实验四：鱼类细胞培养基础知识
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六、实验步骤
3、D-Hanks缓冲溶液： 称取8gN aCl， 0.4gKCl,0.06gNa2HPO4,0.06gKH2PO4, 0.35gNaHCO3溶解于1000mL去离子水中 ，高压灭菌，4℃保存。
六、实验步骤
鱼类细胞的组织培养法 1．取材： 迅速处死动物，无菌分离肝脏, 置D-Hanks液中,冲洗肝脏至灰白色。
六、实验步骤
3．观察 置于37℃培养的细胞．需逐日进 行观察．主要观察： (1)培养物是否被污染，如培养液变为黄色 且混浊，表示该瓶被污染。 (2)细胞生长状况与培养液颜色的变化，如 培养液变为紫红色，一般细胞生长不好。 可能是瓶塞未盖紧或营养液pH过高。
六、实验步骤
待细胞已基本长成致密单层时，此时即可 进行传代培养了。
六、实验步骤
2.接种、培养：将肝脏剪成1mm×1mm×1mm 的组织块,用D-Hanks液洗3次,去掉血细胞,37℃下 用0.25%的胰蛋白酶消化10min,倒掉消化液后用 D-Hanks液洗2次,培养液洗2次,将肝组织块贴壁 于组织培养瓶中,每个培养瓶放组织块20～25块 。
加少许培养液,将培养瓶倒转置于培养箱中,在 37℃条件下培养,2h后补充培养液,并翻转培养基 继续培养。
七、注意事项
细胞培养要求无菌操作。无菌是细胞培养 成功的首要条件。 重视进人无菌室操作前必须将培养瓶外表 消毒提防试剂瓶中的液体浸湿瓶盖, 这往往 是试验污染的重要因素之一。
八 鱼类细胞原代培养意义
鱼类培养细胞作实验验对象，有着活体鱼 无法比拟的优点： (I)成本低，细胞系的维护不需要大型的养 殖设备和大量的换水与换气。 (2)重复性好，实验条件可以精确控制。因 此，对鱼类细胞系进行深入研究，无论在 理论研究方面，还是在实际应用方面，都 具有深远意义。
（4）酶消化法 该法是目前采用极为广泛的方法, 适用于绝大多数组织器官。所用的酶主 要是胰酶, 常用浓度是0.25%。根据酶消化时温度的不同, 又可进一步分为冷消化 法及热消化法。
三、实验目的
1、掌握动物细胞培养缓冲液、消化液的 配置。 2掌握动物细胞原代培养的基本过程。
四、实验试剂
DMEM培养基 胰蛋白酶 Hanks缓冲液 抗生素溶液 牛血清 70%乙醇 去离子水
五、实验用品
器材： 解剖剪、解剖镊、培养皿、量筒、 试管、锥形瓶、吸管、橡皮头、培养瓶(小 方瓶或中方瓶)等。
上述器材均须彻底清洗、烤干、包装好，
六、实验步骤
培养液的配置 1、DMEM培养液的配置：将1袋袋装的干 粉溶解于1L去离子水中，加3.7gNaHCO3, 溶解，调节PH7.2,过滤除菌，4℃保存。 2、双抗溶液的配置：将青霉素、链霉素溶 解于生理盐水中，至青霉素最终浓度为 100U/mL。
八 鱼类细胞原代培养意义
在对细胞的营养需求有比较深人认识的基础上, 化学成分明确的无蛋白培养基已被用于中国仓鼠 卵巢细胞汇和杂交瘤细胞的培养。虽然鱼类细胞 培养中尚未成功应用无血清培养技术, 但在这方 面的研究已有一定基础,相信在不久的将来鱼细胞 培养技术会有所突破, 更广泛地应用于研究领域 。
实验四 动物细胞培养基的配置和 原代培养
一 实验项目简介
1、实验学时 6学时 2 实验过程： A动物细胞培养液的配置
B采用组织培养法培养鱼类细胞
二、实验原理
原代细胞培养是指直接从动物体内获取的 细胞、组织或器官，经体外培养后，直到 第一次传代为止。这种培养，首先用无菌 操作的方法，从动物体内取出所需的组织( 或器官)，经消化，分散为单个游离的细胞 ，在人工培养下，使其不断的地生长及繁 殖。 细胞培养是一种操作繁琐而又要求十 分严谨的实验技术。
鱼类细胞组培的一些方法：
（1）组织块固定法 当组织量较少时可采用此法。它是将组织剪成约一立方毫米的小块, 按一 定比例将组织块贴在瓶壁上, 至少三十分钟以上, 然后轻轻加人营养液置温箱培养 。 （2）机械分散法 此法适用于细胞间连接较松散的组织, 如胚胎组织及幼鱼全鱼。将组织剪 成约一立方毫米耐的小块, 放入底部有一铜网的注射器内, 用手的压力将组织挤出 网孔, 最后将分散的组织吹打后加人营养液分装培养。 （3）络合剂分散法 目前使用的络合剂主要是乙二胺四乙酸, 它能与细胞间钙离子、镁离子结 合而使细胞连接松散, 经吹打即可分散。该法目前主要用于囊胚细胞培养及上皮 型细胞系的传代。
