双向电泳技术
《双向电泳技术》课件
高通量
该技术可以同时分离大量蛋白质，提高了实 验的通量。
高稳定性
该技术具有较高的稳定性，实验结果重复性 好。
缺点
实验周期长
双向电泳技术的实验周期较长 ，需要耗费较多的时间和人力
。
对样品要求高
该技术需要大量的起始样品， 并且对样品的纯度要求较高。
对实验条件要求严格
双向电泳技术的实验条件较为 苛刻，需要精确控制实验参数 。
在药物研发中的应用
总结词
双向电泳技术为药物研发提供了高通量和高效率的蛋白质分离手段，有助于发现潜在的药物靶点和筛 选候选药物。
详细描述
在药物研发过程中，双向电泳技术可用于分析药物对蛋白质表达谱的影响，从而发现药物作用的靶点 。此外，通过比较不同物种或组织的蛋白质表达谱，可以发现潜在的药物靶点，为新药研发提供思路 和候选药物。
应用领域的拓展
疾病诊断与治疗
利用双向电泳技术分析疾病相关蛋白质，为疾病诊断 和治疗提供依据。
药物研发
通过双向电泳技术筛选药物作用靶点，加速新药研发 进程。
生物工程与农业
在生物工程和农业领域中应用双向电泳技术，优化生 物过程和育种。
未来发展方向与挑战
标准化与规范化
建立双向电泳技术的标准化操作流程和质量控制体系，提高实验 结果的可靠性和可比性。
CHAPTER 02
双向电泳技术的实验流程
样本制备
01
02
03
样本选择与处理
选择适当的组织或细胞样 本，进行适当的处理以提 取蛋白质。
蛋白提取
使用适当的缓冲液和试剂 ，从样本中提取蛋白质。
蛋白定量
使用蛋白质定量方法，确 定蛋白质的浓度。
蛋白质提取
溶解蛋白质
蛋白质双向电泳简介
胶条平衡
在第二向SDS-PAGE分离前,必须要平衡IEF 胶。主要目的是用含有SDS的第二向介质 置换含有尿素的第一向介质,使分离蛋白质 与SDS能完全结合,保持蛋白质的巯基呈还 原状态,避免发生重氧化,确保在SDS-PAGE 过程中正常迁移。聚焦后的蛋白质在IEF胶 内处于其等电点处,净电荷为零,若未进行平 衡过程而直接进入第二向的SDS-PAGE分 离,蛋白质仍滞留在IEF胶中不能在第二向凝 胶中正常迁移。胶条平衡包括两个简短的 步骤,每步10~15 min。
复杂度较高的样品，为了尽可能的了解所包含的每种蛋白，需要反复实验才能完 成。如果将待检样品被富集以后则更易分析。
IPG胶条的pH范围
预试验确定 先宽后窄 先线性后非线性 先短后长
等电聚焦
胶条水合完成后,将开始运行等电聚焦。首先 在胶条两端接触电极处垫上水饱和的纸芯,以 防在高电压下胶条与电极的直接接触,损坏胶 条,同时可以吸附聚焦过程中迁移至两端的盐 离子。等电聚焦最好在高压电源下运行,在IPG 胶条的限制电流范围内迅速将电压升至最后的 目标电压。电压(V)与时间(h)的整合被称为伏 特小时(Vh),可以作为一个相同样品在不同运行 时间比较重现性的参数,也可以作为聚焦是否 充分的指标
增加样品溶解性的手段
变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展， 将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。其 典型代表是尿素和硫尿。
表面活性剂：经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后， 还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。常用的表面 活性剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂Triton X-100和 NP-40、两性离子去污剂CHAPS、OBG等。其中CHAPS 和SB3-10最好。
双向电泳操作技术
附：双向电泳完整的操作步骤（一）第一向等电聚焦1. 从冰箱中取-20℃冷冻保存的水化上样缓冲液（I）（不含DTT，不含Bio-Lyte）一小管（1ml/管），置室温溶解。
2. 在小管中加入0.01g DTT，Bio-Lyte 4-6、5-7各2.5ml，充分混匀。
3. 从小管中取出400ml水化上样缓冲液，加入100ml样品，充分混匀。
4. 从冰箱中取-20℃冷冻保存的IPG预制胶条（17cm pH 4-7），室温中放置10分钟。
5. 沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。
在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。
注意：不要产生气泡。
否则影响到胶条中蛋白质的分布。
6. 当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后，用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层。
7. 分清胶条的正负极，轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上，使得胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极。
确保胶条与电极紧密接触。
不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上，因为这些溶液不会被胶条吸收。
