革兰氏染色及镜检操作规范培训教材
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《革兰氏染色》课件
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该方法基于细菌细胞壁的构造和成分 差异，通过染色剂对细菌细胞壁的吸 附和渗透作用，显示出不同的颜色， 从而进行鉴别。
革兰氏染色中使用的试剂及其作用
结晶紫
用于初步染色，能与细 胞壁结合，形成不溶性
复合物。
碘液
用于加强结晶紫与细胞 壁的结合，使染色更明
显。
酒精
脱色剂，去除染料与细 胞壁结合的复合物，使
染色
结晶紫染色
将结晶紫染液滴加在载玻片上，覆盖 菌体，染色1-2分钟。
冲洗
用吸水纸吸去多余染液，用清水轻轻 冲洗载玻片，洗去未结合的染料。
水洗和脱色
水洗
用流水冲洗载玻片，洗去未结合的染料。
脱色
将载玻片放入脱色液中染液滴加在载玻片上，覆盖菌体，复染1-2分钟。
色或粉红色。
03
革兰氏染色的操作步骤
涂片
涂片
将待染色的菌体轻轻涂布在载玻 片上，确保菌体均匀分布。
干燥
将涂有菌体的载玻片放在室温下 自然干燥，避免强烈气流或直接 阳光照射。
固定
火焰固定
通过短时间轻触载玻片边缘，用火焰迅速固定菌体，使其与载玻片粘附。
冷却
将固定后的载玻片放在干净的桌面上自然冷却。
染色时间
染色时间过长或过短都会影响 染色效果和观察结果。
脱色时间
脱色时间过长或过短都会影响 染色效果和观察结果。
染色方法
不同的染色方法可能会影响染 色效果和观察结果。
05
革兰氏染色的应用和意 义
在医学诊断中的应用
01
鉴别细菌种类
革兰氏染色是鉴别细菌种类的重要方法之一，通过染色结果的不同可以
将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两大类，有助于医生对感染进
该方法基于细菌细胞壁的构造和成分 差异，通过染色剂对细菌细胞壁的吸 附和渗透作用，显示出不同的颜色， 从而进行鉴别。
革兰氏染色中使用的试剂及其作用
结晶紫
用于初步染色，能与细 胞壁结合，形成不溶性
复合物。
碘液
用于加强结晶紫与细胞 壁的结合，使染色更明
显。
酒精
脱色剂，去除染料与细 胞壁结合的复合物，使
染色
结晶紫染色
将结晶紫染液滴加在载玻片上，覆盖 菌体，染色1-2分钟。
冲洗
用吸水纸吸去多余染液，用清水轻轻 冲洗载玻片，洗去未结合的染料。
水洗和脱色
水洗
用流水冲洗载玻片，洗去未结合的染料。
脱色
将载玻片放入脱色液中染液滴加在载玻片上，覆盖菌体，复染1-2分钟。
色或粉红色。
03
革兰氏染色的操作步骤
涂片
涂片
将待染色的菌体轻轻涂布在载玻 片上，确保菌体均匀分布。
干燥
将涂有菌体的载玻片放在室温下 自然干燥，避免强烈气流或直接 阳光照射。
固定
火焰固定
通过短时间轻触载玻片边缘，用火焰迅速固定菌体，使其与载玻片粘附。
冷却
将固定后的载玻片放在干净的桌面上自然冷却。
染色时间
染色时间过长或过短都会影响 染色效果和观察结果。
脱色时间
脱色时间过长或过短都会影响 染色效果和观察结果。
染色方法
不同的染色方法可能会影响染 色效果和观察结果。
05
革兰氏染色的应用和意 义
在医学诊断中的应用
01
鉴别细菌种类
革兰氏染色是鉴别细菌种类的重要方法之一，通过染色结果的不同可以
将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两大类，有助于医生对感染进
(完整)细菌革兰氏染色作业指导书
革兰氏染色一、目的更好的观察细菌形态，并可按染色反应加以分类鉴别.二、原理1、化学学说:碘液在菌体内与结晶紫结合后又和菌体内的核糖核酸镁盐-蛋白质复合物结合，此结合物不易被95%乙醇脱掉，呈革兰氏染色阳性。
因革兰氏阴性菌缺乏核糖核酸镁盐，故对碘与结晶紫结合物摄取少，且不牢固，易被乙醇脱色，而呈革兰氏染色阴性。
2、等电点学说:革兰氏阳性菌的等电点在PH2-3，比阴性菌（PH4—5）更低。
加之碘为弱氧化剂，可降低革兰氏阳性菌的等电点，使两类菌的等电点差异扩大.因此，阳性菌和碱性染料的结合力比阴性菌更强。
3、渗透性学说:阳性菌含粘肽多、糖多,酒精使其脱水而致细胞壁间隙缩小,通透性降低，在菌体内保留了染料—碘复合物，故呈紫色。
阴性菌胞壁含粘肽少，通透性不受影响，菌体内染料—碘复合物较易透出，失去紫色,被复染成为红色。
三、标本痰涂片、分泌物涂片、细菌涂片等。
四、染液第一液：结晶紫乙醇饱和液(2g结晶紫溶于95％乙醇20ml内）+10g/l草酸铵水溶液80ml混匀。
第二液:碘1g，碘化钾2g,加少许蒸馏水，充分振摇，溶解后加蒸馏水至300ml。
第三液：95％乙醇或乙醇、丙酮(7：3）混合液。
第四液：稀释碳酸复红或沙黄溶液（2。
5％沙黄乙醇液10ml加蒸馏水90ml 混匀)（碱性复红8g溶于95%酒精100ml中制成饱和液,取10ml加入5％碳酸水溶液90ml混匀)用时用蒸馏水稀释10倍即可。
五、质量控制措施每周做一次革兰氏阴、阳性质控菌株染色对照（金葡菌、大肠杆菌）.六、操作步骤1、已固定的细菌(或其它）涂片,滴加第一液染1分钟水洗。
2、冲去残水滴加第二液，媒染1分钟，水洗。
3、去残水,用95％酒精脱色，至无明显紫色液渗出为止，水洗。
4、用第四液复染10-30秒钟，水洗，干后镜检。
七、结果可报区间革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。
八、实验室解释1、染色关键在于涂片和脱色，故涂片要厚薄适宜。
脱色时若涂片上有水分，则脱色力强，易形成假阴性。
细菌革兰氏染色PPT课件
实验二 细菌革兰氏染色
1
一、实验目的
学习微生物制片、染色的基本技术 掌握细菌革兰氏染色及无菌操作技术 进一步观察细菌的基本形态
2
二、实验原理
C.Gram（革兰）于1884年 发明的一种鉴别不同类型 细菌的染色方法。
3
革兰氏染色
1、用碱性染料结晶紫对菌液涂片进行初染
2、用碘溶液进行媒染，其作用是提高染料和细 胞间的相互作用从而使二者结合得更牢固。
17
1、根霉——菌丝特化形成假根等特化菌丝
18
1、根霉——孢囊孢子（无性繁殖）
19
2、曲霉、青霉——分生孢子（无性繁殖）
20
3、犁头霉——接合孢子（有性繁殖）
21圆柱形，
但有时某些酵母菌可形成假菌丝。酵母菌无性繁殖以出芽 方式生殖。
22
微生物的菌落形态
占细胞壁干重的%
革兰氏阳性细菌
革兰氏阴性细菌
含量很高（50~90）
含量很低（~10）
