实验四：鱼类细胞培养基础知识
实验三_鱼类原代细胞的制备与培养(组织块法)
实验三鱼类原代细胞的制备与培养（组织块法）姓名：程辉辉学号：2014308110001【实验目的】掌握贴壁细胞原代培养的方法；熟悉贴壁细胞原代培养流程【实验原理】细胞培养可分为原代培养和传代培养两种。
原代培养是直接从生物体获取和切割成微小的组织块，然后贴附于培养瓶底部，并有培养液供给营养，在合适的温度中孵育，让其慢慢地长出细胞来，以获得大量均一的细胞，为以后传代培养创造条件。
【器材、材料与试剂】（一）仪器生化培养箱，倒置显微镜，超净台，加液枪。
（二）材料培养瓶，平皿，5m L移液管，15ml、50ml离心管，纱布块，穿刺针，废液缸，手术剪镊，无菌解剖刀，75%酒精，50ml小烧杯，试验幼鱼。
酒精棉球，酒精灯，橡皮头，软管，记号笔。
（三）试剂AIM：90 mL培养液+ 5 mL GPS（10×）+5 mL两性霉素B（250μg/mL）+1 mL硫酸庆大霉素（50 mg/mL）混合，4℃保存；原代培养液：80 mL培养液+2 mL GPS (10×)+20 mL FBS+ 表皮生长因子EGF（2μg/mL）+ 成纤维生长因子FGF（25 ng/mL）混合，4℃保存；传代培养液：90 mL培养液+1 mL GPS (10×)+10 mL FBS混合，4℃保存【实验步骤】工作前打开紫外灯，消毒30分钟；入无菌室之前用肥皂洗手（或带手套），用75%的酒精擦拭消毒双手；超净台面应整洁，用75% 酒精喷洒，纱布擦净；所有试剂瓶等培养用具需用酒精擦拭后放入超净台。
将灭菌的手术器械（解剖刀2把，镊子一把，眼科镊一把，眼科剪一把）插入盛有75%酒精的玻璃小烧杯中浸泡和备用。
以下操作均在超净台里。
首先用5ml 移液管吸AIM（消毒培养液）到无菌平皿中。
1. 杀幼鱼与消毒体表：将小幼鱼置于75%酒精中，浸泡30秒。
2. 取鳔：继续用消毒纱布托住鱼体，用手术剪取鳔，并置于盛有AIM培养基的培养皿（1）内浸泡消毒，写上组织编号。
海洋生物技术
绪论一．海洋生物技术定义：运用海洋生物学与工程学的原理和方法，利用海洋生物或生物的代谢过程生产有用物质或定向改良海洋生物遗传特性的综合科学技术。
二．重点发展领域：1.发育与生殖生物学基础2.基因组学与基因转移3.病原生物学与免疫4.生物活性及其产物5.海洋环境生物技术三．最新研究进展：动物细胞培养一、细胞培养：从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。
二、细胞培养基本过程：取动物胚胎或幼龄动物器官、组织。
将材料剪碎，并用胰蛋白酶（或用胶原蛋白酶）处理（消化），形成分散的单个细胞，将处理后的细胞移入培养基中配成一定浓度的细胞悬浮液。
悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，成为细胞贴壁。
当贴壁细胞分裂生长到互相接触时，细胞就会停止分裂增殖，出现接触抑制。
此时需要将出现接触抑制的细胞重新使用胰蛋白酶处理。
再配成一定浓度的细胞悬浮液。
另外，原代培养就是从机体取出后立即进行的细胞、组织培养。
当细胞从动植物中生长迁移出来，形成生长晕并增大以后，科学家接着进行传代培养，即将原代培养细胞分成若干份，接种到若干份培养基中，使其继续生长、增殖。
通过一定的选择或纯化方法，从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质的细胞称为细胞株。
当培养超过50代时，大多数的细胞已经衰老死亡，但仍有部分细胞发生了遗传物质的改变出现了无限传代的特性，即癌变。
此时的细胞被称为细胞系。
三、原代培养：从供体取得组织细胞后在体外进行首次培养四、传代培养：即将原代培养细胞分成若干份，接种到若干份培养基中，使其继续生长、增殖五、细胞株：通过一定的选择或纯化方法，从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质的细胞六、细胞系：原代培养的细胞顺利传至40--50代，并保持原来染色体的二倍体数量及接触抑制的行为，这种传代细胞成为细胞系动物细胞融合技术1.细胞融合：是在自发或人工诱导下，两个不同基因型的细胞或原生质体融合形成一个杂种细胞。
动物细胞培养及海水鱼类细胞系的建立-中山大学
原代细胞的分离和制作
人或动物体内（或胚胎组织）由于多种细胞结合紧密，不利于各个细 胞在体外培养中生长繁殖，即使采用1mm3的组织块，也只有少量处于 周边的细胞可能生存和生长，若需获取大量细胞，必须将现有的组织块 充分散开，使细胞解离出来，常采用的方法如下：
一、悬浮细胞的分离方法
组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方 法是采用1000r/min的低速离心10分钟，若悬液量大，可适当延长离心时 间，但速度不能太高，延时也不能太长，以避免挤压或机械损伤细胞， 离心沉淀用无钙、镁PBS洗两次，用培养基洗一次后，调整适当细胞浓 度后再分瓶培养，若选用悬液中某些细胞，常采用离心后的细胞分层液， 因为，经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这 样可根据需要收获目的细胞 ．
12
二、实体组织材料的分离方法
（一）机械分散法