同样还要注意不使胶条下面的溶液产生气泡。
如果已经产生气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶到胶条以外。
8. 在每根胶条上覆盖2-3ml矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。
需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。
9. 对好正、负极，盖上盖子。
设置等电聚焦程序。
10.聚焦结束的胶条。
立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳，（二）第二向SDS-PAGE电泳1. 配制15%的丙烯酰胺凝胶。
将溶液分别注入玻璃板夹层中，上部留1cm的空间，用异丙醇封面，保持胶面平整。
聚合30分钟。
一般凝胶与上方液体分层后，表明凝胶已基本聚合。
2. 待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的异丙醇，用MilliQ水冲洗。
4. 配制胶条平衡缓冲液I；配制胶条平衡缓冲液II (上下缓慢摇动溶解)。
双向电泳
双向电泳的应用及研究进展摘要:双向电泳是蛋白质组学研究中最常用的技术,具有简便、快速、高分辨率和重复性等优点。
本文重点介绍了双向电泳的基本原理及其应用。
同时对当前双向电泳技术面临的挑战和发展前景进行了讨论。
关键词: 双向电泳，应用，前景1.1双向电泳技术概述双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE）是蛋白分离的黄金标准，由此可以分析生物样品的显著差别，产生的结果用于诊断疾病、发现新的药物靶标和分析潜在的环境和药物的毒性。
双向电泳分离技术利用复杂蛋白混合物中单个组分的电泳迁移，第一向通过电荷的不同分离，另一向通过质量的不同分离。
双向电泳协同质谱技术是正在出现的蛋白组学领域的中心技术。
双向电泳是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术，其高分辨率、高重复性和兼具微量制备的性能是其他分离方法所无与伦比的。
双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技术以及质谱技术被称为蛋白质组研究的三大基本支撑技术。
可见双向电泳在蛋白质组学研究中的重要性。
就像Fey和Larsen在他们的综述中提到：“尽管人们都想有新技术取代它，可是如果希望对细胞活动有全面的认识，其他技术无法在分辨率和灵敏度上与双向电泳相媲美”。
1.2双向电泳基本原理1975年,意大利生化学家O’Farrell发明了双向电泳技术[1],双向电泳是指利用蛋白质的带电性和分子量大小的差异,通过两次凝胶电泳达到分离蛋白质群的技术。
双向电泳技术依据两个不同的物理化学原理分离蛋白质。
第一向电泳依据蛋白质的等电点不同,通过等电聚焦将带不同净电荷的蛋白质进行分离。
在此基础上进行第二向的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,它依据蛋白质分子量的不同将之分离。
双向电泳所得结果的斑点序列都对应着样品中的单一蛋白。
因此，上千种蛋白质均能被分离开来，并且各种蛋白质的等电点，分子量和含量的信息都能得到。
双向电泳的概念和原理
双向电泳的概念和原理双向电泳是一种应用在生物和化学实验中的分子电泳技术，它能够将完整的分子进行分离，从而实现提取特定的分子组份。
一、双向电泳的概念双向电泳是一种分子技术，它能够将分子分开并且分离出它们内部的活性组分。
利用电泳技术，可以把一些我们有利用价值的分子聚集到集簇中，把其它不要的环境分子分离出去。
通常情况下，电泳是通过具有某种特殊电势的电流来将分子分离的。
由于双向电泳技术，可以利用液相层析原理，将不同的分子聚集到不同的集簇中，从而把其它的不需要的或者有害的分子挤出去。
二、双向电泳的原理双向电泳的原理是利用电流来将分子进行分离，因此在实践过程中，首先需要构建一个体系，在该体系中，利用某种特殊的电流，生成一种能够将分子分解的条件。
首先，将样品加入到某种带有类似电流的环境中，当样品中的分子接触到了这种带有电流的环境，就会形成一种吸引力，从而使分子受到电流的作用，接着分子中的活性组分也会朝着电流的方向而移动。
而由于这种电流的作用，活性组分会被吸引到这种电流的反方向，使得活性组分能够从样品中分离出来，这就是双向电泳的原理。
三、双向电泳的应用双向电泳技术在生物和化学实验中都有广泛的应用，在蛋白质纯化实验、肽段分离实验等实验中，都可以利用双向电泳技术实现分子的精确分离。
此外，双向电泳技术在疾病的早期筛查中也可以发挥着重要的作用，比如癌症的筛查，可以利用双向电泳技术来检测出肿瘤细胞中的活性组分，为早期筛查提供重要的依据。
四、双向电泳的优势双向电泳技术有着诸多优势，首先，双向电泳技术具有准确性高的优势，可以把不同组分的分子成功地分离出来；其次，双向电泳技术操作简单，可以节省大量的实验时间；最后，双向电泳技术可以把活性分子完美的纯净，大大提高了实验的效率。
总之，双向电泳是一种广泛应用的分子技术，它能够把完整的分子进行分离，从而实现提取特定的分子组份。