含量较高（＜50）
无
一般无（＜2）
含量较高（~20）
无
含量较高
5
三、实验材料
1、菌种：大肠杆菌（E.C）、枯草杆菌（B.S） 2、染料：结晶紫、复红、碘液等 3、材料：95%酒精等
6
四、实验方法
（一）革兰氏染色 涂片—风干—固定—初染—水洗—媒染—水洗—
菌落：单个菌体在固体平面培养基上生长繁殖形成的肉 眼可见的群体。
区分和识别各类微生物可从菌落形态（群体形态）和细 胞形态（个体形态）两方面进行，菌落形态是无数细胞形态 的集中反映，因此每一大类微生物都有其一定的菌落特征， 可通过这些特征差异区分和识别。
特征描述：形状、大小、颜色、边缘、隆起、光泽、质 地等。
1
一、实验目的
学习微生物制片、染色的基本技术 掌握细菌革兰氏染色及无菌操作技术 进一步观察细菌的基本形态
2
二、实验原理
C.Gram（革兰）于1884年 发明的一种鉴别不同类型 细菌的染色方法。
3
革兰氏染色
1、用碱性染料结晶紫对菌液涂片进行初染
2、用碘溶液进行媒染，其作用是提高染料和细 胞间的相互作用从而使二者结合得更牢固。
17
1、根霉——菌丝特化形成假根等特化菌丝
18
1、根霉——孢囊孢子（无性繁殖）
19
2、曲霉、青霉——分生孢子（无性繁殖）
20
3、犁头霉——接合孢子（有性繁殖）
21圆柱形，
但有时某些酵母菌可形成假菌丝。酵母菌无性繁殖以出芽 方式生殖。
22
微生物的菌落形态
占细胞壁干重的%
革兰氏阳性细菌
革兰氏阴性细菌
含量很高（50~90）
含量很低（~10）
含量较高（＜50）
无
一般无（＜2）
含量较高（~20）
无
含量较高
5
三、实验材料
1、菌种：大肠杆菌（E.C）、枯草杆菌（B.S） 2、染料：结晶紫、复红、碘液等 3、材料：95%酒精等
6
四、实验方法
（一）革兰氏染色 涂片—风干—固定—初染—水洗—媒染—水洗—
菌落：单个菌体在固体平面培养基上生长繁殖形成的肉 眼可见的群体。
区分和识别各类微生物可从菌落形态（群体形态）和细 胞形态（个体形态）两方面进行，菌落形态是无数细胞形态 的集中反映，因此每一大类微生物都有其一定的菌落特征， 可通过这些特征差异区分和识别。
特征描述：形状、大小、颜色、边缘、隆起、光泽、质 地等。
革兰氏染色试验步骤ppt课件
11
二、基本原理
1 、革兰氏染色原理
通过结晶紫液初染和碘液媒染后，在细菌的细胞膜内可 形成不溶于水的结晶紫液和碘液的复合物，G+细菌由于 其细胞壁较厚，肽聚糖网层次多和交联致密，因此遇脱 色剂乙醇处理时，因失水而使网孔缩小，再加上它不含 类脂，故乙醇的处理不会溶出缝隙，因此能把结晶紫与 碘的复合物牢牢留在壁内，使其保持紫色。
乳酸石炭酸棉蓝染色优点：细胞不变形，不易干燥，防腐，保存时间较长，
25
三、实验器材
1、菌种：细黄链霉（Streptomyces microflavus） 红酵母（Rhodotorula SP） 产黄青霉（Penicillium chrysogenum） 黑曲霉（Aspergillus niger） 黑根霉（Rhizopus nigricans ） 总状毛霉（Mucor racemosds）
24
酵母菌：单细胞真核生物
真
形态：卵圆形、圆形、椭圆形或圆柱形等
繁殖方式：无性：主要为出芽繁殖，产生芽孢子
菌
有性：产生子囊孢子
美篮染色优点：可区分死活细胞，活细胞能使蓝 色变无色，死细胞一直呈蓝色。
霉菌：霉菌可产生复杂分枝的菌丝体（基内菌丝和气生菌丝），
气生菌丝长到一定阶段分化产生分生孢子梗，分生孢子梗上 产生生孢子。分生孢子梗和分生孢子的形态特征是分类的重 要依据。 繁殖方式：主要产生无性孢子和产生有性孢子繁殖
2、培养基：高氏1号琼脂、麦芽汁琼脂、马铃薯葡萄糖琼 脂或查氏培养基。
3、试剂：0.1%美蓝染液、乳酸石炭酸棉蓝染色液、 50% 乙醇。
4 、器具：显微镜、培养皿、载玻片、盖玻片、镊子、接 种杯、解剖针、擦镜纸等。
26
四、实验步骤
放线菌形态观察方法（扦片法）
二、基本原理
1 、革兰氏染色原理
通过结晶紫液初染和碘液媒染后，在细菌的细胞膜内可 形成不溶于水的结晶紫液和碘液的复合物，G+细菌由于 其细胞壁较厚，肽聚糖网层次多和交联致密，因此遇脱 色剂乙醇处理时，因失水而使网孔缩小，再加上它不含 类脂，故乙醇的处理不会溶出缝隙，因此能把结晶紫与 碘的复合物牢牢留在壁内，使其保持紫色。
乳酸石炭酸棉蓝染色优点：细胞不变形，不易干燥，防腐，保存时间较长，
25
三、实验器材
1、菌种：细黄链霉（Streptomyces microflavus） 红酵母（Rhodotorula SP） 产黄青霉（Penicillium chrysogenum） 黑曲霉（Aspergillus niger） 黑根霉（Rhizopus nigricans ） 总状毛霉（Mucor racemosds）
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酵母菌：单细胞真核生物
真
形态：卵圆形、圆形、椭圆形或圆柱形等
繁殖方式：无性：主要为出芽繁殖，产生芽孢子
菌
有性：产生子囊孢子
美篮染色优点：可区分死活细胞，活细胞能使蓝 色变无色，死细胞一直呈蓝色。
霉菌：霉菌可产生复杂分枝的菌丝体（基内菌丝和气生菌丝），
气生菌丝长到一定阶段分化产生分生孢子梗，分生孢子梗上 产生生孢子。分生孢子梗和分生孢子的形态特征是分类的重 要依据。 繁殖方式：主要产生无性孢子和产生有性孢子繁殖
2、培养基：高氏1号琼脂、麦芽汁琼脂、马铃薯葡萄糖琼 脂或查氏培养基。
3、试剂：0.1%美蓝染液、乳酸石炭酸棉蓝染色液、 50% 乙醇。
4 、器具：显微镜、培养皿、载玻片、盖玻片、镊子、接 种杯、解剖针、擦镜纸等。
26
四、实验步骤
放线菌形态观察方法（扦片法）
《革兰氏染色法》课件
将脱色后的涂片用番红染液复染，时间约为1-2分钟。番红是 一种酸性染料，可以和蛋白质结合，使菌体或细胞呈现红色 。
番红复染的作用是使菌体或细胞呈现红色，使其更加明显， 有助于观察和鉴别。同时，番红还可以与结晶紫形成鲜明的 对比，使观察更加准确。
冲洗与干燥
• 将染色完成的涂片用清水冲洗干净，然后晾干或用吸水纸吸干 水分。冲洗的目的是去除染色过程中残留的染料和媒染剂等物 质，以免对观察造成干扰。干燥的目的是使涂片固定，以便于 保存和观察。
背景
革兰氏染色法的发明对于细菌学的发展起到了重要的推动作 用，为后续的细菌分类、疾病诊断和治疗提供了有力支持。
染色原理
原理