所取材料若纤维成分很少，如脑组织，部分胚胎组织可采用剪刀剪切、用吸管吹打分 散组织细胞或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内（用九号针），使细胞通过针头 压出，或在不锈钢纱网内用钝物压挤（常用注射器钝端）使细胞从网孔中压挤出。此 法分离细胞虽然简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差。此法仅适 用于处理纤维成分少的软组织。
肿瘤学、病毒学、分子生物学
等领域已得到广泛的应用。
3
动物细胞培养基本流程
剪碎，胰蛋白酶
动物组织 分离细胞
单个细胞 原代培养
原代细胞 传代培养
细胞株 （遗传物质没有发生改变）
细胞系 （遗传物质发生改变） 4
细胞培养的材料准备 1 细胞培养液 2 胰酶消化液 3 PBS缓冲洗涤液 4 洁净无菌的细胞培养瓶、培养板
5
细胞培养基应用选择精要
鱼类人工繁殖生物学基础
投资成本高
鱼类人工繁殖需要建设养殖设施 、引进种鱼、购买饲料等，投资 成本较高。
收益周期长
鱼类人工繁殖需要经过较长时间 才能获得收益，且市场价格波动 较大，投资风险较高。
前景展望
1 2
技术创新推动产业发展
随着科学技术的不断进步，鱼类人工繁殖技术将 不断得到改进和完善，推动产业的持续发展。
市场需求持续增长
提高渔业产量
产量增加
通过人工繁殖技术，可以在较短的时间内获 得大量的鱼苗，进而提高渔业产量。这对于 满足市场需求、增加渔民收入以及促进渔业 发展具有重要意义。
养殖效益
人工繁殖的鱼苗品质较高，生长速度快，且 具有较强的抗病能力。这使得养殖效益得到 显著提升，降低了养殖成本，增加了养殖户 的收益。
改良鱼类品种
鱼苗培育
当鱼苗孵化后，进行鱼苗的培育和管理，包括饲料的选择和投喂、 水质的调节等，以确保鱼苗健康成长。
03 鱼类人工繁殖的环境因素
水温控制
总结词
水温是影响鱼类生长、繁殖和生存的重要环境因素。
详细描述
不同鱼类对水温的要求不同，适宜的水温可以促进鱼类的新陈代谢和生长，提高繁殖成功率。在人工繁殖过程中， 需要严格控制水温，模拟自然环境下的温度变化，以适应不同鱼类的需求。
将受精卵收集到适当的容器中，并保持适当的温度和 湿度。
胚胎观察
定期观察胚胎发育情况，记录胚胎发育的各个阶段。
胚胎培养条件
调节水温和水质等环境因素，以满足胚胎发育的需求。
鱼苗孵化技术
孵化容器
选择适当的孵化容器，以满足鱼苗孵化所需的水量和氧气需求。
孵化管理
定期更换水，保持水质的清洁和氧气的充足，同时监测鱼苗的生长 情况。
环境因素调节
动物细胞工程基础实验
25
配制液体培养基
1. 将培养基干粉（PRMI-1640）倒入1000 mL烧杯，加 800mL三蒸水，玻棒搅拌充分溶解；再加入加1.8g HEPES和2.2g碳酸氢钠，玻棒搅拌充分溶解，溶液呈 橙色（弱酸性，pH在7.0左右）；再倒入1000 mL容量 瓶，用三蒸水定容至刻度。
9. 接种细胞：吸取4 mL上述的细胞悬液，加入原细胞 培养瓶中，接种后2个培养瓶中的悬液各4 mL；
10. 静置培养：盖上瓶盖，拧紧，标记（包括细胞名称、 代数、传代日期），放入常规的生化培养箱静置培 养；
11. 观察细胞：每天观察细胞生长状况，并确定是否进 行第2代的传代。
36
EPC细胞（消化前）
2. PBS用于2胰蛋白酶溶液和3 EDTA溶液的配制，余下高 压灭菌备用；
3. 将PBS分装入试剂瓶中，瓶盖转松，牛皮纸包紧，橡皮 筋加固，装入提篮，121℃，20min灭菌；
4. 自然干燥冷却后，4℃保存备用。
23
配制胰蛋白酶（0.25%）
1. 称取0.625g胰蛋白酶于250 mL烧杯，加入1配制 的PBS 200 mL，玻棒搅拌充分溶解后，倒入250 mL容量瓶中，用PBS定容至刻度。
3. 胰蛋白酶（Trypsin）可将贴壁的细胞从培养瓶壁上消 化下来，通常使用浓度为0.25%或0.125%。
4. EDTA溶液 用于清洗细胞表面，螯合Ca2+等二价离 子，使细胞易于为胰蛋白酶消化。
20
海洋生物资源
应用： • 1、蓝藻：将模型藻获得的实验应用到已经实现产
业化生产的经济种类，如螺旋藻中··· • 2、真核藻：以单细胞绿藻（莱茵衣藻··）为主，
完成稳定转化。 • 3、大型海藻：特别是经济种类，如海带和紫菜的
遗传转化。
目的二：构建藻类表达系统来大量廉价生产蛋白和药 物，以及生物燃料、降解污染物等。
?一利用海洋生物自身的生化反应机制生产目的产品的技术如用微藻生产某些药物?二利用含有海洋生物基因的微生物进行发酵生产海洋生物制品的技术如用酵母菌生产鱼类生长激素四海洋微生物技术海洋微生物广泛存在于浅海区域外海水域及深海海底等各类环境中
一、海洋生物资源定义 二、分类 三、地理分布 四、海洋生物资源的多样性利用 五、海洋生物资源的开发技术
四、海洋生物资源的利用— 人类利用海洋生物多样性
海洋生物多样性为人类生存和发展作出 了重要贡献，不仅为人类提供了丰富的食品， 是人类思维创新意识的源泉，并为人类可持续 发展奠定了扎实的基础。 主要应用——
（一）美味海鲜从海里来 （二）海洋生物是丰富的新药源 （三）来自海洋生物的美容品 （四）生物多样性为人类提供创新思维
• 4、建立了海带和裙带菜配子体无性系微繁殖，用 配子体取代游离孢子作种源的细胞工程育苗技术。
３、染色体操作
染色体组工程，是指用生物或物理化学方 法改变有性生殖生物原有的染色体组的技术。
1、中国科学院南海海洋研究所开展了珠母贝倍 性育种研究，已经导出三倍体珠母贝，生长速度 和珍珠质量都较二倍体母贝有明显提高。
（一）美味海鲜从海里来
人们嗜好海鲜美食，都是海里提供的动 植物，诸如虾、蟹、螺、贝、海参、鱼类及 海带、紫菜等，由于味道十分鲜美，人们常 常向往吃一顿海鲜以改善口味。