双向电泳技术实用性强，可以应用在生物和化学试验中，为后续实验提供重要的依据和有效的结果。
蛋白质组学研究介绍结合双向电泳
蛋白质组学研究的主要内容和方法
蛋白质表达分析
研究不同生理或病理条件下蛋白质的表 达水平变化，揭示蛋白质的表达模式和
规律。
蛋白质相互作用研究
利用酵母双杂交、免疫共沉淀等技术 手段，研究蛋白质之的相互作用和
复合物的形成。
蛋白质功能研究
通过基因敲除、基因敲减、定点突变 等技术手段，研究蛋白质的功能和作 用机制。
智能化
结合人工智能和机器学习技术，实现双向电 泳的智能化分析，自动识别和鉴定蛋白质， 提高数据分析的准确性和可靠性。
拓展双向电泳技术的应用领域
临床诊断
01
将双向电泳技术应用于临床诊断，通过对生物标志物的检测和
分析，辅助医生进行疾病诊断和治疗方案的制定。
药物研发
02
利用双向电泳技术筛选和鉴定药物作用靶点，为新药研发提供
蛋白质芯片技术
高通量、快速、简便，但灵敏度和分辨率相对较低，且覆盖的蛋白质数量有限。
双向电泳与蛋白质免疫印迹技术的比较
双向电泳
可以对全蛋白质组进行分离和定性，分 辨率高。
VS
蛋白质免疫印迹技术
可以对特定蛋白质进行检测和定量，灵敏 度高，但只能针对已知的蛋白质进行检测 。
05
双向电泳技术的发展前景 和展望
蛋白质的纯化
通过双向电泳，可以去除样品中的杂 质，提高蛋白质的纯度，从而获得更 准确的鉴定结果。
蛋白质的表达和鉴定
蛋白质表达分析
通过比较不同生理状态或不同组织中 蛋白质的表达模式，可以研究蛋白质 的表达水平，进而了解其在生命活动 中的作用。
蛋白质鉴定
通过与已知蛋白质的数据库进行比对， 可以鉴定出双向电泳图谱中的蛋白质， 为后续的功能研究提供依据。
【最新】电泳分离蛋白质
【最新】电泳分离蛋白质电泳分离蛋白质是一种常用的生物化学技术，它利用蛋白质带电性质和分子大小的差异，将不同蛋白质分离出来。
下面是电泳分离蛋白质的最新技术和应用方面的详细介绍。
一、电泳分离蛋白质的基本原理电泳是在电场作用下，带电粒子在溶液中的迁移运动。
由于蛋白质具有带电性质，因此它们在电场中会发生迁移运动。
不同蛋白质的带电量和分子量不同，因此在电场中的迁移速度也不同。
通过控制电场强度和迁移时间，可以将不同蛋白质分离出来。
二、最新技术进展1.双向电泳（Two-Dimensional Electrophoresis）双向电泳是一种将等电聚焦和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳相结合的电泳技术。
它可以将蛋白质分离成多个斑点，并利用计算机图像处理技术进行定性和定量分析。
双向电泳可以用于比较不同样品之间蛋白质表达谱的变化，以及寻找疾病生物标志物等。
2.全蛋白质组学研究（Proteome Research）全蛋白质组学研究是一种对细胞、组织或生物体中所有蛋白质进行系统研究的学科。
它涉及到蛋白质分离、鉴定、定量和功能分析等方面。
利用双向电泳技术和质谱技术，可以系统地分离和鉴定细胞中的蛋白质，为全蛋白质组学研究提供有力支持。
3.微流控芯片技术（Microfluidic Chip Technology）微流控芯片技术是一种将生化分析过程集成在微米尺度芯片上的技术。
它具有高效、快速、自动化和微型化等优点，可以用于蛋白质分离、鉴定和检测等方面。
利用微流控芯片技术，可以实现在单细胞水平上对蛋白质进行检测和分析，为生命科学和医学研究提供有力支持。
三、应用领域1.疾病诊断与治疗利用电泳分离蛋白质技术，可以分离和鉴定疾病相关蛋白质，为疾病诊断和治疗提供有力支持。
例如，通过比较健康人和患者的血清蛋白谱，可以寻找疾病特异性标志物，为疾病诊断和治疗提供指导。
2.药物筛选与研发利用电泳分离蛋白质技术，可以分离和鉴定药物作用靶点，为药物筛选和研发提供有力支持。
双向电泳技术
变性2D-PAGE：样品先用2%SDS＋5%β-ME＋95℃变性5min，IEF在 8M尿素＋1%NP-40条件下进行，之后胶条用2%SDS＋5%β-ME平衡， 然后进行SDS-PAGE。该技术适于DNA序列和多肽结构的分析，或分 析被碳氢键连接和其它翻译后修饰所引起的多肽结构微异质性，但此 方式显示的大于100Kd的蛋白质点少于第三种方式
13
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丙烯酰胺会产生如下几个化学反应：
•高浓度酸和碱会促进其水解形成丙烯酸和NH3。 •与一些羟基化合物如酚或酯族醇反应，生成β-芳氧基或烷 氧基丙酰胺。 •在20℃能NH3反应，生成β、β′、β″-氮川三丙酰胺。 •与一些硫醇反应，生成β-烷基丙酰胺。 •也会由于超声、γ-射线和自然光线引起聚合作用。如果烃 键靠近在高度聚合的位置，酰胺基也会受到分子间的缩聚 作用而成亚胺桥。
45
IPG胶条的重泡胀
泡胀的实质：是让样品能完全以可溶性的形式进 入IPG内，从而能进行接下来的IEF。
不同的加样方法和加样量会导致最终结果的差异： Protean IEF cell、IPGphor等集成设备的使用： 20mmol/L DTT 垫片的使用： 温度的源自择：46蛋白载样量
影响IPG胶条对蛋白载样量的因素包括： 待分析的蛋白点的量应满足随后的质谱分析。 电泳的目的：如果只是得到一张好的图片，则无需考
双向电泳技术
1、丙烯酰胺凝胶有以下优点：
