革兰氏染色及镜检操作规范培训教材
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▪ 弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽胞杆菌 都呈现阴性反应。
G+和G-生物学特性的差异
比较项目 革兰氏染色反应
肽聚糖 磷壁酸 外膜 脂多糖（LPS） 类脂和脂蛋白含量 鞭毛结构 产毒素 对机械力的抗性
G+细菌 能阻留结晶紫而染成紫色
厚，层次多 多数含有
无 无 低（仅抗酸性细菌含有类 脂） 基体上着生2个环 以外毒素为主 强
▪ 细菌先经碱性染料结晶染色，而经碘液媒染 后，用酒精脱色，革兰氏阳性菌（G+）不 被脱去，革兰氏阴性菌（G-）可被脱去。为 观察方便，脱色后再用一种红色染料如碱性 蕃红等进行复染。阳性菌仍带紫色，阴性菌 则被染上红色。
▪ 有芽胞的杆菌和绝大多数的球菌，以及所有 的放线菌和真菌都呈革兰氏阳性反应；
革兰氏染色及镜检 操作规范培训
质量管理部
目录
▪ 一、革兰氏染色法 ▪ 二、革兰氏染色原理 ▪ 三、仪器设备、试剂 ▪ 四、操作方法 ▪ 五、镜检及结果判定 ▪ 六、革兰氏染色图片 ▪ 七、革兰氏染色注意事项 ▪ 八、革兰氏染色小结
一、革兰氏染色法
▪ 革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴 别染色法，1884年由丹麦医师Gram创立。
▪ 若材料为液体培养物或固体培养物冲洗下制备的 菌液，则直接涂布于载玻片上即可
2、自然干燥
▪ 涂片最好在室温下使其自然干燥。 ▪ 有时为了使之干得更快些，可将标本面向上，手持
载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加 热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长， 以防标本烤枯而变形。
3、固定
7、复染
▪ 蕃红染色液（稀）（或沙黄）复染液染1分 钟后，用蒸馏水冲洗，并自然干燥。
▪ 镜检。
五、镜检及结果判定
▪ 接通显微镜的电源，调节光线的强度。 ▪ 将载玻片放在载物台上，调节镜头至油镜镜头处，
调节粗准焦螺旋和细准焦螺旋至清晰为止。 ▪ 观察菌落形态及菌体的颜色。 ▪ 革兰氏阳性菌染色呈紫色，革兰氏阴性菌染色呈
钟，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫 为宜（不超过60℃）, 放置待冷后，进行染色。
4、初染
▪ 滴草酸铵结晶紫染1分钟 ▪ 蒸馏水冲洗。
5、媒染
▪ 加革兰氏碘液染1分钟 ▪ 蒸馏水冲洗，用吸水纸吸去水分。
6、脱色
▪ 加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色， 30秒后立即用蒸馏水冲洗。
▪ 用吸水纸吸去水分。
红色。
六、革兰氏染色图片
革兰氏染色的大肠杆菌
革兰氏染色的金黄色 葡萄球菌和大肠杆菌
革兰染色的伤寒沙门菌
革兰染色的福氏志贺菌
七、革兰氏染色注意事项
▪ 标本涂片不能太厚，若涂片较厚，应延长脱 色时间，直至不在出现紫色为止。
▪ 染色Baidu Nhomakorabea程中勿使染色液干涸。用水冲洗后， 应吸去玻片上的残水。
▪ 选用培养物时，G+菌培养12h-16h， G-培 养24h。菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常 使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。
▪ 标本干燥后即进行固定，固定的目的： ▪ １）杀死微生物，固定细胞结构。 ▪ ２）保证菌体能更牢的粘附在载玻片上，防止标本
被水冲洗掉。 ▪ ３）改变染料对细胞的通透性，因为死的原生质比
活的原生质易于染色。
▪ 手执载玻片的一端（涂有标本的远端），标本向上。 ▪ 在酒精灯外焰尽快的来回通过3—4次，共约2—3秒