海洋美食的优点——
鱼类育种学概述
鱼类育种学概述摘要：鱼类遗传育种的途径和范围是非常广泛的，包括常规的选择育种、杂交育种、多倍体育种以及新近发展起来的细胞工程育种和转基因育种。
本文就这些方面对鱼类的育种进行综述。
关键词：选择育种杂交育种多倍体育种细胞工程育种转基因育种鱼类育种是对野生或现有品种进行遗传改造，创造自然界所未有的鱼类新品种，是对鱼类多样性和物种进化的贡献。
20世纪70年代以后，鱼类育种与细胞工程和基因工程等新高生物技术的结合，使这一研究领域很快出现生机，冲破了多年来常规的选择育种和杂交育种在育种多样性和快速高效等方面的制约。
我国较大规模开展鱼类遗传育种研究的历史仅有20多年。
短短20多年来，不但在育种技术方面取得了重大进步，建立了杂交、倍性、细胞工程以及基因工程等多种育种技术，并逐渐形成了多种技术综合配套的技术路线。
通过传统的育种技术和现代的育种技术成功地培育出新的鱼类品种，如工程鲫、工程鲤等，不断向社会推出了许多具有重要经济价值的养殖新对象，大大提高了鱼类的生产力，丰富了鱼类的遗传多样性。
鱼类遗传多样性的丰富反过来又可增加鱼类生产量和改良鱼类品种，因此，保护基因多样性和可持续的利用是人类维持基本的生命过程和生命支持系统的基础。
1 选择育种选择育种是育种工作的一个最基本的手段[1,2]。
改变育种对象遗传性质的常规方法有两种：一是挑选作为亲本用的个体，这就是选择。
另一个是控制亲本的交配方式，这就是遗传操作。
在鱼类生长发育的各个阶段，可以有目的地选择具有优良性状的个体，淘汰品质不良的个体，这种方法可以避免由于鱼类人工繁殖所产生的近亲交配而随之引起的退化现象。
目前，系统选育的方法通常有4种：(1)混合选种(又称集团选种)，即从生产效果最好的池塘中选出鱼群，这种方法在鱼类的各个发育阶段都可进行；(2)家系选种(又称窝选)，即从一雌一雄选亲配合建立家系开始，在其后代中一代一代进行高度的近亲交配，以累代实行严格的全同胞交配为基础，依据个体表型值，兼顾家系平均值，进行选择留种；(3)亲本选种，又称后裔鉴定选种，即根据后代质量而对亲本作出评价的个体选择方法，根据后裔鉴定结果决定对亲本的取舍；(4)综合选种，即综合上述几种选种方法进行的选择育。
近10年鱼类细胞培养研究进展及应用展望
近10年鱼类细胞培养研究进展及应用展望
张博;陈松林
【期刊名称】《海洋科学》
【年(卷),期】2011(035)007
【摘要】鱼类细胞培养作为一种重要的研究手段，广泛应用于病毒学、环境毒理学、细胞生物学、肿瘤学、基因组学、遗传学以及资源保护等方面的研究。
鱼类细胞作为实验对象，有着活体鱼无法比拟的优点：（1）成本低，细胞系的维护不需要大型的养殖设备和大量的换水与充气；（2）重复性好，实验条件可以精确控制。
因此，对鱼类细胞系进行深入研究，
【总页数】9页(P113-121)
【作者】张博;陈松林
【作者单位】中国水产科学研究院黄海水产研究所,农业部海洋渔业可持续发展重
点开放实验室,山东青岛266071;中国水产科学研究院黄海水产研究所,农业部海洋
渔业可持续发展重点开放实验室,山东青岛266071
【正文语种】中文
【中图分类】Q2
【相关文献】
1.鱼类细胞培养及其在病毒学研究中的应用 [J], 李文峰;麦康森;黄倢;史成银
2.鱼类神经坏死病毒的检测与细胞培养技术研究进展 [J], 彭智发;龚艳清;陈信忠
3.鱼类细胞培养技术研究进展 [J], 艾庆辉;李庆飞;麦康森
4.鱼类细胞培养的研究与应用 [J], 姜泽东; 周伯文; 段晶晶
5.鱼类细胞培养的方法、条件及应用研究概述 [J], 龙舒婷;罗鹏佗;张永馨;李旭艳因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
实验四动物细胞的传代培养
实验四动物细胞的传代培养实验四动物细胞的传代培养1. 实验⽬的（1）了解动物细胞培养的基本知识。
（2）了解体外培养细胞的的基本形态类型；学会通过镜检判定体外细胞⽣长的状态。
（3）掌握动物细胞的传代培养法。
2.实验背景与原理2.1 动物细胞培养的基本概念（1）组织培养：把来⾃机体内的细胞、组织或器官放在类似于体内的外环境中，使之成活、⽣长和繁殖。
严格⼜分为细胞培养、组织培养和器官培养。
值得注意的是和植物组织培养不同，⽬前动物组织培养在⼀般培养条件下难以维持组织的结构和功能，常最终转变成为细胞培养，所以动物细胞与组织培养并⽆严格区别。
（2）原代培养：直接从供体取来的细胞，组织或器官进⾏的初次培养。
通常把第⼀代⾄第⼗代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。
（3）传代培养：原代培养物长成单层细胞，达到⼀定密度时，营养消耗殆尽，需要补充营养，分开扩⼤培养，使之继续增殖。
注意的是传代的这个“代”与细胞分裂的⼀个世代不同，⼀代细胞约分裂3~5次，不要混淆。
（4）细胞系：原代培养后的细胞经传代即可成为细胞系。
若其形态均⼀，⽣长增殖稳定，⽣物性状明确，即可称之为已鉴定的细胞（Certified Cells）。
不同种类的细胞成系的难易程度也不同，⼀般胚胎、更新组织的细胞如造⾎、上⽪等以及癌细胞较容易成系，⽽神经等细胞则较难成系。
按照其⽣存期可分为有限细胞系（⽣存期有限的正常⼆倍体细胞）和⽆限细胞系（⽣存期⽆限的癌细胞、转化细胞等，⼤多异倍体）2.2 动物细胞培养的基本条件体外培养细胞的条件总原则就是要尽可能模拟细胞在体内⽣长的环境，因此必要的营养、适宜的胞外环境以及严格的⽆菌条件是主要的三个⽅⾯。