革兰氏染色法的染色原理主要是通过 一系列的脱色处理和复染，使细菌着 色，从而根据颜色差异将细菌分为革 兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两类。
操作流程
革兰氏染色法通常包括涂片、脱色、 媒染、染色和复染等步骤，通过这些 步骤的组合和调整，可以实现对不同 类型细菌的准确鉴别。
革兰氏染色法的结
03
果与意义
革兰氏阳性菌与阴性菌的染色特性
革兰氏阳性菌
被染成紫色或蓝紫色，不易被酒 精脱色，有厚重的革兰氏染色反 应。
革兰氏阴性菌
被染成红色或淡红色，易被酒精 脱色，有较弱的革兰氏染色反应 。
染色结果的分析与解读
根据染色结果判断细菌的种类和特性，有助于临床诊断和 治疗。
通过观察染色后细菌的形态和排列，可以初步判断细菌的 致病性。
重要性
革兰氏染色法对于临床医学、生物技术和食品工业等领域具有重要意义，能够 帮助科学家和医生快速准确地鉴别不同类型的细菌，从而采取相应的治疗和预 防措施。
发展历程与背景
发展历程
革兰氏染色法由丹麦细菌学家汉斯·克里斯蒂安·革兰于1884 年发明，至今已有百余年历史。随着科学技术的不断进步， 该方法在操作流程和染料选择等方面不断得到优化和改进。
实验一 革兰染色法PPT课件
葡萄球菌属主要是釐黄色葡萄球菌表皮葡萄球菌等链球菌属肺炎链球菌草绿色链球菌肠球菌等白喉杆菌炭疽杆菌破伤风杆菌蜡样芽孢杆菌等其中釐黄色葡萄球菌肠球菌等为临床重要等病原菌革兰氏阳性菌通常对青霉素类第一或第二代头孢菌素等高度敏感青霉素可为化脓性细菌感染可首选药物
微生物实验课注意事项
• 禁止不穿白大衣进入实验室； • 禁止在实验室内吃东西、吸烟；不得高声喧哗，随
2020/3/26
P3
9
9
注意事项
1.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。 如果脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌。 如果脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。
脱色时间的长短受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响， 难以严格界定。 2. 染色过程中勿使染色液稀释。用水冲洗后，应吸去玻片上的
2.镜检后的染色玻片直接扔到专装废弃玻片的盒子。
2020/3/26
11
11
染色结果
金黄色葡萄球菌(10×100)
2020/3/26
大肠杆菌(10×100)
12
12
染色结果
螺形菌Spiral bacterium
2020/3/26
13
13
革兰染色意义
★鉴别细菌 ★选择抗菌药物 ★研究细菌的致病性
2020/3/26
2020/3/26
15
15
选择抗菌药物
• 常见的革兰氏阴性菌：沙门氏菌属、志贺氏菌属（痢疾 杆菌等）、嗜血杆菌属（杜克雷嗜血杆菌、流感嗜血杆 菌等）、霍乱弧菌等。革兰氏阴性菌在院内感染中的细 菌感染中占了大约65%，且大多菌株容易对抗菌药物耐 药
• 革兰氏阴性菌对第三代头孢、氨基糖苷类、抗假单胞菌 属的青霉素类、多粘菌素等高度敏感，对头霉素类和第 二代头孢菌素也较敏感。例如氟哌酸对革兰染色阴性杆 菌有效，如肠道病、腹泻为常用药 。
微生物实验课注意事项
• 禁止不穿白大衣进入实验室； • 禁止在实验室内吃东西、吸烟；不得高声喧哗，随
2020/3/26
P3
9
9
注意事项
1.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。 如果脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌。 如果脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。
脱色时间的长短受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响， 难以严格界定。 2. 染色过程中勿使染色液稀释。用水冲洗后，应吸去玻片上的
2.镜检后的染色玻片直接扔到专装废弃玻片的盒子。
2020/3/26
11
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染色结果
金黄色葡萄球菌(10×100)
2020/3/26
大肠杆菌(10×100)
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染色结果
螺形菌Spiral bacterium
2020/3/26
13
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革兰染色意义
★鉴别细菌 ★选择抗菌药物 ★研究细菌的致病性
2020/3/26
2020/3/26
15
15
选择抗菌药物
• 常见的革兰氏阴性菌：沙门氏菌属、志贺氏菌属（痢疾 杆菌等）、嗜血杆菌属（杜克雷嗜血杆菌、流感嗜血杆 菌等）、霍乱弧菌等。革兰氏阴性菌在院内感染中的细 菌感染中占了大约65%，且大多菌株容易对抗菌药物耐 药
• 革兰氏阴性菌对第三代头孢、氨基糖苷类、抗假单胞菌 属的青霉素类、多粘菌素等高度敏感，对头霉素类和第 二代头孢菌素也较敏感。例如氟哌酸对革兰染色阴性杆 菌有效，如肠道病、腹泻为常用药 。
细菌革兰氏染色PPT课件
细菌革兰氏染色ppt课件
目录
• 引言 • 革兰氏染色的基本原理 • 革兰氏染色的操作步骤 • 革兰氏染色的结果分析 • 革兰氏染色的应用和限制 • 结论
01 引言
目的和背景
目的
介绍革兰氏染色的原理、方法及应用，帮助学习者更好地了解和掌握这一基本 染色技术。
背景
革兰氏染色是细菌学中最经典、最常用的染色方法之一，通过对细菌的染色， 可以将其分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两大类，对于临床诊断和治疗具有 重要的指导意义。
结合其他技术
将革兰氏染色与其他技术如分子生 物学、免疫学等相结合，实现更精 确的细菌分类和鉴别。06Βιβλιοθήκη 结论总结革兰氏染色的重要性
临床诊断的关键工具
革兰氏染色是临床微生物实验室的基 本技术，用于快速识别细菌种类，对 准确诊断感染和选择合适的治疗方案 至关重要。
指导抗生素选择
科研的基础
在科研领域，革兰氏染色是研究细菌 种群结构、进化、生态和致病性的重 要手段。
染色
染色