▪ 革兰氏染色成败的关键是脱色时间。如脱色过 度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌； 如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革 兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及 乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定， 需要多加练习。
八、革兰氏染色小结 革兰氏染色法.swf
知识回顾 Knowledge Review
5、革兰氏染色液配制 ▪ 5.1草酸铵结晶紫染液
▪ A液：结晶紫2g ，95%乙醇20mL。 ▪ B液：草酸铵0.8g， 蒸馏水80mL ▪ 混合A液及B液，静置48h后使用。
5.2碘液配制
▪ 碘片1g， 碘化钾2g ，蒸馏水300mL ▪ 配制方法：先将碘化钾溶解在少量水中，
再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘全溶 后，加够蒸馏水即可。
▪ G-菌因其细胞壁薄，外膜层类脂含量高，肽聚糖层薄 且交联程度低（松疏），经酒精脱色后，以类脂为主 的外膜迅速溶解，这时薄而松散的肽聚糖网不能阻挡 结晶紫与碘的复合物的溶出，因此细胞退成无色，再 经沙黄等红色染料复染，就使G-菌呈红色。
三、仪器设备、试剂
▪ 生物显微镜 ▪ 载玻片 ▪ 草酸铵结晶紫染色液 ▪ 革兰氏碘液 ▪ 沙黄复染液或番红染色液 ▪ 95%乙醇
5.3番红复染液配制
▪ 番红2.5g， 95%乙醇100mL ▪ 取上述配好的番红乙醇溶液10mL与80mL
蒸馏水混匀既成。
四、操作方法
▪ 1、制片 ▪ 在干净的载玻片上滴上一滴蒸馏水。 ▪ 用接种环进行无菌操作，挑取培养物少许，置载
玻片的水滴中，与水混合做成悬液并涂成直径约1 厘米的薄层。
▪ 为避免因菌数过多聚成团，不利观察个体形态， 可在载玻片之一侧再加一滴水，从已涂布的菌液 中再取一环于此水滴中进行稀释，涂布成薄层。
G-细菌 可经脱色而复染成红色
薄，一般单层 无 有 有 高
基体上着生4个环 以内毒素为主 弱
阳性菌 阴性菌
二、革兰氏染色原理
▪ G+菌由于其细胞壁较厚，肽聚糖网层次多且交联程度 大，故经酒精脱色，失水而使网孔缩小，再加上它不 含类脂，故酒精处理，能把结晶紫和碘的复合物牢牢 留在壁内，使其保持紫色。
▪ 弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽胞杆菌 都呈现阴性反应。
G+和G-生物学特性的差异
比较项目 革兰氏染色反应
肽聚糖 磷壁酸 外膜 脂多糖（LPS） 类脂和脂蛋白含量 鞭毛结构 产毒素 对机械力的抗性
G+细菌 能阻留结晶紫而染成紫色
厚，层次多 多数含有
无 无 低（仅抗酸性细菌含有类 脂） 基体上着生2个环 以外毒素为主 强
▪ 细菌先经碱性染料结晶染色，而经碘液媒染 后，用酒精脱色，革兰氏阳性菌（G+）不 被脱去，革兰氏阴性菌（G-）可被脱去。为 观察方便，脱色后再用一种红色染料如碱性 蕃红等进行复染。阳性菌仍带紫色，阴性菌 则被染上红色。
▪ 有芽胞的杆菌和绝大多数的球菌，以及所有 的放线菌和真菌都呈革兰氏阳性反应；
革兰氏染色及镜检 操作规范培训
质量管理部
目录
▪ 一、革兰氏染色法 ▪ 二、革兰氏染色原理 ▪ 三、仪器设备、试剂 ▪ 四、操作方法 ▪ 五、镜检及结果判定 ▪ 六、革兰氏染色图片 ▪ 七、革兰氏染色注意事项 ▪ 八、革兰氏染色小结
一、革兰氏染色法
▪ 革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴 别染色法，1884年由丹麦医师Gram创立。
▪ 若材料为液体培养物或固体培养物冲洗下制备的 菌液，则直接涂布于载玻片上即可
2、自然干燥
▪ 涂片最好在室温下使其自然干燥。 ▪ 有时为了使之干得更快些，可将标本面向上，手持
载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加 热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长， 以防标本烤枯而变形。
3、固定
7、复染
▪ 蕃红染色液（稀）（或沙黄）复染液染1分 钟后，用蒸馏水冲洗，并自然干燥。
▪ 镜检。
五、镜检及结果判定
▪ 接通显微镜的电源，调节光线的强度。 ▪ 将载玻片放在载物台上，调节镜头至油镜镜头处，