（1）营养：早期培养主要采⽤天然的⽣物性液体，但其成分不确定，难以控制营养成分。
现⼴泛使⽤的是化学成分明确的各种商品化的合成培养基，其主要成分包括各种氨基酸、维⽣素、⽆机盐、葡萄糖等必要的营养物质。
培养基中还含有酚红指⽰剂，使培养基的颜⾊可显⽰细胞⽣长状态。
鱼类细胞原代培养及其Giemsa形态、MTT增殖分析、细胞计数
血细胞原代培养及其形态、增殖分析1材料1.1试剂、药品培养基配制：血清使用时临时添加，培养基为DMEM培养基添加双抗。
双抗(青霉素、链霉素)终浓度均为100μg/ml。
血清为临时添加，终浓度为20%。
巯基乙醇：根据换算0.1mM的1L溶液须0.7ul巯基乙醇。
换言之，以巯基乙醇与双蒸水按70ul：930ul比例配置为母液，每100ml培养基仅需1ul双抗：先各取0.5g溶于50ml无菌双蒸水中，此时其浓度为0.1mg/ml= 10,000μg/ml,分装入250ulEP管中，此部切记EP管架。
使用时每1ml加10μL即100μg/mL。
剩余-4°冻存。
鉴于各组分均为使用时添加，故不进行单独过滤除菌。
培养基分装于250mL试剂瓶，血清分装于50mL试剂瓶。
PBS：NaCl:8g；KCl:2g; Na2HPO4·7H2O:1.15g（如果是12水合则为1.44g）; KH2PO4:0.2g 加水定容至1L，高压灭菌。
操作中使用一次性10ml滴定管，移液器1mL，100μL。
胰酶：以PBS添加0.25%胰酶配制。
过滤除菌，此步须注射一次性过滤器0.2微米。
肝素钠：取肝素钠100mg溶于10mL生理盐水中（0.9%NaCl），以10ml离心管盛装，过滤除菌。
麻醉剂：5ml丁香酚与5ml无水乙醇混溶，冻存液：无色甘油或DMSO加入含20%FBS培养基中，终浓度为10%MTT：取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS），用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可Wright-Giemsa：取两样各0.5g，甲醇500ml，配成染液台盼蓝染色液：4%台盼蓝母液，取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml滤纸过滤，4°保存。
使用时用PBS稀释至0.4%。
1.2器材离心机1、15、50ml离心管1.5、15、50ml脱脂棉、纱布、锡箔纸血细胞计数板、细胞计数器培养容器：96孔、24孔板，一次性细胞培养瓶、一次性培养皿30、60mm、载玻片、盖玻片倒置显微镜（可拍照）细胞培养箱酒精喷壶5ml、15ml一次性注射器1000、500、250ml、100、50ml试剂瓶一次性针头过滤灭菌器0.22um2方法2.1细胞培养：此步需要1ml、100ul移液枪，无菌蓝枪头1ml，无菌黄枪头100ul，2ml灭菌EP管，EP管架，5ml注射器，封口膜，无菌纱布，酒精棉球，酒精灯，打火机，酒精喷壶，一次性培养瓶，塑料餐盒。
鱼类细胞培养的方法、条件及应用研究概述
鱼类细胞培养的方法 条件及应用研究概述龙舒婷#罗鹏佗#张永馨#李旭艳"#!广东省岭南师范学院生命科学与技术学院#湛江#2"4%%%#摘#要#鱼类细胞培养主要有组织块法和胰酶消化法$不同的鱼类细胞对培养基%GP以及温度等的要求不同&本文概述鱼类细胞的培养方法%条件以及应用研究进展$为鱼类细胞培养研究提供基本参考资料&关键词#鱼类细胞培养#组织块法#胰酶消化法#培养条件##细胞培养是指将机体内的某一组织分离$以组织小块的形式$或将组织块粉碎成单个细胞$以单细胞形式在人工培养条件下使其存活%生长和增殖的技术&细胞培养分原代细胞培养和传代细胞培养&鱼类的许多组织都可以用来进行细胞培养$已经建立了许多细胞株或细胞系$但不同的鱼类以及同种鱼类的不同器官细胞培养的方法和条件都各不相同&!"鱼类细胞培养的方法主要介绍组织块法和胰酶消化法&!/!#组织块法#组织块法主要用于培养所用材料较少时的细胞培养&培养时$只要将组织块剪成小块$转移至培养瓶$就能在合适的环境下进行培养$如锦鲤的鳍条%肌肉和心脏细胞'!(%以及黄颡鱼的吻端细胞'"($都可以用此法来培养&!/"#胰酶消化法#胰酶消化法的实施步骤是用胰酶溶液处理组织$再经水浴加热消化$使组织细胞分离$并将经过过滤等方法获得的分离细胞样品接种到培养瓶里进行培养&如中华鳑鲏鱼的皮肤细胞'&(%鲤鱼的上皮细胞'4(%黄鳍鲷的肝脏细胞'2(都可用此法进行培养&#"鱼类细胞培养的条件主要介绍鱼类细胞培养的培养基%温度和GP&"/!#培养基#培养基为细胞提供生长和增殖的营养和环境&鱼类细胞常用的基础培养基有B K Q K%K!00%K Q K%E!2以及B K Q Ka D!"等&B K Q K培养基的氨基酸和维生素含量分别是K Q K培养基的两倍或四倍$一般应用于生长快速的鱼类的细胞培养!如罗非鱼的肾脏细胞'$(#"K!00培养基用于培养多种不同种属鱼类来源的细胞!如大黄鱼的肾脏细胞'5(%鲤鱼的上皮细胞'4(%黄颡鱼的吻端细胞'"(#"K Q K培养基含有适量的氨基酸%蛋白质%葡萄糖等物质$适合多种细胞的单层生长!如青海湖裸鲤鱼的鳃细胞'@(#"E!2培养基以平衡盐溶液为基础$其高浓度的氨基酸使得缓冲能力大为增强$而以半乳糖作碳源$则可以避免细胞产生有毒性的乳酸$这些都可以使鱼类的培养细胞增殖迅速!如可以用于锦鲤鱼组织细胞'!(%草鱼脑组织的原代培养细胞'0(以及青鱼的鳍条组织细胞的培养'!