①几乎无电渗作用。 ②化学性能稳定，与被分离物不起化学反应。对pH和温度 变化较稳定。
双向电泳
另一方面，溶液中的两性电解质又破坏了水的解离平衡：
H2O
H++OH－
使溶液的pH有所改变。当某一两性电解质的pI较低，即释
放质子（ H+ ）能力较强，使溶液 pH 值下降，这类两性电
解质称为酸性两性电解质；而pI高的两性电解质可使溶液
1.2.1组合摸式：双向电泳主要是电荷分离——分子质量分 离的组合摸式。 （ 1 ）第一向为电荷分离：通过聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦 毛细管电泳将样品按蛋白质等电点的差异进行分离。 （ 2 ）第二向为质量分离：通过 SDS— 聚丙稀酰胺凝胶电 泳按相对分子质量大小不同进行分离。
1.2.2分类：双向电泳根据其第一向使用的介质的不同可以
们到达净电荷为零的位置时才停止。
具有最低和最高等电点的分子带电荷最多，泳动速度最快， 所以pI梯度的形成开始在正、负级两端，然后不同pI的载 体两性电解质分子逐渐到达它们自己的等电点位置而形成
一个连续的pI梯度。如图所示。
A
B
C
载体两性电解质在电场中形成pI梯度的模式图
A 原始状态 B pI梯度的形成过程 C连续pI梯度的形成
出的优点。
图 等电聚焦的“聚焦效应”
等电聚焦电泳根据蛋白质等电点不同而将其分离，也可以根据蛋白 条带在pH梯度中形成的位置测定其等电点。
3第二向电泳——SDS电泳的基本原理
3.1蛋白质-SDS复合物
(1)SDS的作用：SDS是一种阴离子去污剂，它在水溶液中
以单体和分子团(micellae)的混合形式存在，作为一种变性
中存在三个物理效应和四个不连续性的分离系统。
3.2.1三个物理效应
双向凝胶电泳的原理
双向凝胶电泳的原理双向凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离技术，其原理基于电泳的原理和凝胶电泳的原理。
电泳原理：电泳是利用物质在电场中的带电性质而产生的运动现象。
在电场中，带电的分子或离子会受到电场力的作用而向相对带电性质相反的极移动。
电泳实验中，通常使用平行的电极极板，形成一个电场，分子或离子会在电场中进行迁移和分离。
凝胶电泳原理：凝胶电泳是在分离过程中使用凝胶作为介质，使得被分离物质在凝胶中进行迁移和分离。
凝胶是具有三维网状结构的聚合物或芯粒，可以提供一定的分子筛效应，使得分子按照大小逐渐沉积。
分子越大，迁移速度越慢，分离效果越好。
双向凝胶电泳原理：双向凝胶电泳是在凝胶电泳的基础上，通过在电泳过程中改变电场方向，实现不同方向上的分离。
通常情况下，第一维电泳是水平电场电泳，第二维电泳是垂直电场电泳。
具体步骤如下：1. 首先，将样品加入到凝胶电泳样品槽内，通常是在蛋白质样品中加入还原剂和样品缓冲液，使其在电泳过程中具有一定的带电性质。
2. 准备两个平行的平板凝胶，其中一个用于第一维电泳，另一个用于第二维电泳。
凝胶通常是聚丙烯酰胺凝胶或聚丙烯酰胺-琼脂糖双层凝胶。
第一维电泳凝胶的方向通常是水平的，第二维电泳凝胶的方向通常时垂直的。
3. 将第一维电泳凝胶浸泡在浸泡液中，然后将电泳样品加入到凝胶中定位。
开启电源，施加电场使样品在凝胶中迁移并分离，直至达到预期的分离效果。
可以根据需要调整电场的强度和时间。
4. 当第一维电泳结束后，将凝胶取出并固定，然后将其放入第二维电泳凝胶中。
将电泳样品加入到第一维凝胶的上方定位。
5. 开启电源，施加电场使样品在第二维凝胶中迁移并分离，直至达到预期的分离效果。
6. 最终，根据分子的大小和电荷，样品中的蛋白质会在凝胶中形成一系列分离带，可以通过染色等方法观察和分析分离结果。
通过双向凝胶电泳，可以实现对复杂混合物中的蛋白质的分离和分析，便于进一步的研究和应用。
2-DE
双向电泳双向电泳（two-dimensional electrophoresis）是等电聚焦电泳和SDS-PAGE 的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照pI分离），然后再进行SDS-PAGE（按照分子大小），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。
蛋白质组研究蛋白质组研究的发展以双向电泳技术作为核心. 双向电泳由O’Farrell’s于1975年首次建立并成功地分离约1 000个E.coli蛋白，并表明蛋白质谱不是稳定的，而是随环境而变化. 双向电泳原理简明，第一向进行等电聚焦，蛋白质沿pH梯度分离，至各自的等电点；随后，再沿垂直的方向进行分子量的分离. 目前，随着技术的飞速发展，已能分离出10 000个斑点(spot). 当双向电泳斑点的全面分析成为现实的时候，蛋白质组的分析变得可行.样品制备(sample prepareation)和溶解同样事关2-DE的成效，目标是尽可能扩大其溶解度和解聚，以提高分辨率. 用化学法和机械裂解法破碎以尽可能溶解和解聚蛋白，两者联合有协同作用. 对IEF(isoelectric focusing)样品的预处理涉及溶解、变性和还原来完全破坏蛋白间的相互作用，并除去如核酸等非蛋白物质. 理想的状态是人们应一步完成蛋白的完全处理. 而离液剂2 mol/L硫脲和表面活性剂4%CHAPS的混合液促使疏水蛋白从IPG(immobilized pH gradients)胶上的转换. 