六、实验步骤
3、D-Hanks缓冲溶液： 称取8gN aCl， 0.4gKCl,0.06gNa2HPO4,0.06gKH2PO4, 0.35gNaHCO3溶解于1000mL去离子水中 ，高压灭菌，4℃保存。
六、实验步骤
鱼类细胞的组织培养法 1．取材： 迅速处死动物，无菌分离肝脏, 置D-Hanks液中,冲洗肝脏至灰白色。
六、实验步骤
3．观察 置于37℃培养的细胞．需逐日进 行观察．主要观察： (1)培养物是否被污染，如培养液变为黄色 且混浊，表示该瓶被污染。 (2)细胞生长状况与培养液颜色的变化，如 培养液变为紫红色，一般细胞生长不好。 可能是瓶塞未盖紧或营养液pH过高。
六、实验步骤
待细胞已基本长成致密单层时，此时即可 进行传代培养了。
六、实验步骤
2.接种、培养：将肝脏剪成1mm×1mm×1mm 的组织块,用D-Hanks液洗3次,去掉血细胞,37℃下 用0.25%的胰蛋白酶消化10min,倒掉消化液后用 D-Hanks液洗2次,培养液洗2次,将肝组织块贴壁 于组织培养瓶中,每个培养瓶放组织块20～25块 。
加少许培养液,将培养瓶倒转置于培养箱中,在 37℃条件下培养,2h后补充培养液,并翻转培养基 继续培养。
七、注意事项
细胞培养要求无菌操作。无菌是细胞培养 成功的首要条件。 重视进人无菌室操作前必须将培养瓶外表 消毒提防试剂瓶中的液体浸湿瓶盖, 这往往 是试验污染的重要因素之一。
八 鱼类细胞原代培养意义
鱼类培养细胞作实验验对象，有着活体鱼 无法比拟的优点： (I)成本低，细胞系的维护不需要大型的养 殖设备和大量的换水与换气。 (2)重复性好，实验条件可以精确控制。因 此，对鱼类细胞系进行深入研究，无论在 理论研究方面，还是在实际应用方面，都 具有深远意义。
（4）酶消化法 该法是目前采用极为广泛的方法, 适用于绝大多数组织器官。所用的酶主 要是胰酶, 常用浓度是0.25%。根据酶消化时温度的不同, 又可进一步分为冷消化 法及热消化法。
三、实验目的
1、掌握动物细胞培养缓冲液、消化液的 配置。 2掌握动物细胞原代培养的基本过程。
四、实验试剂
DMEM培养基 胰蛋白酶 Hanks缓冲液 抗生素溶液 牛血清 70%乙醇 去离子水
五、实验用品
器材： 解剖剪、解剖镊、培养皿、量筒、 试管、锥形瓶、吸管、橡皮头、培养瓶(小 方瓶或中方瓶)等。
上述器材均须彻底清洗、烤干、包装好，
六、实验步骤
培养液的配置 1、DMEM培养液的配置：将1袋袋装的干 粉溶解于1L去离子水中，加3.7gNaHCO3, 溶解，调节PH7.2,过滤除菌，4℃保存。 2、双抗溶液的配置：将青霉素、链霉素溶 解于生理盐水中，至青霉素最终浓度为 100U/mL。
八 鱼类细胞原代培养意义
在对细胞的营养需求有比较深人认识的基础上, 化学成分明确的无蛋白培养基已被用于中国仓鼠 卵巢细胞汇和杂交瘤细胞的培养。虽然鱼类细胞 培养中尚未成功应用无血清培养技术, 但在这方 面的研究已有一定基础,相信在不久的将来鱼细胞 培养技术会有所突破, 更广泛地应用于研究领域 。
实验四 动物细胞培养基的配置和 原代培养
一 实验项目简介
1、实验学时 6学时 2 实验过程： A动物细胞培养液的配置
B采用组织培养法培养鱼类细胞
二、实验原理
原代细胞培养是指直接从动物体内获取的 细胞、组织或器官，经体外培养后，直到 第一次传代为止。这种培养，首先用无菌 操作的方法，从动物体内取出所需的组织( 或器官)，经消化，分散为单个游离的细胞 ，在人工培养下，使其不断的地生长及繁 殖。 细胞培养是一种操作繁琐而又要求十 分严谨的实验技术。
鱼类细胞组培的一些方法：
（1）组织块固定法 当组织量较少时可采用此法。它是将组织剪成约一立方毫米的小块, 按一 定比例将组织块贴在瓶壁上, 至少三十分钟以上, 然后轻轻加人营养液置温箱培养 。 （2）机械分散法 此法适用于细胞间连接较松散的组织, 如胚胎组织及幼鱼全鱼。将组织剪 成约一立方毫米耐的小块, 放入底部有一铜网的注射器内, 用手的压力将组织挤出 网孔, 最后将分散的组织吹打后加人营养液分装培养。 （3）络合剂分散法 目前使用的络合剂主要是乙二胺四乙酸, 它能与细胞间钙离子、镁离子结 合而使细胞连接松散, 经吹打即可分散。该法目前主要用于囊胚细胞培养及上皮 型细胞系的传代。