%(#"B K Q Ka D!"可用于原代培养及一些难以培养的细胞系$该培养基营养成分丰富$使用的血清少$因此也常用作无血清培养基的基础培养基!如中华鳑鲏鱼皮肤细胞'&(及斑马鱼性腺组织培养'!!(#&"/"#温度#严格控制培养温度是细胞培养成功的必要保证$鱼类细胞培养温度范围为"%1"@c&以下是常见鱼类细胞培养所用的最适温度,罗非鱼肾脏细胞"@c'$(%黄颡鱼吻端细胞"5c'"(%锦鲤组织细胞"2c'!(%斑马鱼性腺细胞"4c'!!(%斑石鲷鱼肌肉细胞"@c%斑石鲷鱼脑细胞"$c'!"(%草鱼脑细胞"@c'0(%黄颡鱼黑色素细胞"5c'!&(%鲤鱼上皮细胞"%1"2c'4(%青鱼鳍条细胞"2c'!%(&"/&#GP#鱼类细胞培养的适宜GP范围主要是5/%15/4$GP值过低或过高均会影响细胞的代谢速率和生长&因此$在进行鱼类细胞培养的过程中$要严格控制GP范围$筛选出培养的最适GP或其范围!如黄鳍鲷鱼肝细胞培养的最适GP范围是$/015/!'2($而斑马鱼性腺组织培养的最适GP范围是5/%15/"'!!(#&"/4#其他#不同鱼类细胞对血清%抗生素和缓冲液的要求各不相同&鱼类细胞培养中常用的动物血清有胎牛血清%小牛血清和马血清$最广泛使用的是胎牛血清$浓度为!%A或"%A'5$0($如黄鳍鲷鱼的肝细胞'2(和青海湖裸鲤鱼的鳃细胞培养'@(采用的是小牛血清&常用到的抗生素有青霉素%链霉素%两性霉素Y!如赤眼鳟鱼的鳍条细胞培养使用青霉素%链霉素和两性霉素Y$而罗非鱼的肾脏细胞'$(和斑石鲷鱼的肌肉细胞'!"(则使用青霉素和链霉素#&常用的缓冲液有磷酸盐平衡生理盐水!=Y:#和磷酸缓冲液!=Y#$如罗非鱼肾脏细胞'$(和黄颡鱼皮肤黑色素细胞培养'!&(用=Y$而草鱼肝细胞培养'!4(用=Y:&$"鱼类细胞培养的应用鱼类细胞培养发展迅速$使用范围越来越广泛$可以说鱼类病毒%肿瘤%免疫%遗传和鱼类资源保护等领域的研究都离不开鱼类细胞培养技术&&/!#在鱼类病理研究方面的应用#鱼类细胞培养在鱼类病毒致病机理%抗病毒免疫研究中有着广泛的应用'!2($对提高渔业的经济效益$以及对珍稀鱼类的保护和养殖有重大意义&第一个鱼类病毒---传染性胰腺坏死病毒是由美国学者C>S V利用虹鳟性腺细胞系!;?M"#细胞分离出来的&目前已知鱼类病毒约2%种$广泛存在于海水或淡水中&研究发现$疱疹病毒科的斑点叉尾蛔病毒%呼肠病毒科的草鱼呼肠病毒%弹状病毒科的病毒性出血性败血症病毒等对渔业生产都有比较严重的不良影响$具有高感染率和高死亡率的特点&目前$锦鲤鳍条细胞已用于锦鲤疱疹病毒致病机理研究'!$($青鱼鳍条组织细胞已用于检测草鱼呼肠孤病毒敏感性'!%(&积极通过鱼类细胞培养来探索鱼类病毒致病机制$可以从源头上了解病毒的感染过程$进而提出可行的鱼病解决方案$可以大大促进鱼类养殖业的发展$造福广大消费者&&/"#在鱼类肿瘤研究方面的应用#鱼类细胞培养早就应用于鱼类肿瘤发病机制和防治的研究&已发现中华鲟的肝脏肿瘤以及鲫鱼%罗非鱼和草鱼的肌肉瘤&另外鳗鱼和鲶鱼的神经组织也发现存在肿瘤'!5(&珍稀鱼类及经济鱼类肿瘤的发生给渔业养殖及生物多样性带来不可估量的损失&因此$以鱼类细胞为材料研究鱼类肿瘤发生机制$可指导生产中降低鱼类肿瘤的发生率$提高经济效益&研究发现$鱼类肿瘤的产生与染有农药等化学致癌物质的工业废水的排放密不可分&&/&#在环境监测中的应用#随着社会工业化的发展$水质被铜%汞%镉以及铅等重金属污染屡见不鲜&而鱼类作为一种水生生物$水质量的高低直接关系到它们的健康和行为$而这也可以反映水环境的污染情况&研究表明$鱼类细胞可用于水体环境污染的监测$如松花江鲈鱼的肾脏细胞可用以检测水体中铜离子的污染状况'!@($转基因斑马鱼也可以用来检测环境镉污染'!0(& 基金项目 广东省教育特色创新项目 F>/"%!@d?:L N!"5 "%!0年岭南师范学院大学生创新创业项目 F>/5$4 5$2 @5& "通信作者主要参考文献'!(付思思$吴志新$王#敏$等/锦鲤组织细胞体外培养的初步研究'6(/中国海洋大学学报$"%!"$4"!&#,4440/'"(孔祥婷$沈颂东$姜德勋$等/黄颡鱼吻端细胞培养研究'6(/淡水渔业$"%%0$&0!"#,!0"2/'&(李#伟$王建国$郑蒙蒙$等/中华鳑鲏皮肤细胞的分离及其细胞系的建立'6(/水产学报$"%!5!&#,&2@&$&/'4(崔莹莹$吴东明$李月红$等/鲤鱼上皮细胞在不同培养条件下的生长状况及与哺乳动物细胞的比较'6(/安徽农业科学$"%!%$&@!"4#,!&!&@!&!&0/'2(吴国平$纪荣兴$李丽美$等/黄鳍鲷肝细胞体外培养研究'6(/动物医学进展$"%%&$"4!&#,!%"!%&/'$(赵建青$贾#鹏$刘文枝$等/罗非鱼肾脏细胞系的建立及其生物学特性'6(/中国水产科学$"%!0$"$!"#,&@"&0%/'5(郑在予$杨金先$陈秀霞$等/大黄鱼肾脏组织细胞系!^L d#的建立'6(/福建农业学报$"%!5$&"!!%#,!%2!!%2$/'@(赵雪梅/不同浓度L J"I对青海湖裸鲤鳃细胞培养的影响'6(/青海环境$"%!!$"!!"#,040@/'0(周#怡$郭本月$魏万权$等/草鱼脑细胞原代培养'6(/渔业研究$"%!0$4!!"#,!$"!$$/'!%(张雪萍$曾令兵$陈#倩$等/青鱼鳍条组织细胞系的建立及其生物学特性'6(/淡水渔业$"%!$$4$!"#,&0/'!!(董丹丹$孙燕侠$郭华荣/斑马鱼性腺组织的原代细胞培养技术的建立'6(/安徽农业科学$"%!$$44!!2#,!&%!&4/'!"