用革兰氏染色液对固定后的涂片进行 染色，分别使用结晶紫、碘液和脱色 液进行初染、媒染和脱色处理。
染色注意事项
染色时应按照规定的步骤进行，避免 染色过度或不足，同时要确保染色液 的新鲜度和浓度适宜。
脱色
脱色
用脱色液对染色后的涂片进行脱色处理，以 去除菌体表面的结晶紫和碘液。
脱色注意事项
脱色时应控制脱色时间和脱色液的用量，避 免脱色过度或不足，影响染色效果。
革兰氏染色的工作原理
革兰氏染色利用了细菌细胞壁的成分 和结构对染料亲和性的差异，通过结 晶紫初染和碘液媒染后，由于细胞壁 组成成分对革兰氏染料的吸附能力不 同，酒精脱色时，细胞壁对染料的吸 附能力不同，从而导致被脱色的程度 不同，最终影响了复染后细菌的着色。
目录
• 引言 • 革兰氏染色的基本原理 • 革兰氏染色的操作步骤 • 革兰氏染色的结果分析 • 革兰氏染色的应用和限制 • 结论
01 引言
目的和背景
目的
介绍革兰氏染色的原理、方法及应用，帮助学习者更好地了解和掌握这一基本 染色技术。
背景
革兰氏染色是细菌学中最经典、最常用的染色方法之一，通过对细菌的染色， 可以将其分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两大类，对于临床诊断和治疗具有 重要的指导意义。
结合其他技术
将革兰氏染色与其他技术如分子生 物学、免疫学等相结合，实现更精 确的细菌分类和鉴别。06Βιβλιοθήκη 结论总结革兰氏染色的重要性
临床诊断的关键工具
革兰氏染色是临床微生物实验室的基 本技术，用于快速识别细菌种类，对 准确诊断感染和选择合适的治疗方案 至关重要。
指导抗生素选择
科研的基础
在科研领域，革兰氏染色是研究细菌 种群结构、进化、生态和致病性的重 要手段。
染色
染色
用革兰氏染色液对固定后的涂片进行 染色，分别使用结晶紫、碘液和脱色 液进行初染、媒染和脱色处理。
染色注意事项
染色时应按照规定的步骤进行，避免 染色过度或不足，同时要确保染色液 的新鲜度和浓度适宜。
脱色
脱色
用脱色液对染色后的涂片进行脱色处理，以 去除菌体表面的结晶紫和碘液。
脱色注意事项
脱色时应控制脱色时间和脱色液的用量，避 免脱色过度或不足，影响染色效果。
革兰氏染色的工作原理
革兰氏染色利用了细菌细胞壁的成分 和结构对染料亲和性的差异，通过结 晶紫初染和碘液媒染后，由于细胞壁 组成成分对革兰氏染料的吸附能力不 同，酒精脱色时，细胞壁对染料的吸 附能力不同，从而导致被脱色的程度 不同，最终影响了复染后细菌的着色。
细菌的革兰氏染色
细胞膜（双层脂 质 脂质 蛋白嵌镶）
2020/10/4
4
蛋白质
二、岗前培训
革兰阴性菌细胞壁的化学组成
脂蛋白
脂质双层 脂多糖
2020/10/4
蛋白质
外 膜 肽聚糖（1-3层） 细胞膜 脂质
5
二、岗前培训
步骤
初染 媒染剂 脱色 复染
1
革兰氏染色程序和结果
方法
结果
阳性（G+）
阴性（G-）
结晶紫 1min 碘液 1min 95％乙醇 30s 番红（或复红）1min
水洗 水洗
水洗 水洗
初染
媒染
脱色
复染
2020/10/4
10
五、教师检查任务方案并演示操作
8. 镜检 待标本自干或用吸水纸吸干后，置显微镜
下检查。
革兰阳性菌（G+） ， 被染成蓝紫色。
革兰阴性菌（G-） ， 被染成 红 色。
2020/10/4
11
六、注意事项
操作因素 取菌量不可太多，影响观察。 染色因素 关键步骤是脱色，灵活掌握。 细菌因素 一般用18~24小时的培养物。 生物安全 “有菌意识，无菌观念。”
2020/10/4
12
七、任务实施
列表说明你所观察到的细菌形状、颜色和革兰氏染色反应性。
菌种
形 态(绘图) 颜 色 结果（Ｇ＋、Ｇ－）
学生以小组为单位修改、完善任务实施方案，将教师提 供的大肠杆菌、白色葡萄球菌进行革兰氏染色，并根据染色 结果判断菌体的革兰氏染色反应性。
2020/10/4
13
八、任务完成情况评价
细菌的革兰氏染色
Gram stain
授课专业：生物技术及应用 授课时间：20分钟
2020/10/4
4
蛋白质
二、岗前培训
革兰阴性菌细胞壁的化学组成
脂蛋白
脂质双层 脂多糖
2020/10/4
蛋白质
外 膜 肽聚糖（1-3层） 细胞膜 脂质
5
二、岗前培训
步骤
初染 媒染剂 脱色 复染
1
革兰氏染色程序和结果
方法
结果
阳性（G+）
阴性（G-）
结晶紫 1min 碘液 1min 95％乙醇 30s 番红（或复红）1min
水洗 水洗
水洗 水洗
初染
媒染
脱色
复染
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10
五、教师检查任务方案并演示操作
8. 镜检 待标本自干或用吸水纸吸干后，置显微镜
下检查。
革兰阳性菌（G+） ， 被染成蓝紫色。
革兰阴性菌（G-） ， 被染成 红 色。
2020/10/4
11
六、注意事项
操作因素 取菌量不可太多，影响观察。 染色因素 关键步骤是脱色，灵活掌握。 细菌因素 一般用18~24小时的培养物。 生物安全 “有菌意识，无菌观念。”
2020/10/4
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七、任务实施
列表说明你所观察到的细菌形状、颜色和革兰氏染色反应性。
菌种
形 态(绘图) 颜 色 结果（Ｇ＋、Ｇ－）
学生以小组为单位修改、完善任务实施方案，将教师提 供的大肠杆菌、白色葡萄球菌进行革兰氏染色，并根据染色 结果判断菌体的革兰氏染色反应性。
2020/10/4
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八、任务完成情况评价
细菌的革兰氏染色
Gram stain
授课专业：生物技术及应用 授课时间：20分钟
实验细菌革兰氏染色法.ppt
【方法步骤】
D. 水洗
A. 初染 B. 水洗 C. 媒染 E. 脱色 F. 水洗 G. 复染 H. 水洗 图4-1 革兰氏染色程序
I. 吸干
【方法步骤】
★ 获得本实验成功的关键： 1）选用活跃生长期菌种染色，老龄的革兰氏阳性细菌会被染 成红色而造成假阴性。 2）涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性。 3）脱色是革兰氏染色是否成功的关键，脱色不够造成假阳性， 脱色过度造成假阴性。
香柏油和二甲苯），擦镜纸，接种环，试管架，镊子，载玻 片夹子，载玻片支架，滤纸，滴管和无菌生理盐水等。
【方法步骤】
1. 涂片：将大肠杆菌（16h）和金黄色葡萄球菌（16h）分别
