气相色谱和液相色谱仍然是从事研究工作和工业生产实际应用较普遍的色谱法。与此同时，毛细管电泳和电色谱及其他新的色谱技术的应用也日益广泛。

2 气相色谱技术及其应用

2.1 气相色谱[2]

气相色谱法又称气相层析法，是一种采用冲洗法的色谱分离技术,特别适用于生化产品的分离纯化。

气相色谱以气体作为流动相，用固体吸附剂或液体作固定相，它利用试样中各组分在色谱柱中的气相和固定液液相间的分配系数不同，当气化后的试样被载气带入色谱柱中运行时，组分就在其中的两相间进行反复多次的分配(吸附—解吸附或溶解—放出),由于固定相对各组分的吸附或溶解能力不同，因此各组分在色谱柱中的运行速度就不同，经过一定的柱长后,试样中被分离的各组分即能达到完全分离。气相色谱是一种非常好的分离和分析复杂混合物的方法，主要分析在操作温度下能气化而不分解的物质。气相色谱的流动相和样品都必须处理成气体，为此对高沸点化合物、非挥发性物质、热不稳定物、离子型化合物及高聚物的分离，气相色谱不能分析，定性困难，其应用受到一定程度的限制。通常情况下，用气相色谱进行分析和分离更快、更灵敏和更方便。对于气相色谱来说，单纯的气相色谱应用相对要少些，一般是与其他技术联用。

2.2 气相色谱的应用

2.2.1 气相色谱在食品分析中的应用

色谱技术在食品分析中的应用与色谱法的发展史几乎是同步的[3,4]。1952年诺贝尔化学奖获得者英国化学家James和生物学家Martin最早发明气液色谱，就是用来分析脂肪酸等混合物。色谱法的优点是：分离效率高。可分离性质十分相近的物质，可将含有上百种组分的复杂混合物进行分离。近20年来，色谱技术以惊人的速度扩展到食品分析研究领域，许多新的色谱技术已进入实用阶段，如毛细管电脉仪技术(CE)、色谱-质谱联用技术(GC-MS、HPLC-MS、CE-MS 等)、固相萃取技术(SPE)和超临界流体色谱技术 (SFC)以及最新出现的全二维气相色等。这些新技术的综合应用，大大提高了食品中农、兽药残留分析的灵敏度，简化了

分析步骤，提高了分析效率，并使分析检测结果的可靠性得到进一步确证。例如Shne，在海产品、肉类和蜂蜜中氯霉素残留的检测方法研究中，在使用简便的酶联免疫法粗筛后，用GC-ECD 和HPLC-UVD 进行了检测，最后用GC-MS-EI-SIM 和GC-MS-NCI-SMI对检测结果进行确证实验。

2.2.2气相色谱在农药残留检测方面的应用[5]

当今世界把食品安全作为头等大事的情况下，对食品和药物中污染物和有害物质检测技术的研究受到重视。在农作物(包括药用植物)中大量使用杀虫剂、除草剂、除真菌剂、灭鼠剂、植物生长调节剂等，在大大提高农作物产量的同时，也致使在农产品、畜产品中农药残留量超标对人类的健康也带来了很大的负面影响，研究开发快速、可靠、灵敏和实用的农药残留分析技术是控制农药残留、保证食品安全、避免国际间贸易争端的当务之急。农药残留分析是复杂混合物中痕量组分分析技术，农残分析既需要精细的微量操作手段，又需要高灵敏度的痕量检测技术，自20 世纪60 年代以来，气相色谱技术得到飞速的发展，许多灵敏的检测器开始应用，解决了过去许多难以检测的农药残留问题。

2.2.3 气相色谱在药物和临床分析中的应用

尽管在药物及临床分析中HPLC 有很多的应用，但从近几年的文献也可以看出[6]，气相色谱在药物和临床分析中的应用也有很多，实际上气相色谱方法简单易于操作，如果用气相色谱可以满足分析要求，它应该是首选的方法。特别是把GC 和MS 结合起来是一种珠联璧合集分离和鉴定、定性与定量于一体的方法，如果把固相微萃取(SPME)和GC 或GC-MS 结合在一起，又把样品处理及定性与定量于一体，在临床分析中很有意义。

3 液相色谱技术及其应用

3.1 液相色谱

液相色谱是以液体作为流动相的一种色谱分离技术。它利用流动相液体将被分离混合物带入色谱柱中，根据各组分在固定相及流动相中吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子大小的差异进行分离。液相色谱并不受样品的挥发度和稳定性的限制,且非常适合于分离生物药品的大分子、离子型化合物、不稳定的天然产物以及其他各种高分子量的或不稳定的化合物。对于很难分离的样品,用液相色谱常常比用气相色谱容易完成,被广泛应用于石油和化工等领域。目前研究和使用较多的液相色谱主要有高效液相色谱法(HPLC)[7]。