(王梦珣$朱#鹤$王玉珏$等/斑石鲷肌肉%脑细胞系的建立与生物学特性'6(/中国海洋大学学报!自然科学版#$"%!@$4@!$#,$554/'!&(程炜轩$许国焕$熊#达$等/黄颡鱼黑色素细胞原代培养及迁移相关基因克隆分析'6(/生态毒理学报$"%!4$0!$#,!%&2!%4%/#'!4(张洪玉$王海波$赵明军$等/草鱼肝细胞原代培养的培养基选择与优化'6(/中国渔业质量与标准$"%!5$5!$#,&$4!/'!2(周广舟$景红娟/鱼类细胞系在病毒学研究中的应用进展'6(/生物技术通报$"%!!!&#,"!"$/'!$(肖#艺$曾令兵$徐#进$等/锦鲤鳍条组织细胞系的建立及其生物学特性'6(/中国细胞生物学学报$"%!"$&4!@#,5$5554/#'!5(俞晓宇/鱼类肿瘤病的组织病理学研究及其评价'6(/内陆水产$"%%@!5#,"""&/'!@(白丽雯$李状状$李#霞$等/L J:'4对松江鲈肾细胞系的毒性效应'6(/海洋环境科学$"%!5$&$!"#,!$!!$$/'!0(冯志桐$赵#爽$潘#炯$等/镉对转基因斑马鱼的急性毒性效应'6(/天津理工大学学报$"%!0$&2!"#,$!$4/!##############################################欢迎订阅#&#!年 生物学教学 杂志##*生物学教学+杂志是由国家教育部主管%华东师范大学主办%向国内外正式发行的全国教育类核心期刊$入选上海高等教育高水平学术期刊支持计划&创刊$%多年来$*生物学教学+努力为读者%作者服务$密切读者%作者和编者的关系$已经在中学生物学领域成为我国生物学教育工作者提高学术水平及教学水平%促进我国生物学教育教学改革的一种重要媒体$成为我国中学生物学教师的良师益友&主要栏目有,生物科学综述%现代教育论坛%国外教育动态%课程标准与教材%教师教育%教育教学研究%教具%课堂教学%信息技术%考试与命题%实验教学%科技活动%学生实践与创新%科学)技术)工程学和数学!:?Q K#%教学参考%生物学史%科学技术与社会及读者之窗等&另外$封面%封底刊登原版生物照片$为教师教学提供基础资料&*生物学教学+杂志为月刊$国际标准!$d$@%页$"%"!年每期定价!$元$全年!0"元&目前本刊微信公众平台已经开始征订$微信号,U`\e\[[&杂志社在线投稿系统网址,U`\e\/.)7J/.,J/)7$联系电子信箱,U`\e\f X+>/.)7J/.,J/)7$电话,%"!24&4!%%2$$""&"""2&。
鱼类细胞培养及其应用_于淼
术。长江水产 研究所和中科院病 毒所通过草鱼肾 脏 合物对细胞色素 P4501A 的诱导能力, 还可以评价样
组织的细胞培 养分离鉴定了 草鱼出血病 病原 ) ) ) 鱼 品的 雌激素活性 , 鱼 类细胞系可 以取代急 性鱼类毒
呼肠病毒, 并 生产了减毒疫苗, 广泛用于生产实 践 中。 1999 年, Zhang 等 [4]人将虹 彩病毒 ( Rana grylio
RTG- 2 细胞研究了虹鳟病毒性出血性败血症( VHS) 病 色大头鲶 BB 细胞系和虹鳟 RTG- 2 细胞系对苯并芘的
毒的特性。1971 年, Fijan[3]等用鲤鱼卵巢原代培养细 反应, 苯并芘可以诱导 CYP1A1 的酶活, 结果表明: 苯
胞分离了鲤鱼春季病毒血症病毒, 而后又从 FHM 细 胞分离出弹状 病毒。Wolf 和 Darlington [3]1971 年 用云 斑叉尾蛔细胞系分离出 CCVD 病毒。1988 年, 童裳亮
水生动物的细胞培养晚于陆生动物, 其中 ( 包括 水生无脊椎动物和水生脊椎动物) , 水生无脊椎动物 的细胞培养主要是甲壳类 ( 如对虾、螯虾、龙虾、蟹和 鲎) 、贝类( 如牡蛎、珍珠贝和蛤) 和海绵的体外培养。 水生无脊椎动物的细胞培养比较困难, 原代培养细胞 不能形成单层, 或即使形成单层, 但细胞不分裂, 难以 进行传代。因而, 至今没有得到水生无脊椎动物的连 续性细胞系。水生无脊椎动物的细胞培养不仅在甲壳 类和贝类的病毒分离、检测和疫苗制备方面有很大的 应用价值, 而且还可能用来生产天然产物比如药物。 已经发现不少海洋无脊椎动物 ( 如海绵、珊瑚、苔藓 虫、海兔和海鞘) 能合成抗癌、抗病毒、抗心血管病的 药物, 若能查明这些药物是在动物的哪些细胞中合成 的, 便可能用细胞培养法来生产。
水产细胞工程实验设计报告
水产细胞工程实验设计报告引言水产养殖是目前重要的经济产业之一，但其面临的问题也不容忽视。
其中，疾病防控是水产养殖中的重要环节，传统的防疫方式受到环境限制和效果不佳的影响。
随着细胞工程技术的发展，水产细胞工程在水产养殖领域的应用也逐渐得到关注。
本实验旨在通过水产细胞工程，研究和应用细胞工程技术在水产养殖中的潜力。
实验目的本实验的主要目的是探索利用细胞工程技术在水产养殖中进行疾病防控的可能性，并评估其效果。
具体实验目标如下：1. 研究细胞工程技术在水产养殖中的应用潜力；2. 通过细胞工程技术提高水产养殖物种的抵抗力；3. 评估细胞工程技术在水产养殖中的效果。
实验设计1. 实验材料- 水产养殖物种（如鱼类、虾类等）- 细胞培养基- 细胞培养试剂（如胰蛋白酶、细胞增殖素等）- 细胞培养器具（如培养皿、离心管等）- 实验室设备（如显微镜、离心机等）2. 实验步骤1. 准备细胞培养基，并根据水产养殖物种的特点进行相应的优化调整。
2. 从水产养殖物种中采集细胞样本，如鱼鳃组织、虾脚组织等。
将细胞样本置于含有胰蛋白酶的细胞培养基中，用于细胞的离体培养。
3. 经过胰蛋白酶消化后，将细胞转移至培养皿中，并培养在适宜的温度和湿度条件下。