涂片、干燥、固定。 2. 染色： 1）初染：加草酸铵结晶紫一滴（以刚好将菌膜覆盖为宜）， 染色1～2min后倾去染液，水洗至流出水无色； 2）媒染：先用卢戈氏碘液冲去残留水迹，再用碘液覆盖1min， 倾去碘液，水洗至流出水无色。 3）脱色：用滤纸吸去玻片上的残水（从边缘吸，以防擦去菌 体），将玻片倾斜，并衬以白背景，用95%乙醇滴洗至刚刚无紫 色为止，约20～30秒，立即用水冲去乙醇；
★ 可知n（介质折射率）对提高显微镜的分辩力起着关键性的作
【基本原理】
2. 革兰氏染色 革兰氏染色法可将细菌分成革兰氏阳性（G+）和革兰氏阴性 （G-）两种类型，细菌对革兰氏染色的不同反应是由于它们 细胞壁的成分和结构不同而造成的。 首先利用草酸铵结晶紫初染，所有细菌都会着上结晶紫的蓝 紫色。然后利用卢戈氏碘液作为媒染剂处理，由于碘与结晶 紫形成碘-结晶紫复合物，增强了染料在菌体中的滞留能力。 之后用95%乙醇作为脱色剂进行处理时，两种细菌的脱色效果 不同。
依据材料概括晚清中国交通方式的特点，并分析其成因。
革兰氏染色及镜检操作规范培训
革兰氏染色及镜检操作规范培训一、培训目的革兰氏染色及镜检是微生物学中常用的检测方法，用于鉴定细菌的形态、结构、分布和染色性质等特征，是临床微生物检验中重要的工作之一、本次培训旨在加强操作规范意识，提高操作技能，确保准确、可靠地进行革兰氏染色及镜检。
二、培训内容及步骤1.革兰氏染色操作规范（1）准备培养基和试验用具，并消毒。
（2）取一根无菌的一次性培养皿棒，取少量细菌涂抹于玻片上。
（3）让涂抹的细菌悬于玻片上风干。
（4）用火钳夹取镊，将玻片迅速通过火焰杀菌一次。
（5）将玻片放置在玛丽兰染色架上，添满紫水，静置1分钟。
（6）将玻片倾倒，冲洗干净。
（7）加碘定色，静置1分钟。
（8）将玻片倾倒，冲洗干净。
（9）滴加酒精洗脱剂，静置1分钟。
（10）将玻片倾倒，冲洗干净。
（11）用吸水纸吸干水分。
（12）将玻片放在显微镜玻璃片上，加一滴油，镜检。
（13）观察细菌形态、结构和染色性质，并进行记录。
2.革兰氏染色注意事项（1）玻片的制备过程要保持无菌操作，避免细菌交叉感染。
（2）玻片烘干后才能进行染色，否则会影响染色效果。
（3）每一步的时间控制要准确，过长或过短都会影响染色效果。
（4）注意使用染色剂的浓度和时间，过浓或过淡都会影响染色效果。
（5）冲洗时要充分冲洗，以保证染色结构的清晰度。
（6）显微镜的调整要适当，以获得清晰的镜检结果。
（7）操作过程中要注意安全，避免受伤或发生意外事故。
三、培训效果评估在培训结束后，进行实际操作，检测并评估参训人员的操作能力和操作规范性。
培训效果评估主要从以下几个方面进行评估：1.操作准确性：参训人员能否正确完成革兰氏染色的每一步操作。
2.操作规范性：参训人员是否按照操作规范进行染色操作，是否注意操作的细节。
3.观察记录准确性：参训人员是否能准确观察、记录细菌形态、结构和染色性质等结果。
4.安全意识：参训人员在操作过程中是否注意安全，是否进行事故防范措施。
四、培训总结革兰氏染色及镜检是临床微生物检验中常用的方法，掌握其操作规范意义重大。
革兰氏染色 ppt课件
许多g细菌对高等生物有致病性是由lps的成分决定的它的毒性组分常称为内毒素细菌外毒素与内毒素的区别外毒素exotoxin内毒素endotoxin产生菌多数革兰氏阳性菌少数革兰氏阴性菌多数革兰氏阴性菌少数革兰氏阳性如苏云金芽孢杆菌存在部位多数活菌分泌出少数菌裂解后释出细胞壁组分菌裂解后释出化学成份蛋白质脂多糖稳定性60半小时被破坏16024小时被破坏毒性作用强较弱毒性反应对组织细胞有选择性毒害效应引起特殊临床表现各菌的毒性效应相似引起发热白细胞增多微循环障碍休克等免疫原性强刺激宿主产生抗毒素弱甲醛液处理脱毒成类毒素不形成类毒素27实验原理
ppt课件 11
2.5固定的目的 ① 杀死微生物，固定其细胞结 构； ② 保证菌体能牢固地粘附在载 玻片上，以免水洗时被水冲掉； ③ 改变菌体对染料的通透性， 一般死细胞原生质容易着色。
ppt课件
12
2.6实验现象：
染色后菌体呈蓝紫色的，称为“革兰阳 性菌”；菌体是伊红色，称“革兰阴性 菌”。无论阳性菌还是阴性菌，都有杆 菌和球菌。葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿 假单胞菌是临床最为常见的病原菌。葡 萄球菌属于革兰阳性菌，大肠杆菌属于 革兰阴性菌。除大肠杆菌以外，临床较 常见的肠杆菌科细菌还有变形杆菌属， 沙门菌属、克霉白菌属；铜绿假单胞菌 是临床常见的较耐药革兰阴性杆菌。
ppt课件 16
细菌结构模式图
ppt课件
17
2.7实验原理：
① G+细菌的细胞壁
G+细菌细胞壁具有较厚（20-80nm）而致密的肽聚糖层， 多达20层，占细胞壁成分的60%～90%，它同细胞膜的外层 紧密相连 ；有的G+细菌细胞壁中含有磷壁酸。细胞生长中 有自溶素（酶类）起作用，磷壁酸对自溶素有调节功能， 阻止胞壁过度降解和壁溶。如果细胞壁的肽聚糖层被消溶， G+细胞成为原生质体（protoplasts），细胞壁不复存在， 而只存留细胞膜。除链球菌外，大多数G+细菌细胞壁中含 极少蛋白质。
ppt课件 11
2.5固定的目的 ① 杀死微生物，固定其细胞结 构； ② 保证菌体能牢固地粘附在载 玻片上，以免水洗时被水冲掉； ③ 改变菌体对染料的通透性， 一般死细胞原生质容易着色。
ppt课件
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2.6实验现象：
染色后菌体呈蓝紫色的，称为“革兰阳 性菌”；菌体是伊红色，称“革兰阴性 菌”。无论阳性菌还是阴性菌，都有杆 菌和球菌。葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿 假单胞菌是临床最为常见的病原菌。葡 萄球菌属于革兰阳性菌，大肠杆菌属于 革兰阴性菌。除大肠杆菌以外，临床较 常见的肠杆菌科细菌还有变形杆菌属， 沙门菌属、克霉白菌属；铜绿假单胞菌 是临床常见的较耐药革兰阴性杆菌。
ppt课件 16
细菌结构模式图
ppt课件
17
2.7实验原理：
① G+细菌的细胞壁
G+细菌细胞壁具有较厚（20-80nm）而致密的肽聚糖层， 多达20层，占细胞壁成分的60%～90%，它同细胞膜的外层 紧密相连 ；有的G+细菌细胞壁中含有磷壁酸。细胞生长中 有自溶素（酶类）起作用，磷壁酸对自溶素有调节功能， 阻止胞壁过度降解和壁溶。如果细胞壁的肽聚糖层被消溶， G+细胞成为原生质体（protoplasts），细胞壁不复存在， 而只存留细胞膜。除链球菌外，大多数G+细菌细胞壁中含 极少蛋白质。