三丁基膦(Tributyl phosphine，TBP )取代β-巯基乙醇或DTT完全溶解链间或链内的二硫键，增强了蛋白的溶解度，并导致转至第二向的增加］. 两者通过不同的方法来增加蛋白的溶解度，作为互补试剂会更有效. 在保持样品的完整性的前提下，可利用超离和核酸内切酶去除核酸(DNA). 除此之外，机械力被用来对蛋白分子解聚，如超声破碎］等. 另外，添加PMSF等蛋白酶抑制剂，可保持蛋白完整性. 由于商品化的IPG胶条是干燥脱水的，可在其水化的过程中加样，覆盖整个IPG胶，避免在样品杯中的沉淀所致的样品丢失］. 此外，低丰度蛋白(low abundance protein)在细胞内可能具有重要的调节功能，代表蛋白质组研究的“冰山之尖”，故分离低丰度蛋白是一种挑战. 亚细胞分级和蛋白质预分级、提高加样量(已达到1～15 mg级的标准)、应用敏感性检测，可以提高其敏感性. 如一种多肽免疫2-DE印迹(MI-2DE)是利用几种单克隆抗体技术来分析和检测. 提高组蛋白和核糖体蛋白等碱性蛋白(basic proteins)的分离是另一难点. 由于碱性pH 范围内凝胶基质的不稳定及逆向电渗流(EOF)的产生，对PI(等电点)超过10的碱性蛋白，通过产生?0～10%?的山梨醇梯度和16%的异丙醇可减少之. 亦可用双甲基丙烯酰胺来增加基质的稳定性.蛋白质组研究蛋白质组研究的发展以双向电泳技术作为核心. 双向电泳由O’Farrell’s于1975年首次建立并成功地分离约1 000个E.coli蛋白，并表明蛋白质谱不是稳定的，而是随环境而变化. 双向电泳原理简明，第一向进行等电聚焦，蛋白质沿pH梯度分离，至各自的等电点；随后，再沿垂直的方向进行分子量的分离. 目前，随着技术的飞速发展，已能分离出10 000个斑点(spot). 当双向电泳斑点的全面分析成为现实的时候，蛋白质组的分析变得可行.样品制备(sample prepareation)和溶解同样事关2-DE的成效，目标是尽可能扩大其溶解度和解聚，以提高分辨率. 用化学法和机械裂解法破碎以尽可能溶解和解聚蛋白，两者联合有协同作用. 对IEF(isoelectric focusing)样品的预处理涉及溶解、变性和还原来完全破坏蛋白间的相互作用，并除去如核酸等非蛋白物质. 理想的状态是人们应一步完成蛋白的完全处理. 而离液剂2 mol/L硫脲和表面活性剂4%CHAPS的混合液促使疏水蛋白从IPG(immobilized pH gradients)胶上的转换. 三丁基膦(Tributyl phosphine，TBP )取代β-巯基乙醇或DTT完全溶解链间或链内的二硫键，增强了蛋白的溶解度，并导致转至第二向的增加］. 两者通过不同的方法来增加蛋白的溶解度，作为互补试剂会更有效. 在保持样品的完整性的前提下，可利用超离和核酸内切酶去除核酸(DNA). 除此之外，机械力被用来对蛋白分子解聚，如超声破碎］等. 另外，添加PMSF等蛋白酶抑制剂，可保持蛋白完整性. 由于商品化的IPG胶条是干燥脱水的，可在其水化的过程中加样，覆盖整个IPG胶，避免在样品杯中的沉淀所致的样品丢失］. 此外，低丰度蛋白(low abundance protein)在细胞内可能具有重要的调节功能，代表蛋白质组研究的“冰山之尖”，故分离低丰度蛋白是一种挑战. 亚细胞分级和蛋白质预分级、提高加样量(已达到1～15 mg级的标准)、应用敏感性检测，可以提高其敏感性. 如一种多肽免疫2-DE印迹(MI-2DE)是利用几种单克隆抗体技术来分析和检测. 提高组蛋白和核糖体蛋白等碱性蛋白(basic proteins)的分离是另一难点. 由于碱性pH范围内凝胶基质的不稳定及逆向电渗流(EOF)的产生，对PI(等电点)超过10的碱性蛋白，通过产生?0～10%?的山梨醇梯度和16%的异丙醇可减少之. 亦可用双甲基丙烯酰胺来增加基质的稳定性.2-DE面临的挑战2-DE面临的挑战是高分辨率和重复性. 高分辨率确保蛋白最大程度的分离，高重复性允许进行凝胶间配比(match). 对2-DE而言，有3种方法分离蛋白：1)ISO-DALT(isoelectric focus)以O’Farrell’s技术为基础. 第一向应用载体两性电解质(carrier ampholyte, CA)，在管胶内建立pH梯度. 随着聚焦时间的延长，pH梯度不稳，易产生阴极漂移. 2) NEPHGE(non-equilibrium pH gradient electrophoresis)用于分离碱性蛋白(pH>7.0). 如果聚焦达到平衡状态，碱性蛋白会离开凝胶基质而丢失. 因此，在等电区域的迁移须在平衡状态之前完成，但很难控制. 3)IPG-DALT 发展于80年代早期. 由于固相pH梯度(Immobilized pH gradient, IPG)的出现解决了pH梯度不稳的问题. IPG通过immobiline共价偶联于丙烯酰胺产生固定的pH梯度，克服了IEF的缺点，从而达到高度的重复性. 目前可以精确制作线性、渐进性和S型曲线，范围或宽或窄的pH梯度. 新的酸性pH 3～5或碱性pH 6～11的IPG凝胶梯度联合商品化的pH 4～7的梯度可对蛋白质形成蛋白质组重叠群(proteomic contigs)从而有效分离.分离后的斑点检测分离后的斑点检测(spot detection)亦很重要. 