4. 观察细胞的增殖情况。
根据需要，可以添加适量的细胞增殖素来促进细胞的增殖。
5. 对增殖的细胞进行鉴定和筛选，挑选出具有高抗病能力的细胞株。
6. 根据实验需要，对选出的细胞株进行基因编辑，增加抗病相关基因的表达量。
7. 将编辑过的细胞株培养至足够数量后，进行体内实验。
将编辑过的细胞株注射到水产养殖物种体内，观察其对疾病的抵抗能力。
8. 根据实验结果，评估细胞工程技术在水产养殖中的应用效果。
3. 实验预期结果通过以上实验设计，我们预期可以得到以下结果：- 细胞工程技术可以提高水产养殖物种的抵抗力，降低疾病发生率。
- 经过基因编辑的细胞株可以进一步提高水产养殖物种的抗病能力。
- 细胞工程技术在水产养殖中有潜力成为一种有效的疾病防控方法。
动物细胞教案
动物细胞教案一、教学目标1. 理解动物细胞的结构和功能。
2. 掌握动物细胞的基本特点和分类。
3. 能够使用适当的术语描述动物细胞的结构和功能。
4. 培养学生的观察、分析和表达能力。
二、教学重点1. 掌握动物细胞的结构和功能。
2. 研究动物细胞的基本特点和分类。
三、教学内容和步骤1. 导入（引入动物细胞的重要性和研究背景）可以通过展示一张动物细胞的彩色电子显微镜照片引起学生的兴趣，并简要介绍动物细胞的研究背景和重要性。
2. 讲解动物细胞的基本特点2.1 细胞膜：是由脂质和蛋白质构成的双层薄膜，起着包裹细胞和调控物质进出的作用。
2.2 细胞质：位于细胞膜内，含有细胞器和细胞液。
2.3 细胞核：控制细胞的生长和分裂，含有遗传物质DNA。
2.4 胞器：如线粒体、内质网、高尔基体等，负责细胞的代谢活动和物质的合成。
2.5 细胞液：由水和溶质组成，维持细胞内外的平衡和稳定。
3. 探究动物细胞的结构和功能3.1 线粒体：解释线粒体的结构和功能，即细胞的“能量中心”，参与细胞的呼吸作用，产生能量。
3.2 内质网：介绍内质网的结构和功能，包括粗面内质网和泛质内质网的区别，参与蛋白质的合成和转运。
3.3 高尔基体：阐述高尔基体的结构和功能，帮助细胞分泌物质和调控细胞膜的合成。
3.4 溶酶体：讲解溶酶体的结构与功能，即“细胞的垃圾处理中心”，负责降解和消化细胞内的废物和有害物质。
4. 深入研究动物细胞的分类和特点4.1 哺乳动物细胞：详细介绍哺乳动物细胞的特点和研究价值。
4.2 昆虫细胞：探究昆虫细胞的特点和研究领域。
4.3 鱼类细胞：解释鱼类细胞的结构和功能，比较其与哺乳动物细胞的异同点。
4.4 鸟类细胞：研究鸟类细胞的特点和研究意义。
4.5 爬行动物细胞：介绍爬行动物细胞的结构和功能，探索其与哺乳动物细胞的相似性和差异性。
5. 实验与观察环节通过实验和显微镜下的观察，让学生亲自探索动物细胞的结构和功能，培养实验操作技能和科学观察能力。
鱼类细胞培养及其在病毒学研究中的应用
比较 容 易 ， 对传 代 培养 时 间 的要 求 弹性 比较 大 ， 温 适
范 围广 ， 使得 鱼类 细胞 系在 生 物 学 研 究 领 域 中得 到
广泛 应用 。 １ ２ 我 国 鱼 类 细 胞 系 建 系 概 况 ．
２ ０株口 。其 中淡 水 鱼 类 和 溯 河 洄 游 性 鱼 类 的 细 ２ 。 胞 系 占大 部 分 ， 水 鱼类 的细胞 系约 占 ３ 左 右 。 海 Ｏ
ｃｔ ｉ） 上 皮 瘤 细 胞 系 Ｅ Ｃ，鲫 鱼 （ａ ａｓｕ ａｐ ｏ Ｐ Ｃ ｒｓ ｓ ｉ ａ ｒ ｔｓ ｕ ａｕ ）鳍细胞 系 Ｃ ＡＲ， 鱼 巨噬 细 胞 系 ＧＭＣ 金 Ｌ， 棕鲴 （ ｉｍｐ ａｅｐ ｏ ｈ ｓ Ｐ ｎ ｈ ｌｓ ｒｍｅ ｚ ）性 腺 细 胞 系 Ｃ Ｏ， Ｃ 大
疾病 防控 具 有一 定的 指 导意 义 。
关 键词 ： 细胞 培 养 ； 毒 学 ； 类 病 鱼
中图 分 类 号 ： ９ １ ￥ ５ ． ５ ￥ ４ ；８ ２ ６ 文献标识码 ： Ｂ 文 章 编 号 ： ０ ７ ５ ３ （ ０ ０ ０ — １ ７０ １ ０ — ０ ８ ２ １ ） ４０ ０ —４
动物 医学 进展 ，０ ０ ３ （ ） １ ７１ ０ ２ １ ，１ ５ ：０ —１
Ｐｒ ｇｒ ｓ ｎ Ｖｅ ｅ ｉ ｒ ｅ ｃ ｎ ｏ ｅ ｓ ｉ ｔ ｒｎａ ｙ Ｍ ｄｉｉ ｅ
弯
若
ｄ
瞩专论与讲座
一
鱼 类 细 胞 培 养及 其在 病 毒 学研 究 中的 应 用
李 文峰 ， 康 森 黄 麦 ， 健 史成 银 ，
胚 胎细 胞 系 ＣＨＳ －ｐ 金 头 鲷 （ ｐ ｒ ｓ ｕ ａａ Ｅｓ， Ｓ ａ ｕ ｒ ｔ ）细 ａ
胞 系 Ｓ 一 ， 阳鱼 （ ｅ ｏ ｓ ｃｏｈ ｒ ｓ 鳃 细胞 ＡＦ １ 太 Ｌ ｐ ｍｉ ｍａ ｒｃ ｉｕ ）
海水鱼类细胞系建立、鉴定及应用
海水鱼类细胞系建立、鉴定及应用摘要:为了预防和控制大规模爆发的鱼类病毒性疾病,海水鱼类细胞系已成为研究病毒感染途径、感染机理以及研制病毒疫苗的重要体外培养体系。
本文详细总结了海水鱼类细胞系的原代培养步骤、培养体系和细胞系的建立、鉴定的实验步骤,并对海水鱼类细胞系在鱼类病毒学等研究工作中的作用加以综述。
关键词:细胞系海水鱼类鉴定病毒应用引言21世纪是海洋经济的时代,以海水鱼类养殖业为代表的第四次海水养殖浪潮的展开,给中国水产界带来了巨大的经济和社会效益。
但随着环境污染的日益加剧和养殖业的过度膨胀,各种病毒性疾病开始大规模爆发,给鱼类养殖业造成了巨大的经济损失。
为了查清鱼类病毒的感染途径和感染机理,从根本上预防和解决病毒病的传播,鱼类细胞系被广泛应用于鱼类病毒的分离鉴定、病毒病的诊断及病毒与宿主细胞的相互作用机理等研究,成为研究病毒学、细胞毒理学、细胞工程等多种学科的重要体外研究体系[1,2]。