实验4细菌革兰氏染色法 ppt课件
10 Central Laboratory of Biology
【方法步骤】
4）复染：将玻片上残留水用吸水纸吸去，用番红复染液染色 2min，水洗，吸去残水晾干（图4-1）。 3.镜检：干燥后，油镜观察。以分散开的细菌颜色为准，革兰 氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。 4.混合制片观察：一载玻片上两种菌混合制片，对比观察。菌 龄和脱色程度对染色结果影响较大。
2020/12/12 College of Life Sciences, Hubei Normal University
6 Central Laboratory of Biology
【基本原理】
革兰氏阳性细菌细胞壁肽聚糖含量高，壁厚且脂质含量低， 肽聚糖本身并不结合染料，但其所具有的网孔结构可以滞留碘结晶紫复合物，现在一般认为乙醇处理可以使肽聚糖网孔收缩 而使碘-结晶紫复合物滞留在细胞壁，菌体保持原有的蓝紫色。 而革兰氏阴性细菌细胞壁肽聚糖含量低，交联度低，壁薄且 脂质含量高，乙醇处理时脂质溶解，细胞壁通透性增加，原先 滞留在细胞壁中的碘-结晶紫复合物容易被洗脱下来，菌体变为 无色，用复染剂（如番红）染色后又变为复染剂颜色（红）。
用。
2020/12/12 College of Life Sciences, Hubei Normal University
5 Central Laboratory of Biology
【基本原理】
2. 革兰氏染色 革兰氏染色法可将细菌分成革兰氏阳性（G+）和革兰氏阴性 （G-）两种类型，细菌对革兰氏染色的不同反应是由于它们 细胞壁的成分和结构不同而造成的。 首先利用草酸铵结晶紫初染，所有细菌都会着上结晶紫的蓝 紫色。然后利用卢戈氏碘液作为媒染剂处理，由于碘与结晶 紫形成碘-结晶紫复合物，增强了染料在菌体中的滞留能力。 之后用95%乙醇作为脱色剂进行处理时，两种细菌的脱色效果 不同。
革兰氏染色及镜检操作规范培训
第8页，共29页。
▪ G-菌因其细胞壁薄，外膜层类脂含量高，肽聚糖层薄且交联 程度低（松疏），经酒精脱色后，以类脂为主的外膜迅速溶 解，这时薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘的复合物 的溶出，因此细胞退成无色，再经沙黄等红色染料复染，就 使G-菌呈红色。
第9页，共29页。
三、仪器设备、试剂
▪ 生物显微镜 ▪ 载玻片 ▪ 草酸铵结晶紫染色液 ▪ 革兰氏碘液 ▪ 沙黄复染液或番红染色液 ▪ 95%乙醇
第24页，共29页。
革兰氏染色的大肠杆菌
革兰氏染色的金黄色葡 萄球菌和大肠杆菌
第25页，共29页。
革兰染色的伤寒沙门菌
革兰染色的福氏志贺菌
第26页，共29页。
七、革兰氏染色注意事项
▪ 标本涂片不能太厚，若涂片较厚，应延长脱 色时间，直至不在出现紫色为止。
▪ 染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后， 应吸去玻片上的残水。
2、自然干燥
▪ 涂片最好在室温下使其自然干燥。 ▪ 有时为了使之干得更快些，可将标本面向上，手持载玻片一
端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发， 但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。
第16页，共29页。
3、固定
▪ 标本干燥后即进行固定，固定的目的： ▪ １）杀死微生物，固定细胞结构。 ▪ ２）保证菌体能更牢的粘附在载玻片上，防止标本被水冲
再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘全溶后， 加够蒸馏水即可。
第12页，共29页。
5.3番红复染液配制
▪ 番红2.5g， 95%乙醇100mL ▪ 取上述配好的番红乙醇溶液10mL与80mL蒸
馏水混匀既成。
第13页，共29页。
四、操作方法
▪ 1、制片
▪ 在干净的载玻片上滴上一滴蒸馏水。 ▪ 用接种环进行无菌操作，挑取培养物少许，置载玻
▪ G-菌因其细胞壁薄，外膜层类脂含量高，肽聚糖层薄且交联 程度低（松疏），经酒精脱色后，以类脂为主的外膜迅速溶 解，这时薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘的复合物 的溶出，因此细胞退成无色，再经沙黄等红色染料复染，就 使G-菌呈红色。
第9页，共29页。
三、仪器设备、试剂
▪ 生物显微镜 ▪ 载玻片 ▪ 草酸铵结晶紫染色液 ▪ 革兰氏碘液 ▪ 沙黄复染液或番红染色液 ▪ 95%乙醇
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革兰氏染色的大肠杆菌
革兰氏染色的金黄色葡 萄球菌和大肠杆菌
第25页，共29页。
革兰染色的伤寒沙门菌
革兰染色的福氏志贺菌
第26页，共29页。
七、革兰氏染色注意事项
▪ 标本涂片不能太厚，若涂片较厚，应延长脱 色时间，直至不在出现紫色为止。
▪ 染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后， 应吸去玻片上的残水。
2、自然干燥
▪ 涂片最好在室温下使其自然干燥。 ▪ 有时为了使之干得更快些，可将标本面向上，手持载玻片一
端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发， 但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。
第16页，共29页。
3、固定
▪ 标本干燥后即进行固定，固定的目的： ▪ １）杀死微生物，固定细胞结构。 ▪ ２）保证菌体能更牢的粘附在载玻片上，防止标本被水冲
再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘全溶后， 加够蒸馏水即可。
第12页，共29页。
5.3番红复染液配制
▪ 番红2.5g， 95%乙醇100mL ▪ 取上述配好的番红乙醇溶液10mL与80mL蒸
馏水混匀既成。
第13页，共29页。
四、操作方法
▪ 1、制片