高效液相色谱法是20世纪60年代出现的一种新方法，它从根本上解决了气相色谱技术的不足之处,使得色谱法的应用领域不断扩大。从分离科学的现有水平来看,HPLC 已经成为目前分离和纯化生物大分子最重要和最有效的分析和分离方法，它具有分离效率高、分析速度快、检测灵敏度高和应用范围广的特点，特别适合于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分离分析[8,9]。按操作方式和目的来分，HPLC 可分为分析型和制备型两类。分析型HPLC 的目的是为了获得反映样品组成的信息，而制备型HPLC 的目的是为了获得产品。所以，前者是一种分析工具，后者是一种分离技术。分析型HPLC 和制备型HPLC 所用的操作条件有显著的不同，前者的进样量愈小愈好，且要避免柱超载，后者为了提高产量,柱必须超载。制备型HPLC 是最近几年来引人注目的新型高效分离技术，无论在原理上还是在设备上,都与分析型HPLC 显著不同。目前制备型HPLC 的发展

趋势是开发大规模工业过程。随着生物过程的迅速发展，制备型HPLC 分离技术在生物大分子的分离和纯化领域中,将日益发挥越来越重要的作用。

3.2液相色谱的应用[10,11]

3.2.1维生素D

含量的测定

3

仪器和试剂：日本岛津公司Le-10A液相色谱；SPD-10A紫外-可见分光度检测器；色谱柱C18Shim-pack VP-ODS 150×4.6mm,维生素D

对照品（含量≧99.9%），

3

甲醇为色谱纯，磷酸为分析纯，水为二重蒸馏水。对照品储备液为1.000mg/ml 的维生素D

甲醇溶液。方法和结果：柱温为室温，流速为1ml/min,进样量为10ul,

3

检测波长254nm，同一批次样品，多次检测（见表1）。

表1 不同流动相配比时，维生素D

的含量测定

3

3.2.2叶酸含量的测定

仪器和试剂：日本岛津公司Le-10A液相色谱；SPD-10A紫外-可见分光度检测器；色谱柱C18Shim-pack VP-ODS 150×4.6mm，叶酸对照品（含量≧99.9%），甲醇为色谱纯，磷酸为分析纯，水为二重蒸馏水。方法和结果：柱温为30℃，流速为1ml/min,进样量为10ul,检测波长254nm，同一批次样品，多次检测（见表2）。

表2 不同流动相配比时，叶酸的含量测定

4毛细管电泳技术(CE)及其应用

4.1 毛细管电泳技术

毛细管电泳技术是20世纪80年代发展起来的一种新的电模式分离技术，是一种高效、快速、新型的分离技术,近十年来得到很大发展。1981年,Jor genson 和

Lukacs首先创立了现代毛细管电泳技术。毛细管电泳主要包括胶束电动毛细管色谱(MECC)和毛细管电色谱(CEC) 等，它借助电场进行分离,具有极高的分离效率。由于它可以分离从离子到中性分子、从小分子到生物大分子的一系列化合物,尤其符合以生物工程为代表的生命科学领域内多肽、蛋白质、DNA的分离分析及环境实际样品分析的要求，因此近几年来得到了迅猛发展[12]。

4.2毛细管电泳技术的应用[13]

4.2.1 毛细管电泳法在DNA、核酸大分子中的应用

黎源倩等用聚合酶链反应(PCR)扩增分枝杆菌hsp65基因的长度为439bp的片段，该扩增片段经限制性内切酶BstEⅡ和HaeⅢ酶切后，分别用CE-LIFD装置和常规琼脂糖电泳(AGE)对比检测酶切片段，对PCR 扩增片段的酶切样品的预处理和CE 条件进行了优化，获得了8 种分枝杆菌DNA的限制性内切酶谱图。DNA 片段相对迁移时间的相对标准偏差(RSD)≤36%，结果表明：CE 的分离效能明显高于AGE，是研究DNA 限制性内切酶谱的更有效的检测手段。毛细管电泳法质谱联用（CE-MS）在金属抗癌药物分析方面也取得了一些成就，如Warnke 等用CZE-MS 分离并鉴定了顺铂和DNA的复合物。Timerbaev等用 CEICP /MS 技术研究了铂类药物与人血清白蛋白的相互与作用。苏强、刘清飞等人采用高效毛细管电泳法（HPCE，分离在pH=3.7～9.0的缓冲液中铂配合物与其降解产物，联用电喷雾质谱（ESI MS/MS）检测，研究了新型抗癌铂配合物3,5-二异丙基水杨酸、1,2-环己二胺合铂（Ⅱ）（SM54111）在溶液中的稳定性，证实该新型抗癌铂配合物SM54111 在生理pH 范围的溶液中稳定。