所采用的检测策略和分离后所采用的方法的相互作用是很重要的. 此外，还需考虑反应的线性、饱和阈/动态范围、敏感性、对细胞蛋白群的全体定量分析的适应性、可行性. 目前，没有一种蛋白染色覆盖广泛的浓度和PI及分离后分析技术. 银染已成为一种检测2-DE的流行方法，可检测少到2～5ng的蛋白，因此较考马斯亮蓝R-250敏感. 多数糖蛋白不能被考马斯亮蓝染色，一些有机染料不适于PVDF膜. 放射性标记不依赖其代谢的活性，并仅适于对合成的蛋白质检测. 另有一种改良的2-DE(差异凝胶电泳)，即应用两种不同的染料荧光标记两个样品，使在同一凝胶上电泳后的凝胶图象为两个，避免了几种2-DE的比较，可在纳克级进行检测.较早期相比，2-DE有两个主要的进步：首先，极高的重复性使有机体的参考图谱，可通过Internet获得，来比较不同组织类型、不同状态的基因表达；其次，高加样量使得2-DE成为一项真正的制备型技术.常见问题及其解答重泡胀后的胶可以不用转移到另一个电泳槽，直接跑2D 的一向吗？一般情况下是可以的。
双向电泳技术研究进展
双向电泳技术研究进展摘要：双向电泳(two dimensional electrophoresis , 2-DE)技术是获得细胞、组织或器官等蛋白表达图谱的主要手段，是蛋白质组学研究的三大核心技术之一。
本文主要从双向电泳技术的发展，主要操作步骤及其面临的主要挑战等方面对改技术的研究进展进行综述。
关键词：双向电泳；研究1.双向电泳技术的发展蛋白质双向电泳源于1975年O,Farrell. Klose.Scheele 对大肠杆菌、老鼠及几尼猪蛋白质的研究。
它首先根据样品中蛋白质等电点不同进行等电聚焦(IEF)作为第l向，然后再按照蛋白质分子量大小不同进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS -PAGE)作为第2向，经染色后可以在凝胶上得到大量的蛋白质点，从而得到样品的蛋白质表达图谱。
根据双向电泳中第l向等电聚焦方法的不同，双向电泳主要分为2个主要类型，ISO-DALT(等电点一道尔顿)IPG．DALT ( 固相pH梯度一道尔顿)双向电泳。
1.1 ISO-DALT双向电泳技术传统的ISO-DALT双向电泳中，首先将载体两性电解质添加在丙烯酰胺凝胶中，凝胶聚合后在电场作用下形成连续的DH值梯度，两性电解质以游离的形式分布于聚丙烯酰胺凝胶的网孔中。
通常采用圆柱状电泳，IEF凝胶制备在圆柱型玻璃管中，可以将样品加在未凝固的凝胶溶液中，也可在凝胶凝固后在玻璃管顶端加样，然后进行等电聚焦，通常在50～100V电压下聚焦1～2 h，让样品进入IEF胶条，然后在200 ～400V或更高电压下进行聚焦，直到电流接近零时为止。
等电聚焦结束后取下凝胶柱，向玻璃管中凝胶与管壁间注水，将凝胶条吹出，用缓冲液平衡凝胶条，主要目的是充分打断多肽链间及多肽链内部的二硫键并使其与SDS充分结合，然后将胶条用琼脂包埋于第2向电泳的凝胶板中，进行第2向SDS-PAGE，SDS-PAGE 可以使用均一的分离胶浓度，也可采用不连续梯度胶或者连续梯度胶。
双向电泳在医学中的应用范围及应用前景
双线电泳技术在医学中的应用范围及应用前景双向电泳是一种平板电泳技术，样品各组分先在第一方向分离(对蛋白质常用等电聚焦法)，然后在与第一方向成90的第二方向作电泳分离(常用聚丙烯酰胺凝胶电泳法)。
是蛋白质组学中的重要研究手段。
双向电泳（two-dimensional electrophoresis）是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照pI分离），然后再进行SDS-PAGE（按照分子大小），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。
蛋白质组研究的发展以双向电泳技术作为核心。
双向电泳由O’Farrell’s于1975年首次建立并成功地分离约1 000个E.coli蛋白，并表明蛋白质谱不是稳定的，而是随环境而变化。
双向电泳原理简明，第一向进行等电聚焦，蛋白质沿pH梯度分离，至各自的等电点；随后，再沿垂直的方向进行分子量的分离。
目前，随着技术的飞速发展，已能分离出10 000个斑点（spot)。
当双向电泳斑点的全面分析成为现实的时候，蛋白质组的分析变得可行。
张永奎在《大蒜素对人骨肉瘤细胞株Saos-2细胞作用效果的蛋白质组学研》中，应用双向电泳和质谱分析技术研究发现，大蒜素可使Saos-2细胞的一些蛋白表达发生显著变化，而这些蛋白在许多细胞生物学进程中发挥重要的作用。
他先从组织或细胞中提取蛋自质，进行双向电泳以实现蛋白质的分离；然后进行蛋白质样品显色，切下待分析的蛋白质斑点，用胰蛋白酶胶内消化；接着，对消化后得到的多肽片段进行生物质谱分析测定，得到肽质量指纹图谱；最后，数据库检索对蛋白质进行鉴定及功能分析。
在肿瘤学中，以肿瘤有关的蛋白质通过此方法得以发现已提取，对肿瘤的发生及其治疗提供了一种可行的方法。
除此，双向电泳样可用于肿瘤耐药性的研究。
朱蓉在《硼替佐米耐药骨髓瘤细胞株的建立及其耐药机制研究》中采用双向电泳及质谱鉴定技术，分析差异蛋白的表达情况。
并选取其中部分差异蛋白，采用western—blot技术进行验证。
双向电泳法