自Wolf和Quimby建立世界上第一株鱼类细胞系——虹鳟鱼生殖腺细胞系[3]以来,鱼类细胞培养与建系研究发展迅速。
尽管淡水鱼类和溯河洄游性鱼类的细胞培养和细胞系建立发展较快,但目前建立并广泛应用的海水鱼类细胞系数量较少,主要来源于牙鲆[4]、大菱鲆[5]、鲈鱼[6]、真鲷[7]、石斑鱼[8-9]等几种经济鱼类,仍迫切需要建立多种细胞系用于多种学科的研究。
因此,本文就海水鱼类细胞系的建立、鉴定方法及其应用展开综述。
1 海水鱼类组织原代培养及细胞系建立的基本方法1.1 原代培养组织来源及培养方法海水鱼类组织原代培养及细胞系建立基本沿用了哺乳动物的细胞培养方法,与淡水鱼类细胞的培养方法也基本类似。
首先选取合适的组织进行原代培养。
根据目前研究显示,海水鱼的各种组织包括分化程度低,分裂潜能大的胚胎和幼鱼组织,以及成鱼性腺、肾脏、心脏、脾脏、鳔、鳍、吻端乃至肿瘤等组织,均可进行原代培养。
从鱼体获取目的组织消毒处理后,一般直接剪成1mm3的组织块于培养瓶中贴壁培养。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
六、实验步骤
3．观察 置于37℃培养的细胞．需逐日进 行观察．主要观察： (1)培养物是否被污染，如培养液变为黄色 且混浊，表示该瓶被污染。 (2)细胞生长状况与培养液颜色的变化，如 培养液变为紫红色，一般细胞生长不好。 可能是瓶塞未盖紧或营养液pH过高。
六、实验步骤
待细胞已基本长成致密单层时，此时即可 进行传代培养了。
鱼类细胞组培的一些方法：
பைடு நூலகம்
（1）组织块固定法 当组织量较少时可采用此法。它是将组织剪成约一立方毫米的小块, 按一 定比例将组织块贴在瓶壁上, 至少三十分钟以上, 然后轻轻加人营养液置温箱培养 。 （2）机械分散法 此法适用于细胞间连接较松散的组织, 如胚胎组织及幼鱼全鱼。将组织剪 成约一立方毫米耐的小块, 放入底部有一铜网的注射器内, 用手的压力将组织挤出 网孔, 最后将分散的组织吹打后加人营养液分装培养。 （3）络合剂分散法 目前使用的络合剂主要是乙二胺四乙酸, 它能与细胞间钙离子、镁离子结 合而使细胞连接松散, 经吹打即可分散。该法目前主要用于囊胚细胞培养及上皮 型细胞系的传代。
DMEM培养基 胰蛋白酶 Hanks缓冲液 抗生素溶液 牛血清 70%乙醇 去离子水
五、实验用品
器材： 解剖剪、解剖镊、培养皿、量筒、 试管、锥形瓶、吸管、橡皮头、培养瓶(小 方瓶或中方瓶)等。
上述器材均须彻底清洗、烤干、包装好，
六、实验步骤
培养液的配置 1、DMEM培养液的配置：将1袋袋装的干 粉溶解于1L去离子水中，加3.7gNaHCO3, 溶解，调节PH7.2,过滤除菌，4℃保存。 2、双抗溶液的配置：将青霉素、链霉素溶 解于生理盐水中，至青霉素最终浓度为 100U/mL。
七、注意事项
细胞培养要求无菌操作。无菌是细胞培养 成功的首要条件。 重视进人无菌室操作前必须将培养瓶外表 消毒提防试剂瓶中的液体浸湿瓶盖, 这往往 是试验污染的重要因素之一。
八 鱼类细胞原代培养意义
鱼类培养细胞作实验验对象，有着活体鱼 无法比拟的优点： (I)成本低，细胞系的维护不需要大型的养 殖设备和大量的换水与换气。 (2)重复性好，实验条件可以精确控制。因 此，对鱼类细胞系进行深入研究，无论在 理论研究方面，还是在实际应用方面，都 具有深远意义。
六、实验步骤
2.接种、培养：将肝脏剪成1mm×1mm×1mm 的组织块,用D-Hanks液洗3次,去掉血细胞,37℃下 用0.25%的胰蛋白酶消化10min,倒掉消化液后用 D-Hanks液洗2次,培养液洗2次,将肝组织块贴壁 于组织培养瓶中,每个培养瓶放组织块20～25块 。
加少许培养液,将培养瓶倒转置于培养箱中,在 37℃条件下培养,2h后补充培养液,并翻转培养基 继续培养。
八 鱼类细胞原代培养意义
在对细胞的营养需求有比较深人认识的基础上, 化学成分明确的无蛋白培养基已被用于中国仓鼠 卵巢细胞汇和杂交瘤细胞的培养。虽然鱼类细胞 培养中尚未成功应用无血清培养技术, 但在这方 面的研究已有一定基础,相信在不久的将来鱼细胞 培养技术会有所突破, 更广泛地应用于研究领域 。
六、实验步骤
3、D-Hanks缓冲溶液： 称取8gN aCl， 0.4gKCl,0.06gNa2HPO4,0.06gKH2PO4, 0.35gNaHCO3溶解于1000mL去离子水中 ，高压灭菌，4℃保存。
六、实验步骤
鱼类细胞的组织培养法 1．取材： 迅速处死动物，无菌分离肝脏, 置D-Hanks液中,冲洗肝脏至灰白色。
实验四 动物细胞培养基的配置和 原代培养
一 实验项目简介
1、实验学时 6学时 2 实验过程： A动物细胞培养液的配置
B采用组织培养法培养鱼类细胞
二、实验原理
原代细胞培养是指直接从动物体内获取的 细胞、组织或器官，经体外培养后，直到 第一次传代为止。这种培养，首先用无菌 操作的方法，从动物体内取出所需的组织( 或器官)，经消化，分散为单个游离的细胞 ，在人工培养下，使其不断的地生长及繁 殖。 细胞培养是一种操作繁琐而又要求十 分严谨的实验技术。
（4）酶消化法 该法是目前采用极为广泛的方法, 适用于绝大多数组织器官。所用的酶主 要是胰酶, 常用浓度是0.25%。根据酶消化时温度的不同, 又可进一步分为冷消化 法及热消化法。
三、实验目的
1、掌握动物细胞培养缓冲液、消化液的 配置。 2掌握动物细胞原代培养的基本过程。
四、实验试剂