调节粗准焦螺旋和细准焦螺旋至清晰为止。 ▪ 观察菌落形态及菌体的颜色。 ▪ 革兰氏阳性菌染色呈紫色，革兰氏阴性菌染色呈
钟，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫 为宜（不超过60℃）, 放置待冷后，进行染色。
4、初染
▪ 滴草酸铵结晶紫染1分钟 ▪ 蒸馏水冲洗。
5、媒染
▪ 加革兰氏碘液染1分钟 ▪ 蒸馏水冲洗，用吸水纸吸去水分。
6、脱色
▪ 加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色， 30秒后立即用蒸馏水冲洗。
▪ 用吸水纸吸去水分。
红色。
六、革兰氏染色图片
革兰氏染色的大肠杆菌
革兰氏染色的金黄色 葡萄球菌和大肠杆菌
革兰染色的伤寒沙门菌
革兰染色的福氏志贺菌
七、革兰氏染色注意事项
▪ 标本涂片不能太厚，若涂片较厚，应延长脱 色时间，直至不在出现紫色为止。
▪ 染色Baidu Nhomakorabea程中勿使染色液干涸。用水冲洗后， 应吸去玻片上的残水。
▪ 选用培养物时，G+菌培养12h-16h， G-培 养24h。菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常 使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。
▪ 标本干燥后即进行固定，固定的目的： ▪ １）杀死微生物，固定细胞结构。 ▪ ２）保证菌体能更牢的粘附在载玻片上，防止标本
被水冲洗掉。 ▪ ３）改变染料对细胞的通透性，因为死的原生质比
活的原生质易于染色。
▪ 手执载玻片的一端（涂有标本的远端），标本向上。 ▪ 在酒精灯外焰尽快的来回通过3—4次，共约2—3秒
▪ 革兰氏染色成败的关键是脱色时间。如脱色过 度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌； 如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革 兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及 乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定， 需要多加练习。
八、革兰氏染色小结 革兰氏染色法.swf
知识回顾 Knowledge Review
5、革兰氏染色液配制 ▪ 5.1草酸铵结晶紫染液
▪ A液：结晶紫2g ，95%乙醇20mL。 ▪ B液：草酸铵0.8g， 蒸馏水80mL ▪ 混合A液及B液，静置48h后使用。
5.2碘液配制
▪ 碘片1g， 碘化钾2g ，蒸馏水300mL ▪ 配制方法：先将碘化钾溶解在少量水中，
再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘全溶 后，加够蒸馏水即可。
▪ G-菌因其细胞壁薄，外膜层类脂含量高，肽聚糖层薄 且交联程度低（松疏），经酒精脱色后，以类脂为主 的外膜迅速溶解，这时薄而松散的肽聚糖网不能阻挡 结晶紫与碘的复合物的溶出，因此细胞退成无色，再 经沙黄等红色染料复染，就使G-菌呈红色。
三、仪器设备、试剂
▪ 生物显微镜 ▪ 载玻片 ▪ 草酸铵结晶紫染色液 ▪ 革兰氏碘液 ▪ 沙黄复染液或番红染色液 ▪ 95%乙醇
5.3番红复染液配制
▪ 番红2.5g， 95%乙醇100mL ▪ 取上述配好的番红乙醇溶液10mL与80mL
蒸馏水混匀既成。
四、操作方法
▪ 1、制片 ▪ 在干净的载玻片上滴上一滴蒸馏水。 ▪ 用接种环进行无菌操作，挑取培养物少许，置载
玻片的水滴中，与水混合做成悬液并涂成直径约1 厘米的薄层。
▪ 为避免因菌数过多聚成团，不利观察个体形态， 可在载玻片之一侧再加一滴水，从已涂布的菌液 中再取一环于此水滴中进行稀释，涂布成薄层。
G-细菌 可经脱色而复染成红色
薄，一般单层 无 有 有 高
基体上着生4个环 以内毒素为主 弱
阳性菌 阴性菌
二、革兰氏染色原理
▪ G+菌由于其细胞壁较厚，肽聚糖网层次多且交联程度 大，故经酒精脱色，失水而使网孔缩小，再加上它不 含类脂，故酒精处理，能把结晶紫和碘的复合物牢牢 留在壁内，使其保持紫色。