双向电泳法双向电泳法（Bidimensional Electrophoresis，2-DE）是一种常用的蛋白质分离技术，可以同时分析样品中上千种蛋白质。
本文将详细介绍双向电泳法的原理、步骤和应用。
原理双向电泳法结合了等电聚焦（IEF）和SDS-PAGE两种技术，通过两个维度的分离将复杂的蛋白质混合物分解为一系列单独的斑点。
在第一维度中，根据蛋白质的等电点（pI）进行分离；在第二维度中，根据蛋白质的分子量进行分离。
通过将这两个维度的分离结果叠加，可以获得高分辨率的蛋白质图谱。
双向电泳法的关键步骤如下：1.等电聚焦（IEF）：在第一维度中，使用等电聚焦技术将样品中的蛋白质按照其等电点进行分离。
等电聚焦是一种基于蛋白质在电场中向氧化物离子（OH-）或氢离子（H+）方向移动的分离方法。
在等电聚焦过程中，蛋白质会在pH梯度中向其等电点迁移，直到净电荷为零。
通过控制pH梯度和应用的电压，可以将蛋白质在等电聚焦过程中分离开。
2.SDS-PAGE分离：在第二维度中，将第一维度的等电聚焦凝胶与SDS-PAGE凝胶垂直叠加。
在SDS-PAGE凝胶中，蛋白质通过聚丙烯酰胺凝胶的孔隙随着电场的作用向阳极迁移。
由于SDS（十二烷基硫酸钠）的存在，蛋白质在SDS-PAGE凝胶中的迁移速度与其分子量成反比。
因此，蛋白质在SDS-PAGE 凝胶中会根据其分子量进行分离。
3.染色和分析：经过双向电泳分离后，凝胶可以通过染色方法显示出一系列斑点，每个斑点代表一个蛋白质。
常用的染色方法包括银染法、荧光染色、贵金属染色等。
对于银染法，它在灵敏度和线性范围上具有优势。
染色后可以使用成像设备捕捉图像并进行定量分析。
通过对斑点的比较和定量，可以识别不同样品之间的差异和变化。
步骤双向电泳法的步骤如下：1.样品制备：将待分析的生物样品（如细胞提取物）进行蛋白质提取，并使得蛋白质在石蜡中可溶解。
常用的方法包括总蛋白提取、亲和层析、激光捕获等。
2.等电聚焦（IEF）：将蛋白质样品与具有连续pH梯度的凝胶进行接触。
双向电泳操作双向电泳的技术流程和样品制备ppt课件
第三步：用含复合表面活性剂的蛋白溶解液，最后抽 提前两次抽提后不能溶解的膜蛋白约占整个样品的 11%（W/W）。
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
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增加样品溶解性的手段
变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸 展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能 量域。其典型代表是尿素和硫尿。
双向电泳分析中的样品制备
制备原则：
应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括 多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。
防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。 防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰
（如酶性或化学性降解等）。 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证
Amount 4.1ml of 8.5 stock or 2.1g urea in 3ml H2O 760mg
50ul of 200mM TBP stock
200mg See table 10ul of 0.1% stock To 5ml
Multiple surfactant solution preparation 经营者提供商品或者服务有欺诈行为的，应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用
IPG pH Range 3-10 4-7
双向电泳
双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE）是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术，其高分辨率、高重复性和兼具微量制备的性能是其他分离方法所无与伦比的。
双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技术以及质谱技术被称为蛋白质组研究的三大基本支撑技术。
2D 电泳优越性●对未处理样本耐受性好●不需要预纯化(如：色谱层析)●分辨率非常高●2D 可以有效的组分收集器●蛋白在凝胶介质中受到保护●在蛋白质组学技术中应用范围最广（front-end ）●与其他技术相比，在一次试验中可检测到的蛋白点更多●与后续分析技术兼容性好一、基本原理：先将蛋白质根据其等电点在pH梯度胶内（载体两性电解质pH梯度或固相pH 梯度）进行等电聚焦，即按照它们等电点的不同进行分离。
然后按照它们的相对分子质量大小进行SDS-PAGE第二次电泳分离。
样品中的蛋白经过等点电和分子质量的两次分离后，可以得到分子的等电点、分子质量和表达量等信息。
值得注意的是，双向电泳分离的结果使蛋白质点而不是条带。