▪ 在干净的载玻片上滴上一滴蒸馏水。 ▪ 用接种环进行无菌操作，挑取培养物少许，置载玻
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▪ 标本干燥后即进行固定，固定的目的： ▪ １）杀死微生物，固定细胞结构。 ▪ ２）保证菌体能更牢的粘附在载玻片上，防止标本
被水冲洗掉。 ▪ ３）改变染料对细胞的通透性，因为死的原生质比
活的原生质易于染色。
▪ 手执载玻片的一端（涂有标本的远端），标本向上。 ▪ 在酒精灯外焰尽快的来回通过3—4次，共约2—3秒
▪ 革兰氏染色成败的关键是脱色时间。如脱色过 度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌； 如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革 兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及 乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定， 需要多加练习。
八、革兰氏染色小结 革兰氏染色法.swf
知识回顾 Knowledge Review
革兰氏染色及镜检 操作规范培训
质量管理部
目录
▪ 一、革兰氏染色法 ▪ 二、革兰氏染色原理 ▪ 三、仪器设备、试剂 ▪ 四、操作方法 ▪ 五、镜检及结果判定 ▪ 六、革兰氏染色图片 ▪ 七、革兰氏染色注意事项 ▪ 八、革兰氏染色小结
一、革兰氏染色法
▪ 革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴 别染色法，1884年由丹麦医师Gram创立。
5、革兰氏染色液配制 ▪ 5.1草酸铵结晶紫染液
▪ A液：结晶紫2g ，95%乙醇20mL。 ▪ B液：草酸铵0.8g， 蒸馏水80mL ▪ 混合A液及B液，静置48h后使用。
5.2碘液配制
▪ 碘片1g， 碘化钾2g ，蒸馏水300mL ▪ 配制方法：先将碘化钾溶解在少量水中，
再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘全溶 后，加够蒸馏水即可。
7、复染
▪ 蕃红染色液（稀）（或沙黄）复染液染1分 钟后，用蒸馏水冲洗，并自然干燥。
▪ 镜检。
五、镜检及结果判定
▪ 接通显微镜的电源，调节光线的强度。 ▪ 将载玻片放在载物台上，调节镜头至油镜镜头处，
调节粗准焦螺旋和细准焦螺旋至清晰为止。 ▪ 观察菌落形态及菌体的颜色。 ▪ 革兰氏阳性菌染色呈紫色，革兰氏阴性菌染色呈
G-细菌 可经脱色而复染成红色
薄，一般单层 无 有 有 高
基体上着生4个环 以内毒素为主 弱
阳性菌 阴性菌
二、革兰氏染色原理
▪ G+菌由于其细胞壁较厚，肽聚糖网层次多且交联程度 大，故经酒精脱色，失水而使网孔缩小，再加上它不 含类脂，故酒精处理，能把结晶紫和碘的复合物牢牢 留在壁内，使其保持紫色。
▪ G-菌因其细胞壁薄，外膜层类脂含量高，肽聚糖层薄 且交联程度低（松疏），经酒精脱色后，以类脂为主 的外膜迅速溶解，这时薄而松散的肽聚糖网不能阻挡 结晶紫与碘的复合物的溶出，因此细胞退成无色，再 经沙黄等红色染料复染，就使G-菌呈红色。
Hale Waihona Puke 三、仪器设备、试剂▪ 生物显微镜 ▪ 载玻片 ▪ 草酸铵结晶紫染色液 ▪ 革兰氏碘液 ▪ 沙黄复染液或番红染色液 ▪ 95%乙醇
5.3番红复染液配制
▪ 番红2.5g， 95%乙醇100mL ▪ 取上述配好的番红乙醇溶液10mL与80mL
蒸馏水混匀既成。
四、操作方法
▪ 1、制片 ▪ 在干净的载玻片上滴上一滴蒸馏水。 ▪ 用接种环进行无菌操作，挑取培养物少许，置载
玻片的水滴中，与水混合做成悬液并涂成直径约1 厘米的薄层。
▪ 为避免因菌数过多聚成团，不利观察个体形态， 可在载玻片之一侧再加一滴水，从已涂布的菌液 中再取一环于此水滴中进行稀释，涂布成薄层。
红色。
六、革兰氏染色图片
革兰氏染色的大肠杆菌
革兰氏染色的金黄色 葡萄球菌和大肠杆菌
革兰染色的伤寒沙门菌
革兰染色的福氏志贺菌
七、革兰氏染色注意事项
▪ 标本涂片不能太厚，若涂片较厚，应延长脱 色时间，直至不在出现紫色为止。
▪ 染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后， 应吸去玻片上的残水。
▪ 选用培养物时，G+菌培养12h-16h， G-培 养24h。菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常 使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。
祝您成功！
▪ 弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽胞杆菌 都呈现阴性反应。
G+和G-生物学特性的差异
比较项目 革兰氏染色反应
肽聚糖 磷壁酸 外膜 脂多糖（LPS） 类脂和脂蛋白含量 鞭毛结构 产毒素 对机械力的抗性
G+细菌 能阻留结晶紫而染成紫色
厚，层次多 多数含有
无 无 低（仅抗酸性细菌含有类 脂） 基体上着生2个环 以外毒素为主 强
钟，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫 为宜（不超过60℃）, 放置待冷后，进行染色。
4、初染
▪ 滴草酸铵结晶紫染1分钟 ▪ 蒸馏水冲洗。
5、媒染
▪ 加革兰氏碘液染1分钟 ▪ 蒸馏水冲洗，用吸水纸吸去水分。
6、脱色
▪ 加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色， 30秒后立即用蒸馏水冲洗。
▪ 用吸水纸吸去水分。
▪ 若材料为液体培养物或固体培养物冲洗下制备的 菌液，则直接涂布于载玻片上即可
2、自然干燥
▪ 涂片最好在室温下使其自然干燥。 ▪ 有时为了使之干得更快些，可将标本面向上，手持
载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加 热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长， 以防标本烤枯而变形。
3、固定
▪ 细菌先经碱性染料结晶染色，而经碘液媒染 后，用酒精脱色，革兰氏阳性菌（G+）不 被脱去，革兰氏阴性菌（G-）可被脱去。为 观察方便，脱色后再用一种红色染料如碱性 蕃红等进行复染。阳性菌仍带紫色，阴性菌 则被染上红色。