4.2.2 毛细管电泳法在手性药物拆分方面的应用

在多种CE方法中，最简单、直接的方法是将手性选择剂加入背景电解质溶液中，以CZE 的方式进行对映体的分离。张锴等采用环糊精毛细管区带电泳法（CZE）分离6种药物对映体，用高硫酸盐环糊精作手性分离剂，很好地拆分了美沙酮、氯口比格雷、美西律、异丙肾上腺素、苯海索和地佐辛6 种临床常用的碱性药物。张智超等采用毛细管区带电泳法（CZE），分别以HP-β-CD、HS-β-CD 及二者混合物为手性选择剂，研究了美西律、异丙肾上腺素、咳平、苯海索、维拉帕米和扑尔敏等六种药物的对映体分离，比较了HP-β-CD 和HS-β-CD 手性识别能力，并发现使用二元环糊精体系较之使用单一的环糊精，除扑尔敏外，其它五种药物的对映体分离均有十分显著的提高。夏小庆等利用毛细管区带电泳（CZE）在20 mmol/L 的Tris-H3PO4(pH=2.06)加入18C6H4 分离了去甲肾上腺素等八种氨基手性药物，并与用手性柱Crownpak CR(+)的HPLC 法进行了比较，结果表明使用HPCE 法拆分的各物质的分离度Rs 值较大。

4.2.3 毛细管电泳法在中西药复方制剂中的作用

由于中药成分和西药成分各有其作用，因此在现代医药学中通常采用中西药结合的复方制剂，这样既能保持中成药的特性，同时又能发挥西药的快速有效的作用。高苏亚等采用区带毛细管电泳法（CZE），同时分离测定珍菊降压片（一种治疗高血压病的常见药物）中芸香苷、绿原酸、木犀草素、盐酸可乐定和氢氯噻嗪5 种中、西药成分的含量。卢玲等采用高效毛细管电泳法（HPCE）测定仲草胶囊中槲皮素与绿原酸的含量，结果仲草胶囊中槲皮素与绿原酸分别0.01155～0.1848mg/L 和0.01465～0.2344mg/L 浓度范围内线性关系良好，平均回收率分别为100.26%和99.28%。陈恒武等利用毛细管区带电泳法（CZC）快速测定复方布洛芬片中布洛芬和伪麻黄碱含量的方法。在0.0025mol／L 的磷酸盐缓冲液（p

Ｈ=8.1）中，11 次测定含有99.5mg／Ｌ盐酸伪麻黄碱和66.7ｍg／L 布洛芬的试样溶液，相对标准偏差为2.9％（伪麻黄碱）和1.9％（布洛芬），回收率为103.1％（伪麻黄碱）和97.6％（布洛芬），应用毛细管区带电泳法测定复方布洛芬片剂的含量，所得结果与HPLC 法一致。

5 近期发展起来的新型色谱技术

5.1 超临界流体色谱[14]

超临界流体色谱（SFC）是一种以超临界流体作流动相的色谱分离技术。由于超临界流体兼有气体的低黏度和液体的高密度以及扩散系数介于气液之间的

特性,所以它比液相色谱（LC）有更高的分离效率。又由于SFC 常在较低的温度下操作,所以更适合于那些用气相色谱（GC）不便分离的热不稳定性和高分子量化合物的分离、分析。超临界流体的密度比气体大得多，使超临界流体的压力或密度发生变化,可以控制溶质的迁移率和溶质间的选择性，因此，SFC 既具有GC 的主要优点(溶质在流动相中的高扩散系数) ,又具有LC 的主要优点（流动相对溶质的良好溶解能力。从理论上说,无论化合物是极性的、热不稳定性的、化学活泼性的,还是低挥发性的,SFC 都能将它们快速地分离开。它已广泛用于石油产品、农药及其代谢物、食品和香料、聚合物及其添加剂、药物及其代谢物以及各种生物制品的分析和制备中。

5.2 光色谱[15,16]