根据Cartesin坐标系统，从左到右是pI的增加，从下到上是分子质量的增加。
第一向：等电聚焦1．[基本原理]从电泳观点看，蛋白质最主要的特征是它的带电行为。
蛋白质是由20种不同的氨基酸按不同比例通过肽键的连接构成的。
由于蛋白质的一些氨基酸侧链在一定的pH值的溶液中是可解离的，从而带有一定的电荷。
构成蛋白质的所有氨基酸残基上所带正负电荷的总和便是蛋白质所带的净电荷。
蛋白质在不同的pH环境中带不同数量的正电或负电，在低pH时，蛋白质的净电荷是正的，在高pH时，其净电荷是负的，但在某一pH时，它的净电荷为零，此pH即为该蛋白质的等电点（isoelectric pointpI）。
蛋白质的等电点值取决于其氨基酸的组成，是一个物理化学常数。
双向凝胶电泳技术
细胞处理： 对于组织细胞，首先需将其破碎，尽可能地将蛋白质组 分溶解在缓冲液中，以便在适当的电泳条件下分离。 组织细胞破碎的方法包括低渗、匀浆、超声、反复冻融 等。而对于体液成分，如血清、腹水、尿液等，仅需经过 稀释、加热变性、溶解于适当缓冲液便可用于双向电泳。
等电聚焦 等电聚焦是20世纪60年代建立的蛋白质分离技术， 基本原理是利用蛋白质或其它两性分子等电点的不同，在 一个稳定的、连续的pH梯度中进行分离和分析。IEF具有 分辨率高（0.01pH单位）、抵消扩散作用、可使浓度较低 的样品达到高度浓缩等优点，不仅可以用来分离两性大分 子，还可以通过测定等电点来鉴定蛋白质。根据建立pH梯 度的原理不同，可以分为载体两性电解质pH梯度 （Carrier ampholytes pHgradients）和固体pH梯度 （Immobilized pHgradients）。前者是在电场中通过两 性缓冲离子建立pH梯度，后者是将缓冲基团作为凝胶介质 的一部分，分辨率比前者提高一个数量级。根据电泳方式 的不同，IEF可分为管状、薄层、垂直和水平等电聚焦。 聚焦完成后，胶条既可以在中间电压500-1000V下短时 间保持，便于随时进行第二向的平衡，也可以置于-80℃ 冰箱中进行长期保存。
IPG胶条平衡 在第二向SDS-PAGE分离前，必须要平衡IEF胶。主要 目的是用含有SDS的第二向介质置换含有尿素的第一向介 质，使分离蛋白质与SDS能完全结合，保持蛋白质的巯基 呈还原状态，避免发生重氧化，确保在SDS-PAGE过程中正 常迁移。聚焦后的蛋白质在IEF胶内处于其等电点处，净 电荷为零，若未进行平衡过程而直接进入第二向的SDSPAGE分离，蛋白质仍滞留在IEF胶中不能在第二向凝胶中 正常迁移。胶条平衡包括两个简单的步骤，每步10-15分 钟，第一步是将IEF胶在375mmol/L Tris-HCl Ph8.8缓冲 液（含2%SDS、1%DTT或6mol/L尿素和30%甘油）中浸泡1015分钟，尿素和甘油是用于缓冲电渗效应，提高蛋白质从 第一向到第二向的转移率。第二步用5%碘乙酰胺替代还原 剂DTT的375mmol/L Tris-HCl pH8.8缓冲液，其他组分及 相应浓度不变。碘乙酰胺用来烷基化巯基变成羟乙酰半胱 氨酸残基，以便巯基不能重组形成二硫键。此外，碘乙酰 胺还可以烷基化IEF胶内的自由DTT，否则自由DTT在第二 向SDS-PAGE胶迁移，会产生点条纹的假象。为减少酰胺基 组的烷基化，最好在pH8-9之间进行还原和烷基化。
双向电泳和质谱技术
双向电泳和质谱技术双向电泳和质谱技术是生物分析领域中常用的两种先进技术手段，它们在蛋白质分析、基因测序和疾病诊断等方面发挥着重要作用。
本文将重点介绍双向电泳和质谱技术的原理、应用及未来发展趋势。
1. 双向电泳技术双向电泳是一种利用电场在两个方向同时进行电泳分离的方法。
在垂直电泳的基础上，通过在水平方向引入一个交叉的电场，使得分子在两个方向上同时受到电场的作用，从而实现更加细致的分离和分析。
双向电泳技术可以有效地应对复杂样品的分析需求，提高分离效率和分辨率，广泛用于蛋白质组学和基因组学领域。
2. 质谱技术质谱技术是一种通过测定分子的质荷比来识别、定量和分析化合物的方法。
质谱技术主要包括质谱仪器、样品制备和数据分析三个方面。
通过质谱技术可以快速准确地鉴定生物样品中的蛋白质、代谢产物和小分子化合物，为生物医学研究和临床诊断提供重要帮助。
3. 双向电泳和质谱技术的应用双向电泳和质谱技术在生物学研究和医学诊断中有着广泛的应用。
在蛋白质组学研究中，双向电泳可以帮助科学家分析蛋白质的组成和结构，揭示蛋白质的功能与调控机制；而质谱技术则可以通过蛋白质质谱鉴定和定量，解析复杂生物系统中的蛋白质交互作用和信号传导通路。
在疾病诊断中，质谱技术可以通过检测患者生物标志物的质谱图谱，诊断疾病类型和病情进展，为个体化治疗提供指导。
4. 双向电泳和质谱技术的未来发展随着科学技术的不断进步，双向电泳和质谱技术也在不断优化和完善。
双向电泳技术不断提高分离效率和分辨率，以适应更加复杂样品的分析需求；质谱技术在仪器性能、数据处理和生物信息学分析方面得到了进一步提升，为生物学研究和医学诊断带来更多可能性。
未来，双向电泳和质谱技术将继续发展壮大，成为生命科学研究和临床医学应用的重要工具之一。
总结双向电泳和质谱技术作为生物分析领域的重要手段，为生命科学领域的研究和应用提供了有力支持。
通过深入了解双向电泳和质谱技术的原理和应用，我们可以更好地利用这两种技术手段，推动生物学研究的进步和医学诊断的发展。