▪ 有芽胞的杆菌和绝大多数的球菌，以及所有 的放线菌和真菌都呈革兰氏阳性反应；
被水冲洗掉。 ▪ ３）改变染料对细胞的通透性，因为死的原生质比
活的原生质易于染色。
▪ 手执载玻片的一端（涂有标本的远端），标本向上。 ▪ 在酒精灯外焰尽快的来回通过3—4次，共约2—3秒
▪ 革兰氏染色成败的关键是脱色时间。如脱色过 度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌； 如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革 兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及 乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定， 需要多加练习。
八、革兰氏染色小结 革兰氏染色法.swf
知识回顾 Knowledge Review
革兰氏染色及镜检 操作规范培训
质量管理部
目录
▪ 一、革兰氏染色法 ▪ 二、革兰氏染色原理 ▪ 三、仪器设备、试剂 ▪ 四、操作方法 ▪ 五、镜检及结果判定 ▪ 六、革兰氏染色图片 ▪ 七、革兰氏染色注意事项 ▪ 八、革兰氏染色小结
一、革兰氏染色法
▪ 革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴 别染色法，1884年由丹麦医师Gram创立。
5、革兰氏染色液配制 ▪ 5.1草酸铵结晶紫染液
▪ A液：结晶紫2g ，95%乙醇20mL。 ▪ B液：草酸铵0.8g， 蒸馏水80mL ▪ 混合A液及B液，静置48h后使用。
5.2碘液配制
▪ 碘片1g， 碘化钾2g ，蒸馏水300mL ▪ 配制方法：先将碘化钾溶解在少量水中，
再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘全溶 后，加够蒸馏水即可。
7、复染
▪ 蕃红染色液（稀）（或沙黄）复染液染1分 钟后，用蒸馏水冲洗，并自然干燥。
▪ 镜检。
五、镜检及结果判定
▪ 接通显微镜的电源，调节光线的强度。 ▪ 将载玻片放在载物台上，调节镜头至油镜镜头处，
调节粗准焦螺旋和细准焦螺旋至清晰为止。 ▪ 观察菌落形态及菌体的颜色。 ▪ 革兰氏阳性菌染色呈紫色，革兰氏阴性菌染色呈
G-细菌 可经脱色而复染成红色
薄，一般单层 无 有 有 高
基体上着生4个环 以内毒素为主 弱
阳性菌 阴性菌
二、革兰氏染色原理
▪ G+菌由于其细胞壁较厚，肽聚糖网层次多且交联程度 大，故经酒精脱色，失水而使网孔缩小，再加上它不 含类脂，故酒精处理，能把结晶紫和碘的复合物牢牢 留在壁内，使其保持紫色。
▪ G-菌因其细胞壁薄，外膜层类脂含量高，肽聚糖层薄 且交联程度低（松疏），经酒精脱色后，以类脂为主 的外膜迅速溶解，这时薄而松散的肽聚糖网不能阻挡 结晶紫与碘的复合物的溶出，因此细胞退成无色，再 经沙黄等红色染料复染，就使G-菌呈红色。
Hale Waihona Puke 三、仪器设备、试剂▪ 生物显微镜 ▪ 载玻片 ▪ 草酸铵结晶紫染色液 ▪ 革兰氏碘液 ▪ 沙黄复染液或番红染色液 ▪ 95%乙醇
5.3番红复染液配制
▪ 番红2.5g， 95%乙醇100mL ▪ 取上述配好的番红乙醇溶液10mL与80mL
蒸馏水混匀既成。
四、操作方法
▪ 1、制片 ▪ 在干净的载玻片上滴上一滴蒸馏水。 ▪ 用接种环进行无菌操作，挑取培养物少许，置载
玻片的水滴中，与水混合做成悬液并涂成直径约1 厘米的薄层。
▪ 为避免因菌数过多聚成团，不利观察个体形态， 可在载玻片之一侧再加一滴水，从已涂布的菌液 中再取一环于此水滴中进行稀释，涂布成薄层。
红色。
六、革兰氏染色图片
革兰氏染色的大肠杆菌
革兰氏染色的金黄色 葡萄球菌和大肠杆菌
革兰染色的伤寒沙门菌
革兰染色的福氏志贺菌
七、革兰氏染色注意事项
▪ 标本涂片不能太厚，若涂片较厚，应延长脱 色时间，直至不在出现紫色为止。
▪ 染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后， 应吸去玻片上的残水。
▪ 选用培养物时，G+菌培养12h-16h， G-培 养24h。菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常 使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。
祝您成功！
▪ 弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽胞杆菌 都呈现阴性反应。
G+和G-生物学特性的差异
比较项目 革兰氏染色反应
肽聚糖 磷壁酸 外膜 脂多糖（LPS） 类脂和脂蛋白含量 鞭毛结构 产毒素 对机械力的抗性
G+细菌 能阻留结晶紫而染成紫色
厚，层次多 多数含有
无 无 低（仅抗酸性细菌含有类 脂） 基体上着生2个环 以外毒素为主 强
钟，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫 为宜（不超过60℃）, 放置待冷后，进行染色。
4、初染
▪ 滴草酸铵结晶紫染1分钟 ▪ 蒸馏水冲洗。
5、媒染
▪ 加革兰氏碘液染1分钟 ▪ 蒸馏水冲洗，用吸水纸吸去水分。
6、脱色
▪ 加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色， 30秒后立即用蒸馏水冲洗。
▪ 用吸水纸吸去水分。
▪ 若材料为液体培养物或固体培养物冲洗下制备的 菌液，则直接涂布于载玻片上即可
2、自然干燥
▪ 涂片最好在室温下使其自然干燥。 ▪ 有时为了使之干得更快些，可将标本面向上，手持
载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加 热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长， 以防标本烤枯而变形。
3、固定
▪ 细菌先经碱性染料结晶染色，而经碘液媒染 后，用酒精脱色，革兰氏阳性菌（G+）不 被脱去，革兰氏阴性菌（G-）可被脱去。为 观察方便，脱色后再用一种红色染料如碱性 蕃红等进行复染。阳性菌仍带紫色，阴性菌 则被染上红色。
▪ 有芽胞的杆菌和绝大多数的球菌，以及所有 的放线菌和真菌都呈革兰氏阳性反应；