光色谱是指以激光的辐射压力为色谱分离的驱动力，在毛细管中将待分离组分（或粒子）按几何尺寸的大小予以分离的技术，它是20世纪90年代中期发展起来的新技术，在分离和测定粒子大小及生物化学研究中有较大的应用潜力。随着科学技术的发展，生命科学研究已深入到生物大分子结构，要研究生物大分子结构与功能的奥妙，就必须观测到单个大分子的动态过程，常规的色谱分离技术一般只能得到分子集合体的信息，很难得到单个大分子的信息。1995 年，日本的今板藤太郎等人首次提出光色谱这个概念，标志着一个全新的色谱分离技术的出现。光色谱分离技术的分离对象主要是微米级大分子，可以对高分子聚合物微球、生物细胞、生物大分子, 如蛋白质、肽、DNA、RNA 和线粒体进行分离,并将分离的粒子捕集住再进行有关方面的研究。光色谱首次将激光技术引入分离科学领域, 开辟了分离科学与分子生物学交叉学科的新领域，提供了一种用于研究微米区域内粒子的物理化学及生物学特性的全新方法，给人们分离和研究生物大分子提供了强有力的手段,使人们有可能从复杂的基体中分离出单个大分子并进行研究。光色谱将成为研究分离科学和生命科学的一个非常有生命力的前沿领域，对免疫分析、基因工程、生物医学工程等生命科学领域的研究具有非常重要的意义。

5.3高速逆流色谱[17]

高速逆流色谱（high-speed countercurrent chromatography, HSCCC）是新型的液-液分配色谱技术，它利用多层螺旋管同步行星式离心运动，在短时间内实现样品在互不相溶的两相溶剂系统中的高效分配，从而实现样品分离。HSCCC 最大的优点在于每次的进样量比较大，可以达到毫克量级，甚至克量级；同时，HSCCC是无载体的分离，所以不存在载体的吸附，样品的利用率非常高。HSCCC

仪器价格低廉、性能可靠、分析成本低、易于操作，是一种适用于中药和天然产

物研究的现代化仪器。鉴于HSCCC的显著特点，此项技术已被应用于生化、生物工程、医药、天然产物化学、有机合成、环境分析、食品、地质、材料等领域。

5.4模拟移动床分离技术（SMB）

国内模拟移动床分离技术，与大多新工艺新技术一样，走过了从国外引进到国内开发再到国产化的历程。国内有几家研究机构多年来一直从事模拟移动床技术的开发和应用工作。大庆石化研究院开发出小型(20升分离体积)的实验室装置, 有12柱和24柱结构，以旋转阀作为进出料转换。江南大学开发出中型的麦芽糖醇与多糖醇生产装置，并在山东一家工厂应用。南京工业大学用模拟移动床分离两种中性氨基酸缬氨酸和丙氨酸，并在江阴某企业的L-苯丙氨酸项目中应用。江苏省粮食科学研究设计院南京凯通公司是目前国内较成功的模拟移动床科研与

工业化设备制作的单位，拥有小型SMB 评价装置，可对不同分离剂进行不同用途的评价试验；中型SMB 实验装置，为工业装置的设计提供设计数据；大型的工业生产装置，分离体积大于100m3。所有装置全部选用自控阀取代旋转阀，并且根据生产工艺和产品特性的不同，所采用的分离剂有分子筛和分离树脂；所采用的柱结构有4柱、6柱、8柱、9柱、12柱等, 并已在糖醇行业多家工厂大规模使用，分离的产品有葡萄糖/果糖，葡萄糖/甘露糖，木糖/阿拉伯糖，单糖双糖/大豆低聚糖，麦芽糖醇/多糖醇/山梨醇等。目前国内也有部分糖醇企业采用国外进口的SMB技术和设备，但SMB国产化从技术和经济上是完全可行的[18,19,20]。

6 展望[21]

色谱分离技术的迅速发展，使得色谱分离在实践中从分析规模发展到制备规模和生产规模。在生产过程中，为迎接产品成本、质量标准方面的商业竞争及环境保护压力的挑战，必须进行色谱生产过程放大和操作最佳化方面的探索。在实验室工艺的放大和色谱技术的改进中，目前很大一部分研究工作致力于探索特别适合于大规模连续操作的具有高吸脱附、直接处理含固体颗粒料液能力、低返混性能和连续操作性能等特性的特殊色谱新技术，并已开发出许多具备以上各类特性的不同色谱新技术。每种色谱技术都具有不同的优缺点和特性,因而发展能直接处理含固体物料、吸脱附性能高、能进行大规模生产等综合特性的连续操作色谱技术一直是人们所期望的。各种色谱技术的相互贯通，再加上合适的吸附剂、设备及与其他技术的结合，将使该技术在生化工业中以降低成本、简化操作而产生广泛的吸引力，其中模拟移动床SMB 技术的发展最引人注目，它将成为色谱技术在规模工业生产上应用的一个主要发展方向。在色谱柱型方面，目前普遍采用的是经典的色谱柱，而毛细管柱非常适用于痕量分析，且分析速度快、样品消耗少，是未来色谱柱型发展方向之一。

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